В связи с техническими работами в центре обработки данных, возможность загрузки и скачивания файлов временно недоступна.
 

Влияние поверхности кристалла НПВО на результаты измерения ИК-Фурье спектровНИР

Effect of the surface of ATR crystal on the FTIR spectra measurement

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Интерпретация спектральных изменений, которые происходят в ИК спектрах при помещении различных смесей на поверхность кристалла НПВО (алмаза)
Результаты этапа: Установлено, что для двухкомпонентных растворов в ИК спектрах, измеряемых в геометрии НПВО, могут наблюдаться спектральные изменения, связанные с (i) протеканием в смеси реакции, (ii) изменением концентраций компонент за счёт испарения и/или (iii) взаимодействием компонент с кристаллом НПВО. При взаимодействии с кристаллом изменения различны для линий на разных частотах за счёт разных глубин проникновения излучения в образец. Разные скорости изменения интенсивностей линий на разных частотах позволяют говорить о неоднородном распределении компонентов раствора в направлении, перпендикулярном поверхности кристалла НПВО. Выявлено, что вблизи поверхности кристалла НПВО раствор ДНФА в ацетонитриле за счёт испарения растворителя и существенного увеличения плотности переходит в новую жидкую фазу. Поскольку ацетонитрил и ДНФА не взаимодействуют химически, то обнаруженная новая фаза, по всей видимости, стабилизируется водородными связями.
2 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Изменения конформационно-значимых линий в КР спектрах белков и кинетики ИК-Фурье спектров жидкостей при взаимодействии с кристаллом НПВО
Результаты этапа: Методом ИК-Фурье спектроскопии исследованы смеси с реагирующими и не реагирующими химическими компонентами при их помещении на поверхность кристалла НПВО (алмаза) в конфигурации, исключающей процессы испарения. Определены и интерпретированы характерные спектральные изменения. Помещение раствора на кристалл НПВО может приводить к перераспределению компонентов раствора вблизи поверхности кристалла в слое толщиной несколько микрометров и образованию квазикристаллических структур. Методом КР микроспектроскопии измерены спектры лиофилизованного химотрипсина и белка, осаждённого на поверхность кристалла НПВО при высыхании из водного раствора. Вторичная структура белка меняется при переходе от микрокристаллического лиофилизованного состояния к высушенному из раствора при нормальных условиях, а так же имеет особенности для молекул расположенных в высушенном образце на границе раздела с кристаллом НПВО.
3 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Механизмы взаимодействия молекул растворенных веществ и растворителя с поверхностью алмаза
Результаты этапа: Изменения, наблюдаемые в ИК спектрах водных растворов белков, измеренных в геометрии НПВО. Прямое сравнение ИК-Фурье спектров растворов химотрипсина в области конформационно чувствительных полос Амид I и Амид II затруднительно. Однако, сравнение вторых производных спектров позволяет определить изменения вторичной структуры молекул. Таким образом, было проведено сравнение первого и последнего спектров в сериях, измеренных сразу после помещения раствора на кристалл НПВО и через час пребывания на нем. В производной спектров в области Амид I присутствует две компоненты, причем интенсивная компонента на 1630 см-1 перекрывается с деформационным колебанием молекул воды. Но поскольку линия валентных колебаний воды в области 3000-3500 см-1 остается неизменной, то наблюдаемые изменения можно объяснить лишь изменениями полосы Амид I химотрипсина. Для раствора химотрипсина CT-1 в концентрации 100 мг/мл наблюдается перераспределение компонент чувствительной ко вторичной структуре полосы Амид II в области 1500-1560 см-1. Для раствора CT-2 в концентрации 200 мг/мл наблюдается уменьшение интенсивности высокочастотной компоненты полосы Амид II на 1545 см-1. Различия в изменениях полосы Амид II можно объяснить отличием вторичной структуры молекул ферментов CT-1 и CT-2. В тех же спектральных областях было проведено сравнение ИК-Фурье спектров растворов альбумина BSA в концентрациях 100 и 200 мг/мл. Для раствора в концентрации 100 мг/мл изменений в спектрах второй производной не наблюдаются. Для раствора в концентрации 200 мг/мл наблюдается перераспределение интенсивности линий на частотах 1633 и 1646 см-1 и небольшое уменьшение интенсивности линии на частоте 1545 см-1. Происходящие со временем изменения интенсивности спектральных компонент и их сдвиг может объясняться особой организацией белковых молекул вблизи поверхности кристалла НПВО, что приводит к изменениям в их вторичной структуре. Это относится к молекулам, расположенным в непосредственной близости к поверхности кристалла НПВО. Изменения, наблюдаемые в ИК спектрах белков, высохших на кристалле НПВО. Сравнение спектров водного раствора химотрипсина CT-1 (100 мг/мл), этого же раствора, высохшего на поверхности НПВО кристалла, и спектра порошка CT-1 показало следующее. Ширина полосы Амид I химотрипсина в растворе и порошке совпадает, в то время как ширина этой же полосы в высохшем на поверхности алмаза образце больше. Также можно утверждать, что наблюдаются отличия для полос Амид II и Амид III. В спектре высохшего на кристалле белка также наблюдаются изменения в диапазоне 1000-1110 см-1. Были обнаружены отличия в конформационно чувствительной линии Амид I для спектров раствора белка, который высыхал в непосредственном контакте с поверхностью алмаза НПВО, и тем, что не соприкасался с поверхностью алмаза. Деконволюция полученных спектров позволяет выделить четыре компоненты полосы Амид I: компоненты колебаний боковой цепи (положение максимума в диапазоне 1610-1616 см-1), двух компонент колебаний β-структурных элементов (1629-1632 и 1687-1690 см-1) и компоненты колебаний α-структурных элементов (1657-1662 см-1). Под колебаниями боковой цепи понимают межмолекулярные С–H колебания боковых элементов аминокислот [J. Wantyghem, M.H. Baron, M. Picquart, F. Lavialle. Conformational changes of Robinia pseudoacacia lectin related to modifications of the environment: FTIR investigation. // Biochemistry, 1990, 29(28), 6600-6609]. α-Химотрипсин является β-структурированным белком. Это проявляется в спектре порошка CT-1 в виде интенсивной компоненты на частоте 1632 см-1 и слабо выраженной компоненты на частоте 1661 см-1, соответствующей α-структурным элементам. При высыхании раствора CT-1 наблюдается смещение частоты и перераспределение интенсивности между компонентами, соответствующими колебаниям боковой цепи и β-листов. Причем по соотношению компонент на частотах 1616 и 1632 см-1 в спектрах высохшего раствора можно сказать, что количество β-структурных элементов в молекулах белка, прилегающих к кристаллу алмаза, меньше, чем в молекулах со свободной поверхности высохшего раствора. Если также учесть изменение соотношения между компонентами 1657 и 1689 см-1, то можно говорить о небольшом увеличении содержания α-структурных элементов в белке на границе раздела раствор-алмаз. Наблюдаемые для полосы Амид I изменения подтверждаются изменениями, наблюдаемые для полосы Амид II. Видны незначительное увеличение интенсивности и смещение линии в диапазоне 1540-1550 см-1, соответствующей α-структурным элементам. Для высохшего раствора по сравнению с порошком наблюдается перераспределение компонент на 1495 и 1510 см-1, которые можно соотнести с элементами β-структуры. Положение этих компонент чувствительно к колебаниям N-H, которые, в свою очередь, чувствительны к образованию водородных связей [Barth A. Infrared spectroscopy of proteins. // Biochimica et Biophysica Acta, 2007, 1767, 1073-1101]. Было проведено также сравнение спектров водного раствора альбумина (100 мг/мл), этого же раствора, высохшего на поверхности НПВО кристалла, и порошка альбумина. При высыхании раствора фермента изменяется форма и ширина полосы Амид I. Происходят также значительные изменения в области полос Амид II и III в спектре высохшего раствора белка по сравнению с лиофилизованным образцом. ИК спектры, измеренные в области полос Амид I и II для лиофилизованного альбумина, а также его высохшего раствора, показали следующее. Обнаружены отличия в конформационно-чувствительной линии Амид I для спектров раствора белка, который высыхал в непосредственном контакте с поверхностью алмаза НПВО. Он отличается от спектра верхней поверхности пленки, которая не соприкасалась с поверхностью алмаза. При высыхании раствора альбумина наблюдается смещение компонент на частотах 1650 и 1684 см-1. При высыхании наблюдается рост компоненты на частоте 1648 см-1, соответствующей α-спиралям, что может говорить об относительном увеличении количества таких элементов. Для свободной поверхности контрольного образца наблюдаются такие же изменения, но в меньшей степени. В области полосы Амид II при высыхании раствора наблюдается перераспределение интенсивности между компонентами на частотах 1495 и 1511 см-1. Причем компонента на 1511 см-1 увеличивается для образца, высохшего в контакте с поверхностью кристалла НПВО алмаза, и уменьшается для свободной поверхности контрольного образца. Компоненту на часоте 1511 см-1 связывают с колебаниями боковых цепей аминокислоты тирозина [K. Murayama, M. Tomida. Heat-Induced Secondary Structure and Conformation Change of Bovine Serum Albumin Investigated by Fourier Transform Infrared Spectroscopy. // Biochemistry, 2004, 43(36), 11526-11532], а существенный вклад в колебание на 1495 см-1 вносит фенилаланин [R.J. Jakobsen, F.M. Wasacz. Infrared Spectra-Structure Correlations and Adsorption Behavior for Helix Proteins. // Applied Spectroscopy, 1990, 44(9), 1478-1490]. При высыхании раствора альбумина наблюдается существенный рост компоненты на 1536 см-1, связанный с увеличением содержания α-структурных элементов [K. Kato, T. Matsui, S. Tanaka. Quantitative Estimation of α-Helix Coil Content in Bovine Serum Albumin by Fourier Transform-Infrared Spectroscopy. // Applied Spectroscopy, 1987, 41(5), 861-865.]. Этот результат соответствует результату, полученному при анализе полосы Амид I.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы


Имя Описание Имя файла Размер Добавлен