| 1 |
1 августа 2022 г.-30 июня 2023 г. |
Изучение активности протеаз, в том числе высокоактивных в отношении фибриллярных белков, микромицетами A. ustus 1 и A. ochraceus L-1 в различных условиях (способ культивирования, состав питательной среды, pH и температура культивирования), выделение мРНК и ДНК. Секвенирование мРНК микомицетов A. ustus 1 и A. ochraceus L-1. |
| Результаты этапа: 1. Изучено влияние источников углерода в составе питательной среды на образование протеаз микромицетами A. ustus 1 и A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D), показано, что наибольшая продукция протеаз, активных в отношении фибриллярных белков, была достигнута при использовании сочетания глюкозы и глицерина в качестве источников углерода.
2. Изучено влияние источников азота в составе питательной среды на образование протеаз микромицетами A. ustus 1 и A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D). Максимальные значения коллагенолитической (135,28 ЕКол/мл) и фибринолитической (59,6 ЕТир/мл) активности протеаз, образуемых A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D), были обнаружены на 4 сутки, на среде, содержащей гидролизат рыбной муки (ГРМ) и коллаген, а максимальные значения эластинолитической (261,03 EpNA/мл) и казеинолитической (223,87 ЕТир/мл) активности были выявлены на среде с эластином и нитратом натрия, на 8 и 3 сутки культивирования, соответственно. Для микромицета A. ustus 1 наибольшие значения коллагенолитической (185,32 ЕКол/мл) активности протеаз были показаны на 5 сутки культивирования на среде с ГРМ в качестве единственного источника азота, фибринолитической (49,77 ЕТир/мл) - на 4 сутки, на среде с ГРМ и казеином, эластинолитической (282,23 EpNA/мл) на 5 сутки на среде с ГРМ и коллагеном, а казеинолитической (176,37 ЕТир/мл) на 5 сутки, на среде с ГРМ и нитратом натрия.
3. Изучено влияние начального pH питательной среды и температуры культивирования на образование протеаз микромицетами A. ustus 1 и A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D). Было показано, что наиболее подходящие условия для синтеза казеинолитических, коллагенолитических и фибринолитических протеаз микромицетом A. ustus 1 – pH 7,0 и 28 оС, тогда как максимальные значения эластинолитической активности были получены при начальном pH среды 6,0 и 25 оС. Микромицет A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D) синтезировал протеазы с наибольшими значениями всех изученных типов активности при начальном pH среды 7,0 и температуре культивирования 28 оС.
4. Изучены динамики накопления протеолитических ферментов микромицетами A. ustus 1 и A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D) в условиях твердофазного культивирования с использованием различных субстратов/носителей. Максимальные значения коллагенолитической (5 сут.; 408,24 ЕКол/мл) и эластинолитической (8 сут; 301,73 EpNA/мл) активности протеаз A. ustus 1 были обнаружены при использовании сочетания вермикулита и питательной среды с ГРМ, тогда как максимальные значения фибринолитической (254,4 ЕТир/мл) и казеинолитической (618,95 ЕТир/мл) активности были выявлены в системе ТФК с силикагелем, на 5 и 3 сутки, соответственно, причем все полученные значения были выше, чем в глубинных условиях культивирования на той же питательной среде. Для A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D) наибольшие значения казеинолитической (695,68 ЕТир/мл) и фибринолитической (56,52 ЕТир/мл) активности были обнаружены при культивировании в условиях ТФК с вермикулитом и питательной средой ГРМ и нитратом натрия. Значения коллагенолитической и эластинолитической активности были относительно невысокими во всех изученных вариантах ТФК, только при использовании вермикулита в качестве носителя удалось достичь значений коллагенолитической активности, сопоставимых с полученными в глубинных условиях.
5. Были выделены тотальная ДНК и 6 образцов мРНК из мицелия микромицетов A. ustus 1 и A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D), выращенных в разных условиях культивирования.
6. Было проведено секвенирование тотальной ДНК и 2 образцов мРНК, выделенных из мицелия микромицетов A. ustus 1 и A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D). |
| 2 |
1 июля 2023 г.-30 июня 2024 г. |
Секвенирование геномов микромицетов A. ustus 1 и A. ochraceus L-1. Выделение, очистка, масс-спектрометрический анализ, изучение кинетических параметров и субстратной специфичности протеаз, проявляющих выраженную активность в отношении фибриллярных белков. Биоинформатический анализ геномов и транскриптомов микромицетов A. ustus 1 и A. ochraceus L-1. |
| Результаты этапа: 1. Выделены и очищены 4 наиболее активные в отношении фибриллярных белков коллагенолитичсекие протеазы, образуемые микромицетами A. ustus 1 и A. ochraceus L-1(ВКМ F-4104D) в изученных ранее условиях глубинного и твердофазного культивирования.
2. В результате изучения биохимических и физико-химических характеристик выделенных протеаз было установлено, что протеаза ustA, образуемая микромицетом A. ustus 1, имеет молекулярную массу 60,428 кДа, pI - 4,41, Km - 261,0 мкМ, kcat – 67 с-1, Vmax – 20,2 нмоль/мин и относится к семейству S10; протеаза ustB, образуемая тем же микромицетом, имеет молекулярную массу 42,368 кДа, pI – 5,03, Km – 204,4 мкМ, kcat – 82,3 с-1, Vmax – 14,0 нмоль/мин, относится к семейству S8. Для протеаз, синтезируемых микромицетом A. ochraceus L-1(ВКМ F-4104D) было установлено, что они обе также принадлежат к семейству сериновых протеаз S8. Молекулярная масса протеазы ochrA составила 42,201 кДа, pI – 5,93, Km – 401.4 мкМ, kcat – 226 с-1, Vmax – 33.9 нмоль/мин; молекулярная масса протеазы ochrB – 92, 68 кДа, pI – 4,89, Km – 2089,3 мкМ, kcat – 72,4 с-1, Vmax – 54.3 нмоль/мин. По результатам анализа субстратной специфичности выделенных протеаз было показано, что все они обладают достаточно широкой субстратной специфичностью, для ustA и ochrA характерно выраженное проявление трипсиноподобной активности.
3. Геномы микромицетов A. ustus 1 и A. ochraceus L-1(ВКМ F-4104D) были собраны и аннотированы. Собранный геном A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D) состоит из 862 контигов длиной более 200 п.н. с максимальной длиной контига 720519 п.н. Общая длина составляет 36 493367 п.н.. Геном A. ustus 1 состоит из 1562 контигов длиной более 200 п.н. с максимальной длиной контига 1197003 п.н. Общая длина составляет 39 465865 п.н. По результатам биоинформатического анализа геномов была предсказана 121 внеклеточная протеаза у микромицета A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D) и 142 у A. ustus 1.
4. Образцы с мРНК A. ustus 1, полученные на 9 сутки глубинного культивирования на среде N7, на 5 сутки глубинного культивирования на среде N4, а также образцы мРНК A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D), выделенной на 3 сутки культивирования в условиях ТФК с вермикулитом и на 7 сутки культивирования на среде N8, были переданы для секвенирования на платформе Illumina NextSeq в ООО «Альгавитапро». По итогам секвенирования объем полученных данных для каждого образца составил не менее 4 ГБ (парноконцевые прочтения).
5. В результате биоинформатического анализа транскриптомов микромицетов A. ustus 1 и A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D) и изучения профиля экспрессии генов, кодирующих образование внеклеточных протеаз, выявлено, что для A. ochraceus L-1 (ВКМ F-4104D) была показана экспрессия 121 протеазы из 121 возможной на всех изученных средах; для микромицета A. ustus 1 в изученных условиях показана экспрессия 138 протеаз из 142. По результатам изучения профилей экспрессии внеклеточных протеаз штаммом A. ochraceus L-1(ВКМ F-4104D) было установлено, что наиболее высокий уровень экспрессии протеаз (847,43 TPM – transcript per million) характерен для микромицета на 7 сутки при росте на среде N8 в условиях глубинного культивирования, по количеству транскриптов на миллион пар оснований в данном профиле характерно преобладание сериновых протеаз, также стоит отметить широкую представленность аспартатных и металлопротеаз. Для микромицета A. ustus 1 наиболее высокие уровни экспрессии генов внеклеточных протеаз были показаны в условиях глубинного культивирования на среде N4 на 5 сутки культивирования, наиболее интенсивно экспрессировались сериновые протеазы семейств S10 и S8 – 275, 12 TPM и 234, 5 TPM, соответственно. Протеазы семейств М35 (208,59 TPM) и А1 (180,98 TPM) также показали высокий уровень экспрессии в данных условиях.
6. Был проведен масс-спектрометрический анализ протеаз, выделенных из активных фракций после изоэлектрофокусирования, по результатам данного анализа удалось идентифицировать 4 различные протеазы, были установлены аминокислотные последовательности выделенных белков.
|
