| Результаты этапа: 1). Нашим коллективом разработан комплекс компьютерных программ для моделирования микротромбоза кровеносных сосудов с явным разрешением клеток крови, с учетом биомеханической активации тромбоцитов и конформационных изменений мультимеров фактора Виллебранда. Подобраны неизвестные параметры модели путем сравнения с экспериментальными данными: параметры упругих свойств мембраны тромбоцитов и эритроцитов будут уточнены путем сравнения формы клетки при растяжении оптическим пинцетом, в течении Куэтта и в Пуазейлевском потоке.
2). С помощью компьютерного моделирования выявлены и численно охарактеризованы зависимости количества прикрепленных тромбоцитов от размера, количества и механических свойств мультимеров фактора Виллебранда, секретируемых эндотелием, при различных гидродинамических условиях в модельной системе.
Модель подтвердила релевантность биофизического механизма активации тромбоцитов напряжениями сдвига в жидкости, согласно которому иерархические последовательные изменения конформации мультимеров фактора Виллебранда, управляемые гидродинамическими силами вязкого трения, приводят к изменению их сродства к мембранным рецепторам тромбоцита и запускают процесс тромбообразования. Этот механизм при условиях, близких к физиологическим, может обуславливать накопление микротромбов на воспаленных стенках кровеносных микрососудов.
Также модель продемонстрировала конкуренцию между процессами активации домена А1 и анфолдинга домена A2 механическими силами, действующими на прикрепленный к стенке линейный мультимер VWF в сдвиговом потоке вязкой жидкости. Важно отметить, что для мултимеров нормальной длины оба процесса начинаются при больших напряжениях сдвига, чем физиологические значения в здоровой артериоле или венуле (согласно модели, >3 Па для активации А1 и >5 Па для анфолдинга А2). Также обнаружен пороговый характер процесса активации и протеолиза VWF от длины мультимера: при напряжениях сдвига ниже определенного значения процессы не обнаружены в численных расчетах.
Результаты первого года работы подтвердили гипотезу о регулирующем действии гемодинамических сил в случае закрепленных на стенке мультимеров фактора Виллебранда: увеличение числа активных мономеров с увеличением напряжения сдвига также коррелирует с увеличением количества прикрепившихся тромбоцитов в течение времени симуляции. При этом более существенным оказалось не изменение конформации мультимера (переход из компактной клубковой конформации к растянутой, нитевидной), а механические растяжение отдельных звеньев-димеров, которое приводило к активации доменов А1 и увеличивало силу адгезии к рецепторам GPIb тромбоцитов. Полученные данные позволили сформулировать математическую модель механической активации тромбоцита за счет растяжения механочувствительной части рецептора GPIb и численно подтвердить гипотезу о возможности такой активации в различных гидродинамических условиях.
3). В модель были добавлены новые биофизические механизмы, в частности регуляции длины мультимеров фактора Виллебранда путем механо-химического протеолиза ферментом ADAMTS13. Была проверена гипотеза о регулирующей роли этого фермента при физиологических и патологических скоростях сдвига вблизи стенки микрососуда. Были построены графики зависимости длины активных мультимеров фактора Виллебранда в системе от скорости сдвига и константы скорости реакции протеолиза. Получены зависимости размера тромбоцитарного агрегата от скорости гидродинамического потока в сосуде, а также проведены сравнительный анализ симуляций при различных наборах параметров и анализ чувствительности модели. Построены карты режимов динамики линейного мультимера VWF: в пространстве параметров скорость сдвига – длина мультимера выделены области этих параметров, для которых наблюдалась та или иная конформация белка. В пространстве указанных параметров построены линии аппроксимации границ указанных областей, которые могут быть рассмотрены как зависимость пороговой скорости сдвига от длины мультимера. В нашей модели эта зависимость наилучшим образом описывается степенным законом γ≈a(N-1)^(-1/3), где γ – скорость сдвига, а N – число звеньев мультимера.
По результатам работы в отчетном периоде подготовлены 2 статьи и направлены в редакции рецензируемых научных журналов, индексируемых WoS и Scopus. В настоящее время обе статьи проходят рецензирование.
|
| Результаты этапа: 1). С помощью управляемой молекулярной динамики построены зависимости силы адгезии комплекса белков GPIb-A1VWF от времени и силы адгезии комплекса белков GPIb-A1VWF от деформации при различных скоростях растяжения. Проведен анализ конформаций белков GPIb и A1VWF в ходе процесса растяжения. На полученных силовых кривых можно выделить характерные участки, соответствующие ключевым конформационным изменениям в комплексе белков:
- первый пик (Рис. 3, A) – деформация концевых фрагментов домена A1 VWF и поворот молекулы относительно закрепленных аминокислот;
- второй пик (Рис. 3, B) – деагрегация β-переключателя GPIb и бета-листа A1VWF;
- короткое плато (Рис. 3, C) – образование связи с A1 VWF в области бета-пальца GPIb и задержка разрыва белкового комплекса.
При высоких скоростях растяжения также наблюдался частичный анфолдинг белка GPIb до момента полной деагрегации белков. Таким образом, наблюдались три этапа деформации белкового комплекса A1VWF-GPIb в процессе деагрегации. Также, как следует из результатов моделования, происходит переключение между двумя сайтами связывания GPIb и A1VWF: сначала механическую нагрузку несет бета-переключатель, затем – бета-палец.
Произведена зонтичная выборка и построен потенциал средней силы (Рис. 4) для деагрегации комплекса GPIb-A1VWF при его растяжении за концы молекул со скоростью 3.4 пН/пс. Изменение потенциала средней силы вдоль данной траектории, вычисленное методом анализа взвешенных гистограмм, составляет примерно 100 ккал/моль.
Проведено моделирование методом управляемой молекулярной динамики для трех различных направлений силы, действующей на GPIb. Из графиков зависимости силы натяжения от времени (Рис. 5) видно, что механическое усилие, необходимое для разрыва связи A1VWF-GPIb, заметно зависит от направления взаимоеой ориентации вектора прилоенной силы и вектора, соединяющего центры масс белков в исходной структуре. Эти результаты позволяют сформулировать выводы:
- механизм “улавливающей” связи в комплексе A1VWF-GPIb основан на механике белковых молекул, в частности, связан с вращательной степенью свободы этого комплекса;
- потенциальные барьеры, препятствующие вращательному движению глобулы A1VWF относительно точек закрепления (N- и C-концов), связаны с определенными аминокислотными отстатками, расположенными в концевых линкерах домена A1 и на поверхности этой глобулы.
В работе также было произведено моделирование также для мутаций А1 VWF (Рис. 6, 7), которые могут приводить к болезни Виллебранда типов 2B (повышенная агрегация тромбоцитов) и 2M (пониженная агрегация тромбоцитов): R1306Q/I1309V (структура 4C2A из PDB), Y1271C/C1272R (структура 4C2B из PDB), G1324S (структура 5BV8 из PDB), V1316M (структура получена в программе VMD), F1369I (структура получена в программе VMD).
На силовых кривых для мутаций F1369I, R1306Q/I1309V отсутствует первый пик, что может говорить о том, что концевые линкеры таких A1VWF более гибкие и деформируются сильнее в сравнении с белком дикого типа. С помощью моделирования мутантны структур и сравнительного анализа выявлены структурные факторы, отвечающие за эффект улавливающей связи (то есть упрочняющейся при растяжении) при комплекса белков GPIb-A1VWF. Локальные электростатические взаимодействия этих аминокислотных остатков по принципу солевых мостиков способствуют тому, что при малых и высоких силах растяжения комплекс сравнительно быстро деагрегирует, а при средних – живет максимально долго. Благодаря этой наномеханике белков, обусловленной их геометрией, по-видимому, обеспечивается “настройка” оптимального адгезионного взаимодействия тромбоцитов и фактора Виллебранда в рабочем диапазоне гидродинамических условий: агрегация тромоцитов посредством адгезии белков VWF и GPIb должна происходить при скоростях сдвига порядка 1000 -10000 /сек, а при меньших значениях в норме не наблюдается. Понимание этих механизмов может способствовать разработке новых методов терапии болезни Виллебранда типа IIВ, связанной с точечеными мутациями в домене A1. Мутации домена A1 VWF, приводящие к болезни Виллебранда, влияют на кинетику взаимодейсвия рассматриваемых молекул, в частности, изменяют вид зависимости силы, приложенной к GPIb, от времени. Некоторые из этих мутаций расположены вблизи к сайтам связывания A1VWF и могут непосредственно влиять на взаимодействие белков. В то же время другие опасные мутации могут находиться в центре глобулы и влиять на её жесткость или образование внутримолекулярных связей.
На основании молекулярно-динамических расчетов подобраны более точные параметры потенциалов взаимодействия тромбоцита и фактора Виллебранда для модели клеточного масштаба.
2). Разработана новая модификация крупно-зернистой модели комплекса белков GPIb-A1VWF с учетом изменений его конформации этих белков под действием механического натяжения и эффекта механорецепции. На основании качественного и количественного анализа результатов молекулярно-динамического моделирования подобраны более точные параметры для адгезионного взаимодействия тромбоцитов и фактора Виллебранда в модели клеточного масштаба. Потенциальная энергия взаимодействия GPIb и A1VWF в новой версии модели теперь определяется на основе потенциалов средней силы, полученных из молекулярно-динамических расчетов.
Также на основе молекулярно-динамических данных сформулирована более точная крупно-зернистая модель адгезии тромбоцитов к фактору Виллебранда, учитивающая эффект механической активации тромбоцитов через анфолдинг механочувствительного домена белка GPIb. Модель механической активации тромбоцитов явно учитывает силу натяжения каждого рецептора GPIb на поверхности модельного тромбоцита, вероятность анфолдинга механочувствительного домена зависит от этой силы натяжения по закону Бэлла экспоненциальным образом. Детали реализации модели, результаты валидации и использованные параметры опубликованы нами в статье [Belyaev, A.V., Kushchenko, Y.K. Biomechanical activation of blood platelets via adhesion to von Willebrand factor studied with mesoscopic simulations. Biomech Model Mechanobiol (2023) v. 22, pp. 785–808.].
В ходе второго года работы над проектом обновленная стохастическая модель лиганд-рецептоных связей между тромбоцитами и фактором Виллебранда была сформулирована математически, реализована в виде программного кода и добавлена в компьютерную модель клеточного масштаба для учета эффекта “улавливающей” связи и изучения влияния этого эффекта на динамику адгезии тромбоцитов к фактору Виллебранда при тромбозе в кровеносных микрососудах. Новая модель позволяет учитывать мутации в белках GPIb и A1VWF путем изменения констант скоростей разрыва связи, которые в свою очередь, могут быть рассчитаны из результатов молекулярно-динамической части работы, а именно из потенциалов средней силы.
3). С помощью моделирования изучена динамика движения тромбоцита в сдвиговом потоке жидкости вблизи плоской стенки с иммобилизированным на ней слоем мультимеров фактора Виллебранда, закрепленных за один из концов. Измерена скорость движения тромбоцита при разных величинах пристеночного напряжения сдвига – от 0.1 до 100 Па – то есть и для патологических, и для физиологических гемодинамических условий в артериолах, венулах и артериях. Изучена динамика тромбоцитов в модели при различных параметрах адгезионных взаимодействий между тромбоцитом и фактором Виллебранда в компьютерной модели: варьирование глубины потенциальной ямы адгезионного потенциала для комплекса рецептор-лиганд GPIb-A1VWF позволило изучить особенности микромеханики агрегации тромобитов при различных нарушениях первичного клеточного гемостаза, в том числе при болезни Виллебранда. Проведено сравнение с экспериментами и на основании этого сравнения уточнены численные значения свободных параметров модели для «здоровых» тромбоцитов и мультимеров VWF, а также для мутантных белков, вызывающих болезнь Виллебранда типов 2B и 2M, которые характеризуются паталогическим упрочнением и ослаблением адгезионной связи между VWF и тромбоцитарными рецепторами GPIb соответственно. На основании моделирования сделано заключение, что при первичной адгезии тромбоцитов к фактору Виллебранда в артериях и артериолах на рецепторы тромбоцитов действуют достаточные растягивающие силы для механической активации тромбоцитов при напряжениях сдвига > 1 Па. Отсюда может быть сделан вывод: VWF-зависимое прикрепление тромбоцитов может способствовать механической активации интегринов и упрочнению тромбоцитарных агрегатов на начальных стадиях тромбоза. Кроме того, на основании анализа модели обнаружено, что уже прикрепившиеся тромбоциты активируют (растягивают) большее число субъединиц факторв Виллебранда, способствуя прикреплению новых тромбоцитов выше по потоку от уже закрепленных, что может говорить о механической кооперативности процесса первичного тромбоцитарного гемостаза. Результаты этой части работы опубликованы в рецензируемом научном журнале [Belyaev, A.V., Kushchenko, Y.K. Biomechanical activation of blood platelets via adhesion to von Willebrand factor studied with mesoscopic simulations. Biomech Model Mechanobiol (2023) v. 22, pp. 785–808.].
4). В клеточную модель тромбоцитарного гемостаза добавлен новый объект – эритроциты. Классическая механическая модель спектриновой сети эритроцита была нами усовершенствована и верифицирована путем сравнения моделирования и экспериментальных данных из литературных источников. Предложена новая методика неявного учета различия вязкости внутри и снаружи эритроцита на основе перемасштабирования коэффициента взаимодействия частиц мембраны эритроцита с жидкостью.
Проведены расчеты модели участка цилиндрического микрососуда с участком воспаленного эндотелия, который секретировал в просвет сосуда мультимеры белка фактор Виллебранда. Проведены расчеты для мультимеров различной длины, а также для различной поверхностной плотности секретированных белков и различног размера области воспаленного эндотелия. В модели варьировался перепад давления на концах сосуда, таким образом были исследованы механические особенности системы в различных гемодинамических условиях. Было показано, что при числах Рейнольдса порядка 0.01-0.1 в сосуде диаметром 16 микрон большая часть тромбоцитов вытесняется к стенке в течение первых 200-300 мс модельного времени. Тромбоциты могут налипать на мультимеры фактора Виллебранда, который при таких условиях переходит в развернутую конформацию и частично активируется, еслти длина мультимера больше 20 субъединиц. Столкновения с эритроцитами приводят к тому, что тромбоциты “вдавливаются” в слой белка и образуют большее число адгезионных связей с ним. При этом эритроциты также толкают уже закрепленные на факторе Виллебранда тромбоциты, что приводит к увеличению растянутых субъединиц фактора Виллебранда, а также усиливает растяжение механочувствительных рецепторов (GPIb). Эти механические взаимодействия, как следует их модели, могут способствовать механической активации тромбоцитов в узких микрососудах. Исследовано количество накопленных тромбоцитов в месте секреции фактора Виллебранда воспаленным эндотелием в модельной системе при разных значениях гематокрита, для различных механических моделей для эритроцитов с учетов их способности к агрегации (образованию монетных столбиков). Проведено сравнение результатов моделирования для условно «здоровых» модельных эритроцитов и модельных эритроцитов пациентов с сахарным диабетом 2 типа с патологическими упругими характеристиками и увеличенным внутренним объемом. Подбор параметров для упругих свойств эритроцитов осуществлено с помощью найденных в литературе экспериментальных данных. Сравнение показало, что повышенная упругость и внутренний объем эритроцитов приводят к ускоренному вытеснению тромбоцитов к стенке сосуда, повышая вероятность их адгезии к фактору Виллебранда и последующей механической активации. Таким образом, адгезионый комплекс GPIb-VWF может оказаться перспективной мишенью для терапевтического воздействия с целью предотвращения образования тромбоцитарных агрегатов и тромбовоспаления в микрососудах.
5). Получены траектортии движения тромбоцитов и измерена скорость накопления тромбоцитов и количество прикрепленных тромбоцитов в модельных микрососудах со стенозом (сужением) различной геометрии. Воспаленный участок эндотелия в данных расчетах соответствовал верхушке стенозирующего препятствия. Моделирование показало, что увеличение скорости и напряжения сдвига в жидкости вблизи стеноза приводит к повышению числа активированных мультимеров фактора Виллебранда и более прочному прикреплению тромбоцитов в стенозированной части сосуда по сравнению с цилиндрической геометрией. Полученные в проекте результаты моделирования показали, что около 75 % тромбоцитов в модели адгезировались к фактору Виллебранда в течение 500 мс модельного времени (для сосудов 16-20 микрон в диаметре). При этом тромбоциты локализуются в области немного вниз по течению относительно точки максимального стеноза сосуда.
6). В результате работы над проектом создана комплексная методика моделирования клеточного гемостаза в микрососудах с явным учетом механических свойств клеток крови, явным описанием динамики фактора Виллебранда и механохимических изменений в рецепторах тромбоцитов GPIb. На основе этого подхода проверены гипотезы относительно биофизических основ механо-чувствительности тромбоцитов в потоке вязкой жидкости. Показано, что механочувствительность рецептора GPIb может играть важную биофизическую роль в первичном гемостазе при физиологических гемодинамических условиях в артериолах. Создана вычислительная платформа для анализа микрососудистого тромбоза и прогностического моделирования, применимая в ряде практически значимых ситуаций, в частности, для предсказания динамики начальных этапов агрегации тромбоцитов при воспалении эндотелия, для анализа динамики образования тромбоцитарных агрегатов при болезни Виллебранда, при тромботической тромбоцитопенической пурпуре и других нарушения тромбоцитарного звена гемостаза.
7). Опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах, две из которых – в журналах из первого квартиля (Q1):
- Belyaev, A.V., Kushchenko, Y.K. Biomechanical activation of blood platelets via adhesion to von Willebrand factor studied with mesoscopic simulations. Biomech Model Mechanobiol (2023) 22, pages 785–808. https://doi.org/10.1007/s10237-022-01681-3
- Tsyu, N.G., Belyaev, A.V. Coarse-grained simulations of von Willebrand factor adsorption to collagen with consequent platelet recruitment // International Journal for Numerical Methods in Biomedical Engineering (2023); 39(11):e3747. https://doi.org/10.1002/cnm.3747
- Belyaev, A.V., Fedotova, I.V. Molecular mechanisms of catch bonds and their implications for platelet hemostasis. Biophys Reviews (2023) v. 15, pages 1233–1256 . https://doi.org/10.1007/s12551-023-01144-8
|
