ИСТИНА

Целью данного проекта является дизайн, синтез и определение антибактериальных свойств ингибиторов трансляции на основе модифицированных антимикробных пептидов. Проектом предусматривается на основе имеющихся знаний о взаимодействии пролин-аргининовых антимикробных пептидов с бактериальными рибосомами создание ингибиторов биосинтеза белка, сочетающих в структуре фрагменты антимикробных пептидов, непротеиногенные аминокислотные остатки и другие химические группировки; изучение комплексов новых соединений с бактериальными рибосомами, а также оценка их антибактериального действия, устойчивости к деградации и токсичности. Модификация антимикробных пептидов может привести к большей стабильности полученных аналогов клетках, к изменению сродства соединений к рибосоме, селективности и специфичности действия на рибосомы и бактериальные штаммы по сравнению с АМП, получению ингибиторов роста резистентных штаммов бактерий. Определение этих свойств в сочетании с данными компьютерного моделирования комплексов ингибиторов с рибосомой, а также структурными данными, позволят сделать выводы о тонких механизмах воздействия ингибиторов на бактериальные рибосомы и процесс трансляции. Полученные результаты могут быть использованы в дальнейшем при создании новых антибиотиков. В проекте предполагается конструирование новых ингибиторов биосинтеза белка бактерий на основе пролин-аргининовых антибактериальных пептидов (бактенецина, онкоцина), способных взаимодействовать с рибосомой в области пептидилтрансферазного центра (ПТЦ) и рибосомного туннеля (РТ), непротеиногенных и модифицированных аминокислот, а также гидрофобных катионов (таких как, берберин, трифенилфосфоний); синтез выбранных соединений; исследование полученных соединений на взаимодействие с бактериальными рибосомами биохимическими методами; определение способности этих соединений ингибировать трансляцию в системах in vitro и in vivo; определение времени жизни новых аналогов АМП в биологических средах; тестирование новых соединений на антибиотическую активность на различных штаммах бактерий и на токсичность в отношении клеток млекопитающих. Предлагаемые в данной работе соединения в литературе не описаны. В результате выполнения проекта планируется получить на основе пролин-аргининовых пептидов антимикробные соединения, более устойчивые к ферментативному протеолизу, чем исходные пептиды, способные действовать в отношении резистентных штаммов бактерий.

The project is aimed at the problem of finding and creating new antimicrobial compounds that can overcome the resistance of bacteria to antibiotics. Antibiotic resistance is one of the most serious threats to human health today. Antimicrobial peptides (AMP) are currently being considered as an alternative to classical antibiotics and the basis for the creation of a new generation of antimicrobial agents. Limitations to the use of AMP are their low in vivo activity associated with the degradation of peptides in cells, as well as their potential toxicity to humans and mammals. The target of most of the known antibiotics is the bacterial ribosome, and bacteria have a variety of mechanisms associated with various modifications of this target, leading to resistance to the action of currently used antibiotics. Relatively recently, it has been discovered that the mechanism of action of some AMP belonging to the class of proline-arginine-rich peptides is associated with the action on the bacterial ribosome, which makes these peptides promising candidates for the development of new antimicrobial agents. The aim of this project is to design, synthesize and determine the antibacterial properties of translation inhibitors based on modified antimicrobial peptides. Based on the existing knowledge about the interaction of proline-arginine-rich antimicrobial peptides with bacterial ribosomes, the project provides for the creation of protein biosynthesis inhibitors combining fragments of antimicrobial peptides, non-proteinogenic amino acid residues and other chemical groups in the structure; the study of complexes of new compounds with bacterial ribosomes, as well as the assessment of their antibacterial action, resistance to degradation and toxicity. Modification of antimicrobial peptides can lead to greater stability of the obtained analogues in cells, to a change in the affinity of compounds to the ribosome, selectivity and specificity of action on ribosomes and bacterial strains compared to AMP, to the production of growth inhibitors of resistant bacterial strains. The determination of these properties in combination with computer simulation data of inhibitor complexes with ribosome, as well as structural data, will allow us to draw conclusions about the subtle mechanisms of inhibitor action on bacterial ribosomes and the translation process. The results obtained can be used in the future when creating new antibiotics. The project assumes the construction of new inhibitors of bacterial protein biosynthesis based on proline-arginine-rich antibacterial peptides (bactenecin, oncocin) capable of interacting with the ribosome in the area of the peptidyltransferase center (PTC) and nascent peptide ribosomal tunnel (NPET), non-proteinogenic and modified amino acids, as well as hydrophobic cations (such as berberine, triphenilphosphonium); synthesis of selected compounds; investigation of the obtained compounds for interaction with bacterial ribosomes by biochemical methods; determination of the ability of these compounds to inhibit translation in in vitro and in vivo systems; determination of the lifetime of new AMP analogues in biological media; testing of new compounds for antibiotic activity on various bacterial strains and for toxicity against mammalian cells. The compounds proposed in this paper are not described in the literature. As a result of the project, it is planned to obtain antimicrobial compounds based on proline-arginine peptides that are more stable to enzymatic proteolysis than the original peptides and capable of acting against resistant bacterial strains.

• На основании доступных данных рентгеноструктурного анализа комплексов онкоцина 112 и бактенецина 7 (1-16) с бактериальными рибосомами будет выполнено компьютерное моделирование трехмерной структуры комплексов фрагментов бактенецина и онкоцина, модифицированных гидрофобными проникающими катионами и непротеиногенными аминокислотами, с рибосомным туннелем и ПТЦ и будут выбраны структуры соединений для синтеза и исследования. • Буде осуществлен синтез производных непротеиногенных аминокислот, необходимых для пептидного синтеза и производных NBD и гидрофобных катионов, необходимых для конъюгации с пептидами. • Будет осуществить синтез пептидных фрагментов выбранной последовательности и длины. • Будут получены производных бактенецина, модифицированнные непротеиногенными амикокислотами (п-нитрофенилаланином и/или PNA-мономерами, нуклеоаминокислотами) • Будут синтезированы производные бактенецина, модифицированнные по N-концу производным NBD и непротеиногенными амикокислотами (п-нитрофенилаланином и/или PNA-мономерами, нуклеоаминокислотами) • Будут определены константы связывания полученных производных с рибосомой методом конкурентного вытеснения флуоресцентно-меченных антибиотиков и пептидов. • Будет определена способность полученных соединений подавлять трансляцию в двойной репортерной системе pDualrep2. • Будет проверено антимикробное действие полученных ингибиторов на различных штаммах, в том числе штаммах, устойчивых к действию хлорамфеникола, макролидов и других антибиотиков.

Настоящий проект предлагается как совместное исследование коллективом сотрудников и студентов кафедры химии природных соединений химического факультета и НИИФХБ МГУ. Коллектив имеет достаточный научный задел для выполнения данного проекта. В группе синтетических исследований хорошо разработан синтез различных природных пептидов и пептидомиметиков. Освоены методы синтеза пептидов на твердой фазе и в растворе, а также методы конъюгации аминокислот, пептидов и других органических соединений с антибиотиками. В коллективе накоплен опыт синтеза, анализа, очистки и биохимических исследований оригинальных соединений, в структуру которых входят гидрофобные проникающие катионы, аклкильные цепи и другие радикалы. Нами разработана и успешно применяется методика для оценки связывания производных антибиотиков и других лигандов в РТ на основе метода поляризации флуоресценции, для этого получен ряд флуоресцентных производных макролидов и пептидов, изучено их связывание с рибосомами E.coli. Коллектив авторов владеет методами исследования антибиотиков и ингибиторов трансляции в различных системах in vitro и in vivo. В коллективе была разработана и используется для высокопроизводительного скрининга веществ на антибиотическую активность двойная репортерная система pDualrep2 на основе двух флуоресцентных белков RFP и Katushka2S, позволяющая определить механизм действия антибиотика: повреждение ДНК или остановка трансляции. Практикуются методы определения способности веществ ингибировать трансляцию in vitro; метод тоепринтинга для определения участка остановки трансляции на мРНК; метод оценки токсичности соединений по МТТ-тесту. В распоряжении коллектива имеется набор устойчивых штаммов для тестирования антибиотической активности.