ИСТИНА

Целью данного проекта является выделение новых штаммов-изолятов гетероцистных цианобактерий порядка Nostocales из различных биоценозов в разнообразных географических зонах (Подмосковье, Вьетнам, Антарктида) и их комплексное сравнительное изучение, направленное на оценку биоразнообразия гетероцистных цианобактерий в различных условиях обитания и анализ основных адаптационных механизмов у ряда представителей этой уникальной группы прокариот. В работе предполагается провести изучение морфологии, эффективности азотфиксации, устойчивости к различным стрессовым воздействиям и генетическую идентификацию типичных штаммов для различных биотопов. Полученные результаты по секвенированию и биоинформатическому анализу больших геномов новых свободноживущих, ассоциативных и симбиотических изолятов гетероцистных цианобактерий существенно расширят знания о генетической организации этого эволюционно и экологически значимого отдела цианобактерий, дадут возможность пополнить современные базы данных геномных последовательностей, проанализировать генетическую природу взаимодействия клеток цианобактерий с растениями-хозяевами и выявить основные механизмы адаптации к различным климатическим условиям, позволяющие цианобактериям этой группы иметь повсеместное распространение

The aim of this project is the selection of new isolates of heterocyst cyanobacteria (order Nostocales) from different communities in diverse geographical areas (the Moscow suburbs, Vietnam, Antarctida) and their comprehensive comparative study aimed at evaluating of heterocyst biodiversity of cyanobacteria in different environmental conditions and analysis of the major adaptive mechanisms of some members of this unique group of prokaryotes. The work is expected to conduct a study of the morphology, the efficiency of nitrogen fixation, the resistance to various stress factors and the genetic identification of typical strains from various biotopes. The results obtained by the sequencing and bioinformatics analysis of large genomes of new free-living, associative and symbiotic isolates of heterocyst cyanobacteria will significantly expand knowledge of the genetic organization of this evolutionary and ecologically significant division of cyanobacteria, will provide an opportunity to refill modern databases of genomic sequences, to analyze the genetic nature of the interaction of cyanobacterial cells of with plant hosts and to identify the main mechanisms of adaptation to different climatic conditions, allowing cyanobacteria of this group to have widespread.

1). Получение чистых культур гетероцистных цианобактерий из природных образцов воды, илистой почвы, водорослей, водных растений, мохообразных или каменистого грунта (в случае проб из Антарктиды); 2). Изучение основных морфологических и физиолого-биохимических характеристик как вновь выделенных штаммов, так и ранее не изучавшихся эпифитных/ симбиотических коллекционных штаммов в рамках следующих исследований: а) Построение временных кривых роста при культивировании на средах с различными источниками азота – на безазотистой среде и с добавлением NO3- и NH4+ с параллельным определением морфологии филаментов и частоты гетероцист. б) Изучение скорости роста штаммов на свету и в темноте при использовании фруктозы, глюкозы, сахарозы, то есть определение возможности фотогетеротрофного или гетеротрофного роста культур. в) Определение активности основных ферментов азотного и водородного метаболизма (нитрогеназы, поглощающей гидрогеназы) в интактных клетках при культивировании штаммов в суспензионных культурах. 3). Сравнительное изучение устойчивости имеющихся штаммов к различным стрессовым воздействиям с определением уровней активности ряда ферментов, защищающих клетки от окислительного стресса. 4). Проведение молекулярно-генетической идентификации новых свободноживущих, эпифитных и симбиотических штаммов с помощью ДНК-фингерпринтинга с праймерами к повторяющимся последовательностям ДНК в геномах гетероцистных цианобактерий (STRR, Hip1, Rep) и секвенирования геномных локусов ДНК, используемых для филогенетических построений у цианобактерий (гены 16S –РНК и ITS последовательности). 5). Полногеномное секвенирование на секвенаторе нового поколения ряда вновь выделенных штаммов и штаммов Anabaena из группы минорных симбионтов Azolla. 6). Биоинформатический анализ геномного полиморфизма у секвенированных штаммов и его связи с фенотипическими свойствами изучавшихся штаммов и их происхождением.

Модельный штамм A. variabilis ATCC 29413 и его мутанты, продуцирующие ионы аммония или молекулярный водород всесторонне изучены (определены ростовые характеристики, активность основных ферментов азотного и водородного метаболизма, продуктивность штаммов в различных условиях культивирования). С помощью молекулярных методов установлена генетическая природа этих мутантов. Геном цианобактерии A. variabilis ATCC 29413 был полностью секвенирован в 2005 г. Данные сиквенса позволили нам провести ресеквенирование лабораторного штамма A. variabilis ATCC 29413. Был осуществлен полногеномный анализ водород-продуцирующих мутантов РК17 и РК84, выявлены основные и дополнительные мутации, определяющие свойства этих мутантных штаммов. На основе симбиотического штамма Anabaena sp. V5 были получены этилендиамин-устойчивые мутанты с дерепрессированной системой азотфиксации, выделяющие ионы аммония в среду роста. Эксперименты по анализу различных штаммов нашей коллекции показали способность некоторых эпифитных и симбиотических штаммов использовать фруктозу для гетеротрофного роста в темноте, что характерно для штамма A.variabilis 29413. В геномах ряда штаммов были обнаружены гены, кодирующие уникальную для A.variabilis 29413 ванадиевую нитрогеназу. Была выделена группа штаммов по ряду характеристик сходных с A.variabilis 29413. В ходе работы по полногеномному анализу путем пиросеквенирования щтамма дикого типа A.variabilis ATCC 29413 и двух водород-продуцирующих штаммов идентифицирована природа мутантов и описана неизвестная ранее плазмида D A.variabilis ATCC 29413.Эти оригинальные результаты, имеющие большое научное значение для генетики цианобактерий, являются базой для расширенного использования полногеномного секвенирования при анализе новых изолятов и группы эпифитных и симбиотических штаммов родов Anabaena и Nostoc из коллекции кафедры генетики МГУ. В коллектив авторов также входят специалисты, работы которых посвящены изучению устойчивости растений к действию стресс-факторов.

В рамках данного проекта предполагается объединение усилий высококвалифицированных ученых различных специальностей для получения оригинальных результатов по описанию биоразнообразия штаммов гетероцистных цианобактерий, выделенных в различных по климатическим условиям регионах Земного шара. Такое исследование позволит выявить типичных представителей в различных экосистемах и изучить механизмы адаптации на физиологическом и генетическом уровнях, так как повсеместное распространение цианобактерий вне всякого сомнения связано с их необыкновенной адаптационной способностью к стрессовым факторам различной природы. В результате проведенных экспериментов будут получены следующие результаты: 1.) Выделены бактериологически чистые культуры новых гетероцистных цианобактерий из природных образцов воды, илистой почвы, водорослей, водных растений, мохообразных или каменистого грунта (в случае проб из Антарктиды); 2.) Изучены основные морфологические и физиолого-биохимические свойства вновь выделенных штаммов в сравнении с модельными и имеющимися в коллекции штаммами (морфология клеток и филаментов, пигментный состав, скорость роста на различных источниках азота и источниках углерода на свету и в темноте, уровни активности нитрогеназы и способность к выделению водорода). 3.) Определены уровни устойчивости клеток к ряду стрессовых факторов и антиоксидантная активность в клетках выделенных штаммов в контрольных и стрессовых условиях. 4.) Осуществлен ПЦР-фингерпринтинг геномной ДНК всех изучавшихся штаммов с праймерами к филогенетически значимым или повторяющимся последовательностям ДНК в геномах гетероцистных цианобактерий (ITS, STRR, Hip1, Rep) с последующей кластеризацией штаммов по сходству электрофоретических профилей полученных ПЦР-фрагментов. На последующих этапах планируемых исследований будет проведен сравнительный анализ фенотипического и генотипического разнообразия гетероцистных цианобактерий в различных экосистемах и отобран ряд типичных штаммов для различных мест обитания с высокой скоростью роста и азотфиксирующей способностью, устойчивостью к стрессовым факторам и\или образующих ассоциации с растениями для более глубокого генетического изучения путем полногеномного секвенирования. Данные полногеномного секвенирования позволят провести сравнительный анализ генетически родственных изолятов с выявлением геномных флуктуаций, перестроек и генного полиморфизма в зависимости от географического ареала распространения штаммов. Биоинформатический анализ секвенированных геномов позволит также выявить гены основных сигнальных путей, задействованные в ответе на стрессовые воздействия наряду с генами антиоксидантных систем. Установление генетической (видовой) принадлежности штаммов минорных симбионтов Azolla и других ассоциативных изолятов цианобактерий позволит выявить основные механизмы взаимодействия цианобактериальных симбионтов с растениями-хозяевами и показать значение таких ассоциативных связей в различных биоценозах.