| Результаты этапа: ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЯ. Все эксперименты проводились при комнатной температуре (20–22 °C). Нервно-мышечные препараты диафрагмы или m. EDL помещали в экспериментальную камеру объемом 3 мл и перфузировали оксигенированным (95% O2, 5% CO2) раствором Лайли (pH 7.2 – 7.4), содержащим (мМ): NaCl– 135, KCl – 4, NaH2PO4 –0.9, CaCl2 – 2, MgCl2 – 1, NaHCO3 – 16.3, глюкоза – 11. Внутриклеточную регистрацию МПКП и вызванных стимуляцией нерва ПКП проводили с помощью стеклянных микроэлектродов, заполненных 2,5 М KCl (сопротивление кончика микроэлектрода составляло 10–20 MОм).
Для анализа параметров спонтанной активности интактных моторных синапсов регистрировали МПКП на протяжении примерно 100 секунд в каждом синапсе. В случае тестирования вызванной активности синапсов (анализа параметров ПКП) мышечные волокна предварительно рассекали, используя стандартный протокол для приготовления т.н. рассеченного нервно-мышечного препарата (Gaydukov et al., 2019; Tarasova et al., 2023). Сразу после поперечного рассечения мышечных волокон нервно-мышечный препарат промывали значительным объемом раствора Лайли (более 150 мл) не менее 1 часа. Затем, в ходе эксперимента двигательный нерв стимулировали короткими залпами сверхпороговых импульсов(50 стимулов длительностью 0,08 – 0,1 мс с частотой 50 Гц). Помимо залпов ПКП, в каждом исследованном синапсе регистрировали МПКП в течение 100 секунд непосредственно перед стимуляцией нерва. Среднее значение амплитуд МПКП, зарегистрированных в этот период, использовали для вычисления квантового состава ПКП. В контроле регистрировали сигналы как минимум от 5 разных синапсов, после чего в перфузионный раствор в определенном порядке добавляли исследуемые вещества, и далее регистрировали активность разных синапсов (как минимум 5) на протяжении 1-2 часов. В каждой серии экспериментов использовали не менее трех нервно-мышечных препаратов.
АНАЛИЗ ДАННЫХ И СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ. Регистрируемые сигналы первично обсчитывали в программе MiniAnalysis (Synaptosoft, США) вручную, без использования встроенных программных фильтров и автоматического анализа данных. Оценивали мембранный потенциал (МП) мышечных волокон, амплитуду и временной ход МПКП и ПКП, при регистрации спонтанной активности оценивали частоту МПКП. Для нивелирования изменения движущей силы сдвига потенциала при изменениях МП стандартизировали амплитуды МПКП и ПКП к мембранному потенциалу -50 мВ в случае регистрации на рассеченном препарате и к -70 мВ при исследовании только спонтанной активности синапсов на интактных нервно-мышечных препаратах. Амплитуду ПКП, отводимых от разных синапсов, нормировали на мембранный потенциал, характерный для рассечённых мышечных волокон (-50 мВ), и корректировали на нелинейную суммацию (Tarasova et al., 2021). Для корректирования амплитуды использовали формулу Акорр = А/[1-(0,8 A/E)], где Акорр – корректированная амплитуда, А – зарегистрированная амплитуда ПКП, E–регистрируемый МП, 0,8 – фактор, зависящий от кабельных свойств мышечных волокон (McLachlan, Martin, 1981). Квантовый состав ПКП рассчитывали как отношение средней стандартизованной и корректированной на нелинейную суммацию амплитуды ПКП к средней стандартизованной амплитуде МПКП.
При статистическом анализе данных оценивали нормальность распределения значений параметров синаптической передачи с помощью теста Д’Агостино-Пирсона. Для оценки МП, амплитуды и частоты МПКП, показателей временного хода постсинаптических потенциалов в случае нормально распределенных величин применяли t-критерий Стьюдента или one way ANOVA, в случае распределения, отличающегося от нормального в одной из выборок - критерий Манна-Уитни. При оценивании кумулятивной вероятности распределения амплитуд МПКП применяли критерий Колмогорова-Смирнова. Для анализа изменений амплитуды и квантового состава ПКП применяли двухфакторный дисперсионный анализ с последующим применением апостериорного критерия Бонферрони.
ВЕСТЕРН БЛОТТ
Для проведения вестерн блотта были подготовлены пробы синаптических и внесинаптических зон диафрагмальной мышцы и m.EDL. Выявление CB1 рецепторов при помощи вестерн блоттинга проводилось в пробах, не обработанных предварительно фармакологически, в то время как установление соотношения фосфорилированной и нефосфорилированный формы MAPK происходило на основе проб, полученных из препаратов, предварительно обработанных 2-арахидоноил глицеролом.
Разделение белковых фракций проводилось при помощи 12% SDS-PAGE, затем белковые пробы переносились на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), используя специальный буфер для переноса (25 mM Tris, 192 mM глицин, pH 8.3, 20% этанол, 0.04% SDS), при 48 В и 4 °C в мини транс-блот системе (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) в течении 120 минут. Мембраны инкубировались сначала с первичными антителами (#AB9415, Chemicon (1:1000), а также антитела #4370 (1:2000) и #4695 (1:1000), Cell signaling)), а затем с вторичными (horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit (1:30,000, #111-035-003, Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA). Сигналы детектировали при помощи Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) и C-DiGit сканера для блотов (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE, USA).
1.3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.3.2.1 ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ МПКП И ПКП В ЗРЕЛЫХ МОТОРНЫХ СИНАПСАХ МЫШИ ПРИ ИНГИБИРОВАНИИ ФЕРМЕНТА ДЕГРАДАЦИИ 2-АГ (MAGL) ДО И ПОСЛЕ БЛОКАДЫ CB1-РЕЦЕПТОРОВ
Ранее нами было установлено, что при экзогенной аппликации 2-арахидноил-глицерола (2-АГ) (1 мкМ) в нервно-мышечных синапсах мыши наблюдается увеличение амплитуды миниатюрных потенциалов концевых пластинок (МПКП), обусловленное усилением накачки ацетилхолина (АХ) в везикулы (Tarasova et al., 2021). При действии 2-АГ увеличивалась также и амплитуда потенциалов концевых пластинок (ПКП) в залпах, вызванных короткой стимуляцией двигательного нерва (50 Гц, 1 сек), при этом квантовый состав ПКП оставался неизменным по сравнению с контролем (Tarasova et al.,2021a).
В препаратах скелетных мышц присутствуют ферменты синтеза и деградации 2-АГ (Crespillo et al., 2011), что указывает на принципиальную возможность его эндогенной выработки в этих структурах. В исследованиях на центральной нервной системе в качестве инструмента для оценки эффектов эндогенно вырабатываемого 2-АГ на параметры синаптической активности используется JZL 184 – ингибитор MAGL (фермента деградации 2-АГ). JZL 184 блокирует деградацию 2-АГ, тем самым способствуя его накоплению в синаптической щели, что может привести к изменениям в работе синапсов (Thomas et al., 2020;Mayeux et al.,2017).
В пилотных сериях экспериментов нами было показано, что JZL 184 (1 мкМ) приводит к увеличению амплитуды ПКП в залпе, вызванном короткой ритмической стимуляцией нерва (50 Гц, 1 сек), по сравнению с контролем, а также к увеличению амплитуды МПКП, при неизменном квантовом составе ПКП. В среднем, амплитуда МПКП в присутствии JZL184 на фоне периодической стимуляции синапсов залповыми разрядами возросла от 1,15 + 0,08 мВ (n=16) в контроле до 1,36+ 0,05 мВ (n=25, p<0,05) под действием JZL184 в сочетании с залповой активностью синапсов (рис . 1А).
Получается, при короткой залповой активности моторных синапсов эндогенная выработка 2-АГ достигает такого уровня, что блокирование деградации этого эндоканнабиноида начинает оказывать влияние на секрецию АХ (причём схожим образом с экзогенной аппликацией 2-АГ).
В работах в рамках данного проекта нам предстояло выяснить, проявится ли потенцирующее действие на вызванную секрецию АХ, наблюдающееся при блокировании MAGL, фермента деградации 2-АГ, при предварительной блокаде CB1-рецепторов. В случае блокирования CB1-рецепторов при помощи АМ 251, как ранее было показано, полностью предотвращался прирост амплитуды МПКП и ПКП на фоне аппликации экзогенного 2-АГ (Tarasova e t al., 2021). Как оказалось, блокирование CB1-рецепторов при помощи АМ 251 (1 мкМ) предотвращает также и увеличение амплитуды МПКП и ПКП в коротких ритмических залпах (50 Гц, 1 сек) на фоне JZL 184 (1 мкМ) (рис. 1B ). Таким образом, можно предположить, что эффекты эндогенного 2-АГ (так же как и экзогенного) осуществляются путем активации пресинаптических СВ1-рецепторов.
1.3.2.2 ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ МПКП И ПКП В НОВООБРАЗОВАННЫХ МОТОРНЫХ СИНАПСАХ M. EDL МЫШИ ПРИ ПОДАВЛЕНИИ В НИХ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА ДЕГРАДАЦИИ 2-АГ (MAGL) ПРИ ПОМОЩИ JZL 184.
В следующих сериях экспериментов исследовали вопрос, существует ли пул эндогенного 2-АГ на ранней стадии реиннервации m. EDL, способный высвобождаться и потенцировать амплитуду МПКП и ПКП и, следовательно, потенцировать передачу не только в интактных, но и в восстанавливающихся после травмы синапсах при их ритмической активности. Аналогично опытам, проведенных на нервно-мышечных препаратах диафрагмы мыши, был проведен анализ изменений параметров МПКП и ПКП под действием JZL184 в новообразованных синапсах m.EDL на 11 сутки после передавливания нерва. Ранее мы показали, что экзогенный 2-АГ (1 мкМ) способен вызывать прирост амплитуды МПКП и ПКП в ходе залповой активности у восстанавливающихся моторных синапсов (на 11сутки после передавливания нерва) (Tarasova et al., 2021)
В настоящем проекте было впервые установлено, что при действии JZL 184 (1 мкМ) в новообразованных синапсах m.EDL при их работе в режиме коротких ритмических залпов (50 Гц, 1 сек) происходит параллельный прирост амплитуды и МПКП, и ПКП, достигавший 20-25% (рис. 2A) (без изменений частоты, временных параметров МПКП, а также квантового состава ПКП).
Далее мы исследовали действие JZL184 на амплитуду МПКП и ПКП на фоне блокирования СВ1-рецепторов при помощи их инверсного агониста АМ 251 и при помощи нейтрального антагониста AM6545. Было установлено, что эффекты JZL184 могут быть полностью предотвращены блокадой СВ1-рецепторов как при помощи АМ 251, так и при действии нейтрального антагониста AM6545 (рис. 2B, 2C). Это означало, что если в новообразованных синапсах m. EDL затормозить деградацию 2-АГ и стимулировать двигательный нерв короткими залпами электрических импульсов (50Гц, 1сек), то и в новообразуемых моторных синапсах можно обнаружить пресинаптическое действие эндогенно вырабатываемого 2-АГ, которое принципиально не отличается от такового у зрелых моторных синапсов: здесь также наблюдается достоверный прироста амплитуды МПКП и ПКП в залпах на фоне JZL 184, которое также зависит от активации СВ1 рецепторов.
1.3.2.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ МПКП И ПКП В ЗРЕЛЫХ МОТОРНЫХ СИНАПСАХ МЫШИ ПРИ ПОДАВЛЕНИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА ДЕГРАДАЦИИ 2-АГ (MAGL) И ПРИ ЭКЗОГЕННОЙ АППЛИКАЦИИ 2-АГ ДО И ПОСЛЕ ИНГИБИРОВАНИЯ МEPK1/2-ERK1/2-СИГНАЛЬНОГО ПУТИ
В наших предыдущих исследованиях было показано, что активация MAPK-ERK1/2-пути может быть одним из обязательных условий стимулирования накачки АХ в везикулы и последующего роста амплитуды МПКП при действии нейротрофина BDNF в моторных синапсах (Gaydukov et al., 2019). Поэтому в этом проекте, с целью изучения механизмов действия 2-АГ, мы проводили аппликацию на диафрагму мыши и m.EDL U0126 (15 мкМ), ингибитора MAPK-Erk1/2 каскада, для выяснения возможной роли этого каскада в пресинаптических процессах, запускаемых действием 2-АГ. Мы установили, что U026 полностью предотвращает прирост амплитуды МПКП, вызываемый аппликацией экзогенного 2-АГ (1мкМ) на мышцу (рис. 3А). U0126 также полностью предотвращал также единообразный прирост амплитуды ПКП на 25-30% в залпе ритмически генерируемых ПКП, вызываемый 2-АГ (рис. 3B, 3C).
Таким образом, мы впервые установили участие MAPK-Erk1/2 пути в приросте амплитуды МПКП и ПКП на фоне действия 2-АГ. Ранее была показана активация этого пути при действии BDNF в моторных синапсах мыши. Взаимосвязь же эффектов эндоканнабиноидов и MAPK-Erk1/2 каскада была описана только на постсинаптическом уровне, в волокнах скелетной мускулатуры, где транспорт глюкозы и контроль инсулиновой резистентности в мышце регулируются со стороны ЭК через активацию СВ1-рецепторов (Dalle et al., 2022). Здесь же, учитывая, что 2-АГ вызывает прирост амплитуды МПКП, и предположительно, ПКП, за счёт изменения везикулярного транспорта АХ (Tarasova et al., 2021), что происходит в пресинаптических окончаниях, нами была обнаружена взаимосвязь эффектов 2-АГ и MAPK-Erk1/2 каскада, затрагивающих процессы регуляции секреции АХ, на пресинаптическом уровне.
1.3.2.4 ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ МПКП И ПКП НА ФОНЕ ЭКЗОГЕННОЙ АППЛИКАЦИИ 2-АГ И ПРИ ИНГИБИРОВАНИИ ФЕРМЕНТА ДЕГРАДАЦИИ 2-АГ НА ФОНЕ БЛОКАДЫ КГРП-РЕЦЕПТОРОВ ПРИ ПОМОЩИ КГРП8-37
Увеличение амплитуды МПКП за счёт увеличения накачки АХ в везикулы было нами также ранее показано при активации КГРП-рецепторов со стороны кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП) (Gaydukov et al., 2016). Данный эффект КГРП зависел от активности РКА.
Мы решили проверить, не связаны ли эффекты 2-АГ, выражающиеся в увеличении амплитуды МПКП за счёт увеличения размера отдельного кванта АХ, с активацией КГРП-рецепторов в моторных синапсах мыши. Оказалось, что блокирование КГРП-рецепторов при помощи КГРП8-37 предотвращало прирост амплитуды МПКП, вызываемый 2-АГ (рис. 4A), который, как было ранее показано, реализуется за счёт активации CB1-рецепторов (Tarasova et al., 2021). Таким образом, активность КГРП-рецепторов необходима для проявления потенцирующего действия 2-АГ при активации CB1-рецепторов в моторных синапсах мыши. Чтобы проверить, происходит ли активация КГРП-рецепторов после действия 2-АГ на CB1-рецепторы в результате запускаемого за счёт этого молекулярного каскада или активация КГРП-рецепторов каким-то образом предшествует активации CB1-рецепторов и действие КГРП реализуется через каскад с их участием, мы провели серию экспериментов по изучению влияния КГРП на спонтанную секрецию АХ на фоне блокады CB1-рецепторов при помощи AM 251. Оказалось, что несмотря на блокаду CB1-рецепторов, КГРП всё же оказывал потенцирующее действие на амплитуду МПКП (рис. 4B): на фоне совместного действия КГРП и АМ 251 она составила 2,08±0,11 мВ (n=19), в то время как в контроле1,45±0,09 (n=18, p<0,05). То есть, активация КГРП-рецепторов, выявленная как необходимое звено для потенцирующего действия 2-АГ на спонтанную секрецию АХ, происходит после активации CB1-рецепторов и, по всей видимости, является частью сложного молекулярного каскада, запускаемого действием 2-АГ в моторных синапсах. Мы также проверили, повлияет ли ингибирование РКА (активность которой необходима для КГРП-опосредованного прироста амплитуды МПКП) при помощи Н89 (1 мкМ) на эффекты 2-АГ. И действительно, на фоне Н89 потенцирующее действие 2-АГ на амплитуду МПКП не проявлялось (рис. 4С).
Исходя из полученных данных нами была выдвинута гипотеза: активация CB1-рецепторов со стороны 2-АГ приводит к выбросу КГРП из моторных терминалей, а его последующее действие на свои пресинаптические рецепторы приводит к РКА-зависимому уислению накачки АХ в везикулы, что, в конечном итоге, отражается в увеличении амплитуды МПКП. КГРП описан в составе крупных электрон-плотных везикул (dense core vesicles (DCV)) не только в сенсорных, но и в двигательный нервных окончаниях (Csilik et al., 1993;Matteoli et al., 1988), откуда он может высвобождаться в синаптическую щель при экзоцитозе DCV (Sala et al., 1995).
Ранее мы установили, что экзоцитоз КГРП из моторных нервных терминалей требует активации рианодиновых рецепторов (РиР) (с выбросом депонированного Са2+) и активации Са2+-зависмого фермента СаМКII в терминалях (Gaydukov & Balezina, 2018).
В рамках этого проекта мы проверили, скажется ли на эффектах 2-АГ а) блокирование РиР при помощи высокой концентрации рианодина (3 мкМ) и б) ингибирование СаМКII при помощи KN 62 (3 мкМ). Оба воздействия предотвращали прирост амплитуды МПКП на фоне 2-АГ (1 мкМ) (рис. 5А, рис.5B). Эти данные позволяют предположить, что при активации CB1-рецепторов со стороны 2-АГ запускается каскад, приводящий к выбросу депонированного кальция через РиР, активации CaMKII и, тем самым, к экзоцитозу DCV с КГРП. Согласно классическим представлениям, CB1-рецепторы сцеплены с Gi-белками, однако в последнее время накапливается всё больше свидетельств, говорящих в пользу того, что CB-рецепторам свойственно явление «смещённого агонизма», когда активация тем или иным лигандом вызывает запуск разных внутриклеточных каскадов из-за разной конформации рецепторов и их разного сродства к G-белкам. Так, было показано сцепление CB-рецепторов с Gq и Gs-белками (Balezina et al., 2021; Diez-Alarcia et al., 2016; Leo &Abood, 2021). Мы предположили, что наблюдаемая в нашей работе активация РиР кальциевых депо может быть вызвана каскадом, запускаемом за счёт Gq-белков и включающем активацию PLC. Выяснилось, что блокирование PLC при помощи U-73122 (5 мкМ) предотвращает 2-АГ-опосредованное увеличение амплитуды МПКП (рис. 5С). В конечном итоге, гипотетический каскад, запускаемый действием 2-АГ в моторных синапсах мыши выглядит, согласно полученным данным, следующим образом: активация CB1-рецепторов – Gq-зависимая активация PLC – активация РиР и выброс депонированного кальция – активация CaMKII – экзоцитоз DCV с КГРП – аутокринное действие КГРП на КГРП-рецепторы – активация РКА – усиление накачки АХ в везикулы – увеличение размера кванта АХ.
Оставался вопрос, в каких условиях может срабатывать данный каскад? Ранее мы наблюдали КГРП-зависимый прирост амплитуды МПКП в 20-30 минутный интервал после тетанической (30 Гц, 2 мин) стимуляции препарата m.EDL-n.peroneus (с сохранённой сократительной активностью). Используя ранее отработанный протокол тетанической стимуляции, в данной работе мы исследовали влияние АМ 251, блокатора CB1-рецепторов, на посттетаничекий прирост амплитуды МПКП. Мы показали, что АМ 251 эффективно предотвращает вызванный тетанической стимуляцией прирост амплитуды МПКП в 20-30 минутный интервал после стимуляции (рис. 6А, рис 6В). Учитывая предложенный нами гипотетический механизм действия 2-АГ, можно предположить, что в ходе тетанической стимуляции нервно-мышечного препарата, сопровождавшейся сокращением, из скелетной мышцы выделяется 2-АГ (или другой эндоканнабиноид), что приводит к экзоцитозу КГРП, и тот уже оказывает непосредственное потенцирующее действию на секрецию АХ.
Таким образом, в рамках данной задачи мы вышли далеко за пределы исходного плана с целью установить взаимосвязь эффектов 2-АГ и КГРП в моторных синапсах мыши. На основе полученных данных была опубликована статья в журнале Synapse (Tarasova et al., 2023; DOI: 10.1002/syn.22281).
Помимо этого, мы провели серии экспериментов по выявлению роли КГРП-рецепторов в 2-АГ-опосредуемом увеличении амплитуды ПКП в коротких залпах (вызываемых стимуляцией двигательного нерва в течение 1 сек с частотой 50 Гц). Блокада КГРП рецепторов при помощи КГРП8-37 предотвращала вызываемый экзогенной аппликацией 2-АГ прирост амплитуды ПКП в залпе как в зрелых, так и новообразованых синапсах (рис. 1С, рис. 2Е). На фоне действия КГРП8-37 не проявлялось также и потенцирующее действие JZL 184 (1 мкМ), то есть для прироста амплитуды ПКП при накоплении и действии эндогенно вырабатываемого 2-АГ тоже необходимо активация КГРП-рецепторов (рис. 1D, рис. 2D). При этом, ни в том, ни в другом случае амплитуда МПКП также не менялась по сравнению с контролем. Согласно предположениям, прирост амплитуды мультиквантовых ПКП на фоне действия 2-АГ связан увеличением размера каждого отдельного кванта АХ. Значит, при блокировании КГРП-рецепторов, каскад запускаемый 2-АГ и направленный на увеличение накачки АХ в везикулы, не может реализоваться, и амплитуды и МПКП и ПКП будет оставаться на контрольном уровне, что согласуется с полученными в наших экспериментах данными.
Аналогичные результаты были получены и в новообразованных синапсах: потенциация вызванной секреции медиатора на фоне блокады фермента деградации 2-АГ при помощи JZl 184 1 мкМ и при экзогенной аппликации 2-АГ предотвращается действием КГРП8-37, блокатором КГРП-рецепторов.
Таким образом, полученные в 2023 г данные свидетельствуют о необходимом участии как MAPK-Erk1/2- каскада, так и КГРП-рецепторов в реализации эффектов 2-АГ в моторных синапсах мыши. Остается открытым вопрос, запускается ли необходимая активация MAPK-Erk1/2 каскада непосредственно вследствие активации СВ1-рецепторов со стороны 2-АГ, либо же она происходит позже, в результате действия КГРП на свои рецепторы, и является частью запускаемого при этом каскада ферментов, среди которых до сих пор была известна только РКА (Gaydukov et al., 2018; Gaydukov et al., 2016).), направленного на увеличение размера кванта АХ. Этот важный вопрос будет детально изучен на втором году реализации проекта.
1.3.2.5 ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ ПАРАМЕТРОВ МПКП И ПКП НА ФОНЕ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИ ПОМОЩИ DO34 ФЕРМЕНТА СИНТЕЗА 2-АГ (DAGL), ПАРАЛЛЕЛЬНО ПРОВОДЯЩЕЕСЯ В ЗРЕЛЫХ И В НОВООБРАЗОВАННЫХ МОТОРНЫХ СИНАПСАХ МЫШИ.
Помимо блокады деградации эндогенно вырабатываемого 2-АГ (подавлением активности MAGL), ещё одним инструментом исследования режима выработки этого эндоканнабиноида в моторных синапсах мыши может послужить блокада его синтеза при помощи DO34 – ингибитора DAGL, фермента синтеза 2-АГ. Используя DO34, можно обнаружить режим работы моторных синапсов, при котором значимый вклад в регуляцию секреции АХ будет вносить выработка эндогенного 2-АГ.
В зрелых моторных синапсах диафрагмы мыши было установлено, что блокада фермента синтеза 2-АГ при помощи DO34 не приводит к достоверным изменениям спонтанной секреции АХ (рис 7.А). Таким образом, в покое в моторных синапсах диафрагмы мыши отсутствует значимый уровень выработки эндогенного 2-АГ. Мы также установили, что при работе синапсов в режиме коротких ритмических залпов (50 Гц, 1 сек), DO34 не оказывает влияния ни на параметры МПКП, ни на параметры ПКП.
Аналогичное действие оказывал DO34 и в новообразованных синапсах m.EDL – ни амплитуда МПКП, ни амплитуда ПКП в коротких ритмических залпах (ни какие либо другие параметры спонтанной и вызванной секреции медиатора) не менялись на фоне DO34 (1 мкМ) (7В, 7С).
Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что, несмотря на доказанное присутствие ферментов синтеза и деградации 2-АГ в скелетной мускулатуре (Crespillo et al., 2011; Hutchins-Wiese et al., 2012), по всей видимости, в покое и/или при короткой ритмической работе моторных синапсов мыши отсутствует достаточная выработка (тоническая/вызванная синаптической активностью) эндогенного 2-АГ для осуществления им ретроградного регуляторного действия. Этот вывод согласуется с другими вышеописанными результатами, полученными впервые в рамках этого проекта, показывающих, что для обнаружения пресинаптических регуляторных эффектов эндогенных каннабиноидов в отношении амплитуды МПКП необходима более продолжительная интенсивная активность моторных синапсов, а также сокращение мышцы, как обязательного условия для достаточного синтеза и действия пула миогенных эндоканнабиноидов в моторных синапсах, чьё действие на размер кванта АХ и амплитуду МПКП опосредовано через КГРП.
Используя DO34, на следующем году выполнения проекта планируется на уже отработанной модели тетанической стимуляции (30 Гц, 2 мин) нервно-мышечных препаратов m.EDL проверить, будет ли на фоне блокады синтеза 2-АГ наблюдаться посттетанический прирост амплитуды МПКП в 20-30-минутный интервал после стимуляции. На первом году проекта мы показали, что этот прирост предотвращается блокадой CB1-рецепторов при помощи АМ 251, но этот тип рецепторов может активироваться как со стороны 2-АГ, так и, к примеру, со стороны АЭА. Если посттетаническая потенциация амплитуды МПКП не проявится при подавлении синтеза 2-АГ в моторных синапсах мыши, то можно будет утверждать, что именно 2-АГ приводит к увеличению спонтанной секреции АХ в период после тетанической активности синапсов.
1.3.2.6. Биохимические исследования:
На первом году выполнения проекта, в соответствии с заявленными планами, проводилась отработка нового для научного коллектива биохимического метода определения специфических белков, участвующих в эффектах 2-АГ в нервно-мышечных синапсах. В силу того, что данный метод является новым для нашей лаборатории, на отладку проведения экспериментов потребовалось существенное время. При помощи коммерчески доступных антител к СВ1-рецепторам (#AB9415, Chemicon) был проведён вестерн-блот в образцах мышечной ткани , не подвергавшейся денервации (диафрагмальная мышца) и на ранних стадиях реиннервации (m.EDL). При проведении вестерн-блота использовались пробы мышечной ткани диафрагмы и m.EDL из синаптических и из внесинаптических зон. В результате, удалось установить, что и в мышцах с зрелыми синаптическими контактами (m. diaphragmа), и в мышцах с регенерирующими после пережатия нерва синапсами (m.EDL), СВ1-рецепторы присутствуют не только во внесинаптических зонах этих мышц , но и в зоне расположения моторных синапсов (рис. 8). Наличие CB1-рецепторов в скелетных мышцах было показано ранее (Cavuoto et al., 2007; Crespillo et al., 2011), но в нашей работе впервые была выявлено расположение CB1-рецепторов не только в мышечных волокнах, но и в области синаптических контактов как в диафрагме, так и в m.EDL.
Мы также провели эксперименты по исследованию при помощи вестерн-блота содержания фосфорилированной (антитела #4370, Cell signaling) и нефосфорилированной форм (антитела #4695, Cell signaling) Erk1/2 после обработки нервно-мышечных препаратов диафрагмы мыши и m.EDL 2-АГ в течении 60 минут. В эксперименте использовались пробы внесинаптических и синаптических зон этих мышц. Поскольку антитела к MAPK выявляют как Erk2 (p42), так и Erk1 (p44), в результате вестерн-блоттинга контрольных и опытных проб диафрагмы и m.EDL в пробах проявлялось две полоски (для Erk2 и Erk1).
Удалось показать, что в m.EDL и в диафрагме мыши на фоне действия 2-АГ присутствуют фосфорилированные формы Erk1/2 как во внесинаптической, так и во синаптических зонах. Это согласуется с результатами электрофизиологических экспериментов, проведённых в рамках этого проекта, показавшими, что ингибитор MAPK-Erk1/2 –пути U0126 (15 мкМ) предотвращает действие 2-АГ в моторных синапсах (рис 9). К сожалению, в силу объективных и субъективных причин (длительной отработки метода), недостаточность выборки (по 2-3 образца) не позволила, на данный момент, провести количественный анализ изменения соотношения фосфорилированной формы к нефосфорилированной на фоне 2-АГ по сравнению с контролем, но полученные на качественном уровне данные этих экспериментов позволяют предполагать участие MAPK-Erk1/2-пути в эффектах 2-АГ.
Итак, в 2023 г. были выполнены все запланированные на 2023 год задачи и получен целый ряд приоритетных научных данных, а именно:
1) было выявлено, что блокада фермента деградации 2-АГ MAGL приводит к усилению вызванной секреции медиатора на фоне увеличения размера квантов АХ в новообразованных синапсах, также как и в зрелых моторных синапсах мыши. И в новообразованных синапсах m.EDL, и в зрелых моторных синапсах диафрагмы мыши увеличение амплитуды МПКП и ПКП на фоне блокатора MAGL JZL 184 (1 мкМ) предотвращалось блокадой CB1-рецепторов (при помощи AM 251 или их нейтральным антагонистом AM-6545), что может свидетельствовать об общности механизмов реализации действия 2-АГ в нервно-мышечных синапсах разного функционального статуса
2) было обнаружено, что эффекты 2-АГ в моторных синапсах мыши реализуются опосредованно, за счёт инициации высвобождения нейрогенного КГРП и его аутокринного действия на моторные терминали, сопровождающееся РКА-зависимым увеличением размера квантов АХ
3) установлены ранее неизвестные участники молекулярного каскада, лежащего в основе действия 2-АГ в моторных синапсах мыши: фосфолипаза С, рианодиновые рецепторы и СаMКII, необходимые, видимо, для стимулирования выброса КГРП. Помимо этого, было показано обязательное участие MAPK-каскада в реализации эффектов 2-АГ, так как ингибитор MAPK-Erk1/2-пути U0126 (1 мкМ) предотвращал увеличение амплитуды МПКП и ПКП как на фоне экзогенной аппликации 2-АГ, так и при блокировании фермента деградации 2-АГ.
4) показано, что блокада фермента синтеза 2-АГ DAGL при помощи DO34 (1 мкМ) не приводит к изменению ни спонтанной секреции АХ (в отсутствии стимуляции двигательного нерва), ни вызванной короткой ритмической электрической стимуляцией двигательного нерва (50 Гц, 1 сек) секреции медиатора
5) Выявлено, что наблюдать эффекты эндогенного 2-АГ возможно не только на фоне блокады его ферментативной деградации, но и в модели тетанической стимуляции нерва (30 Гц, 2 мин): при таком воздействии происходит посттетаническое увеличение амплитуды МПКП в интервале 20-30 минут после прекращения стимуляции нерва; это увеличение полностью предотвращается в присутствии антагониста СВ1-рецепторов АМ251.
6) при помощи вестерн-блоттинга показано присутствие CB1-рецепторов в синаптических и внесинаптических зонах как в препаратах диафрагмы мыши, так и в препаратах m.EDL, находящихся на ранней стадии реиннервации. В препаратах, обработанных в течении 60 минут при помощи 2-АГ (1 мкМ) показано на качественном уровне наличие фосфорилированной формы Erk1/2 в синаптических и внесинаптических зонах, что является дополнительным свидетельством активации MAPK-пути при действии 2-АГ в моторных синапсах мыши |
