ИСТИНА

В рамках настоящего проекта будут разработаны синтетические подходы к двум новым структурным типам производных изоксазола: краун\азакраунсодержащим 5-стирилизоксазолам и BF2-комплексам (изоксазолил)замещенных 1,3-дикетонов. Такие соединения представляют интерес для использования в качестве молекулярных сенсоров и флуорофоров с ценными фотофизическими свойствами, а также для изучения различных типов биологической активности. Такие сенсоры могут быть использованы для изучения молекулярных процессов в клетках и, как следствие, помочь в разработке новых лекарственных препаратов.

Isoxazole represents an important class of five-membered N,O-heterocycles that is a widely used in organic synthesis and medicinal chemistry. The increased interest in the isoxazole heterocycle can be explained by the facts, that the isoxazole framework is present in the natural compounds (ibotenic acid, muscimol), various drugs (oxacillin, cloxacillin, leflunomide, isocarboxazid, etc.). Also isoxazole-containing compounds are used in agriculture and technology. The electronic nature of the isoxazole ring also makes it possible to use these compounds as a part of π-conjugated structures with fluorescent properties, along with low toxicity of a majority of isoxazole derivatives, these heterocycles can be used for the study of biological objects. Thus, the research of novel fluorescent sensors bearing isoxazole cycle is an actual problem and a new direction of organic and medicinal chemistry. In the course of the experimental work of the Project, it is proposed to develop synthetic approaches to two novel structural types of isoxazole derivatives: crown/aza-crown substituted 5-styrylisoxazoles and BF2-complexes of isoxazol substituted 1,3-diketones. These compounds are of interest for use as molecular sensors and fluorophores with valuable photophysical properties, as well as for studying various types of biological activity. The research will include the main directions listed below. A general method for the synthesis of 5-styrylisoxazoles containing a crown ether moiety at position 5 of the heterocycle will be developed using the condensation reaction of 3 aryl\hetaryl-5-methyl-4-nitroisoxazoles with crown-containing aromatic aldehydes. To synthesize 5-styrylisoxazoles containing a crown ether moiety at position 3 of the heterocycle two synthetic approaches will be examined. The first approach is based on the cross-coupling reaction of 5-methyl-4-nitroisoxazoles bearing a (halogen)aryl moiety at position 3 of the heterocycle with aza-crown ethers and subsequent use of the resulting products in condensation reactions with aromatic aldehydes. The second approach involves the preparation of 4-nitroisoxazole-3-carboxylic acid amides by the acylation reaction of azacrown ethers, cyclen and cyclam derivatives and the use of the resulting amides in the condensation reactions with aromatic aldehydes. It is also proposed to develop a method for the synthesis of previously unknown isoxazole-containing 1,3-diketones and BF2-complexes based on them. For this purpose, ester condensation reactions of aromatic or heterocyclic methyl ketones with isoxazole-3-carboxylic acid esters with various substituents and functional groups in position 5 of the heterocycle will be used. To estimate the impact of substituents in position 4 of the isoxazole ring on the photophysical and sensory properties of BF2-complexes of 1,3-diketones, it is planned to obtain esters of 4-aryl- and 4-alkynyl-isoxazole-3-carboxylic acid using the cross-coupling reactions of the corresponding 4-halogen-substituted isoxazoles. To obtain fluorescent sensors for anions, a BF2-complex of 1,3-diketone containing pyrrole and isoxazole fragments will be synthesized. To this end, we propose a synthetic scheme that includes the synthesis of 3-(pyrrol-2-yl)-4-nitroisoxazole, its subsequent reaction with malonic acid chloride to form 1,3-diketone, and the final formation of the corresponding BF2-complex. For the synthesized fluorescent sensors based on isoxazole, photophysical and sensory properties will be studied in detail, as well as a screening of biological activity will be carried out. In particular, it is planned to record absorption and fluorescence spectra, study the sensory properties with respect to metal cations: Li, K, Na, Mg, Ca, Ba, Al, Cr, Fe, Co, Ni, Mn, Fe, Cu, Cd, Pb, Ag, Hg, Y, Ga, In, Sr, to anions (F, Cl, Br, I, AcO) and srudy the anticancer, antibacterial, antifungal, antiviral activities of obyained compounds. The obtained information will make it possible to estimate the effect of heterocyclic fragments on the fluorescent properties and would be valued to targeted synthesis of structures with unique physicochemical properties necessary for use in fluorescence microscopy.

ходе выполнения Проекта будет проведено многоплановое исследование, включающее: 1) разработку синтетических подходов к получению новых 5-стирилизоксазолов, содержащих краун\азакраун-эфирные фрагменты в положениях 3 и\или 5 гетероцикла, в результате чего будут получены производные изоксазола с флуоресцентными и сенсорными свойствами; 2) разработку метода синтеза ранее неизвестных BF2-комплексов изоксазолсодержащих 1,3-дикетонов, представляющих интерес в качестве флуоресцентных сенсоров и соединений для биомедицинских исследований методом флуоресцентной микроскопии; 3) синтез представительных серий новых производных изоксазола, для которых будут детально изучены фотофизические и сенсорные свойства, а также проведен скрининг различных типов биологической активности В результате выполненной экспериментальной работы по Проекту будут впервые получены селективные флуоресцентные молекулярные сенсоры на основе краун\азакраунсодержащих стирилизоксазолов, которые могут быть использованы, в том числе, для изучения роли катионов металлов в регуляции биологических процессов в живых клетках. Также будет получена библиотека неизвестных ранее дифторборных комплексов изоксазолсодержащих 1,3-дикетонов, которые могут быть использованы в качестве флуоресцентных красителей, а также в качестве сенсоров на анионы. Изучение фотофизических свойств (спектров поглощения и флуоресценции) флуорофоров на основе изоксазола позволит получить данные, имеющие фундаментальное значение для оценки влияния гетероциклических фрагментов на флуоресцентные свойства соединений, а также позволит направленно синтезировать структуры с уникальными физико-химическими свойствами, необходимыми для использования во флуоресцентной микроскопии. Для синтезированных в работе производных изоксазола будет проведен скрининг антибактериальной, противогрибковой, противовирусной и противораковой активности.

К настоящему времени имеется следующий научный задел: 1) Разработан общий препаративный метод синтеза ранее труднодоступных 5-нитроизоксазолов, содержащих дополнительные функциональные группы в положении 3 гетероцикла, на основе новой реакции гетероциклизации электрофильных алкенов под действием комплекса тетранитрометан-триэтиламин. 2) Разработан общий препаративный метод синтеза 3-арил\гетарил-4-нитроизоксазолов, содержащих различные алкильные или арильные группы в положении 5 гетероцикла, на основе найденной реакции гетероциклизации арилзамещенных винилкетонов под действием трет-бутилнитрита в среде диоксан-вода. 3) С использованием реакций ароматического нуклеофильного замещения нитрогруппы 5-нитроизоксазолов создана универсальная стратегия функционализации изоксазольного цикла, позволяющая синтезировать широкий спектр практически значимых полифункционализированных гетероциклов, представляющих интерес для органической и медицинской химии. 4) На основе реакций восстановления нитрогруппы 5-нитроизоксазолов был разработан региоселективный методы синтеза 5-аминоизоксазолов и неизвестных ранее 5-гидроксиламиноизоксазолов, содержащих тетрагидрофурановый фрагмент в молекуле. 5) Разработаны критерии ЯМР спектральных отнесений, изучена проблема региохимии замещенных нитроизоксазолов и их производных. 6) Для серий различных производных изоксазола, синтезированных с использованием разработанных нами методов, было проведено исследование антибактериальной, противогрибковой, противовирусной, противоопухолевой, антиоксидантной и нейропротекторной типов активности, в результате чего был найден ряд активных структур, представляющих интерес для дальнейшего поиска соединений-лидеров.

В ходе выполнения Проекта были разработаны подходы к синтезу и изучены фотофизические и биологические свойства флуорофоров двух структурных типов: 1) 4-нитро-5-стирилизоксазолы, содержащие макроциклический сенсорный фрагмент в молекуле и 2) BF2 комплексы изоксазолсодержащих 1,3-дикетонов. На примере модельного 5-стирилизоксазола ((E)-5-(4-(метилтио)стирил)-3-(нафт-1-ил)-4-нитроизоксазола) были проведены расширенные исследования фотофизических свойств флуорофоров на основе стирилизоксазолов. С помощью ЯМР 1H и флуоресцентной спектроскопии была изучена фотостабильность 5-стирилизоксазолов на примере модельного (E)-5-(4-(метилтио)стирил)-3-(нафт-1-ил)-4-нитроизоксазола. Было показано, что этот 5-стирилизоксазол под действием света с длиной волны в 365 нм претерпевают E/Z изомеризацию, в ходе которой E-изомер частично превращается в Z-изомер. Методом флуоресцентной спектроскопии было показано, что интенсивность максимума флуоресценции (E)-изомера уменьшается с увеличением длительности облучения, что, по-видимому, связано с меньшим квантовым выходом флуоресценции (Z)-изомера. На примере (E)-5-(4-(метилтио)стирил)-3-(нафт-1-ил)-4-нитроизоксазола для 5-стирилизоксазолов был продемонстрирован положительный сольватохромизм с батохромным сдвигом полосы эмиссии при увеличении полярности растворителя. Анализ этого эффекта с помощью уравнения Липперта-Матага показал, что изменение стоксового сдвига находится в линейной зависимости от ориентационной поляризуемости растворителя. Таким образом, было показано, что для большинства растворителей их влияние на флуоресцентные свойства стирилизоксазолов обусловлено физическими характеристиками. Линейная зависимость кривой Липперта-Матага является также косвенным аргументом в пользу наличия только одного возбужденного состояния для исследуемого соединения, что было подтверждено данными полученными при изучении кинетики затухания флуоресценции. Было показано, что зависимость интенсивности флуоресценции от времени аппроксимируется моноэкспоненциальной функцией, что подтверждает, что для (E)-5-(4-(метилтио)стирил)-3-(нафт-1-ил)-4-нитроизоксазола характерно одно возбужденное состояние, время жизни которого составляет 0.9 нс Данные рентгеноструктурного анализа, полученные для (E)-5-(4-(метилтио)стирил)-3-(нафт-1-ил)-4-нитроизоксазола показали, что фрагмент изоксазола и π-система стирильного фрагмента лежат в одной плоскости, однако плоскость нафтильного заместителя в положении 3 изоксазольного цикла находиться под углом к плоскости изоксазол-стирильного фрагмента. В связи с этим, заместители в ароматическом фрагменте, расположенном в положении 3 гетероцикла, оказывают слабое влияние на флуоресцентные свойства стирилизоксазолов. Для изучения влияния заместителя в положении 3 изоксазольного цикла на флуоресцентные свойства изучаемых флуорофоров был также получен модельный 3-амино-5-стирилизоксазол ((E)-5-(4-(метилтио)стирил)-4-нитроизоксазол-3-амин). Было найдено, что кислотность среды и присутствие ионов металлов не оказывает существенного влияния на изменение флуоресцентных свойств данного соединения. Таким образом, была дополнительно показана меньшее влияние природы заместителей в положении 3 изоксазольного цикла при дизайне флуорофоров и сенсоров в ряду 5-стирилизоксазолов. В ходе работы был разработан метод синтеза 5-стирилизоксазолов, содержащих макроцикл в положении 3 или в положении 5 в ароматическом цикле стирильного фрагмента. Для введения макроциклической сенсорной части в ароматическое кольцо стирильного фрагмента был разработан подход, основанный на реакции конденсации 3-нафтил-5-метил-4-нитроизоксазола с ароматическими альдегидами, содержащими фрагмент краун-эфира. Для этой цели были получены два альдегида, содержащих бензокраунэфирные фрагменты с различным размером цикла, и два альдегида, содержащих краунэфиры с различным размером цикла, аннелированные с бифенильным фрагментом. Также был получен альдегид, содержащий фрагмент азакраун-эфира. Указанные альдегиды были введены в реакции конденсации с 3-(нафт-1-ил)-5-метил-4-нитроизоксазолом, в результате были получены новые 5-стирилизоксазолы, содержащие сенсорный фрагмент в стирильном заместителе (5 соединений). Для введения макроциклического фрагмента в положение 3 изоксазольного цикла было предложено два подхода. Первый подход предполагал использование реакций кросс-сочетания азакраун-эфиров с 5-метил-4-нитроизоксазолами, содержащими в положении 3 гетероцикла арилборные фрагменты (реакция Чана-Лама) или бром-\иодарильные заместители (реакция Бухвальда-Хартвига). Однако оказалось, что в условиях реакций кросс-сочетания происходит деструкция изоксазольного цикла. Второй подход предполагал использование реакции ацилирования азакраун-эфиров хлорангидридом 5-метил-4-нитроизоксазол-3-карбоновой кислоты. С использованием данного подхода нам удалось получить серию краунсодержащих амидов 5-метил-4-нитроизоксазол-3-карбоновой кислоты с необходимыми сенсорными фрагментами в амидной части (6 соединений). Полученные амиды 5-метил-4-нитроизоксазол-3-карбоновой кислоты были введены в реакцию конденсации с альдегидами, содержащими нафтофурановый и периленовый фрагменты, в результате чего была получена серия 5-стирилизоксазолов с различными макроциклами (азакраун-эфиры, циклены, цикламы) в положении 3 гетероцикла (8 соединений). Было показано, что 5-стирилизоксазолы содержащие макроциклический фрагмент в положении 3 изоксазольного цикла характеризуются высокими для данной серии соединений значениями квантовых выходов (ψ до 15%) и коэффициента экстинкции (ε до 40000 М-1*см-1). В то же время большинство 5-стирилизоксазолов с сенсорным заместителем в стирильном фрагменте обладают слабой флуоресценцией (квантовый выход ψ до 0.5% и коэффициент экстинкции ε до 7000 М-1*см-1). Также показано, что периленсодержащие 5-стирилизоксазолы, а также 5-стирилизоксазол, содержащий азакраун в стирильном фрагменте, имеют максимумы полос флуоресценции при длине волны более 600 нм. В ходе изучения сенсорных свойств было найдено, что 5-стирилизоксазолы с макроциклическим фрагментов в положении 3 гетероцикла имеют слабый отклик на различные ионы металлов. Однако, в ходе дальнейших исследований возможности взаимодействия с биомакромолекулами, было показано, что 16-({5-[(E)-2-нафто[2,1-b]фуран-2-илвинил]-4-нитроизоксазол-3-ил}карбонил)-1,4,7,10,13-пентаокса-16-азациклооктадекан в водной среде при добавлении бычьего сывороточного альбумина (БСА) образует устойчивый комплекс с биомолекулой. Комплекс с БСА характеризуется константой Kb = (1.7±0.1)×104 M-1, при этом при образовании комплекса наблюдается смещение максимума флуоресценции в синюю область и увеличение интенсивности флуоресценции. В отличие от 5-стирилизоксазолов с макроциклическим фрагментов в положении 3 гетероцикла, 5-стирилизоксазолы с сенсорным фрагментом в стирильном заместителе показали высокий отклик на различные катионы металлов. В результате было найдено, что соединение (E)-3-(нафт-1-ил)-4-нитро-5-(2-(2,3,5,6,8,9,11,12-октагидробензо[b][1,4,7,10,13]пентаоксациклопентадецин-15-ил)винил)изоксазол образует устойчивый комплекс с Mg(II), а для соединения (E)-3-(нафт-1-ил)-4-нитро-5-(4-(2,3,5,6,8,9,11,12-октагидробензо[b][1,4,7,10,13]пентаоксациклопентадецин-15-ил)стирил)изоксазола со слабой флуоресценцией лиганда наблюдается сильное разгорание флуоресценции в присутствии биологически значимых ионов цинка, кальция и магния. Соединение (E)-3-(нафт-1-ил)-4-нитро-5-(4-(2,3,5,6,8,9,11,12-октагидробензо[b][1,4,7,10,13]пентаоксациклопентадецин-15-ил)стирил)изоксазол дает селективный отклик на ионы лантана при слабом отклике на другие редкоземельные металлы, а для (E)-13-(4-(2-(3-(нафт-1-ил)-4-нитроизоксазол-5-ил)винил)фенил)-1,4,7,10-тетраокса-13-азациклопентадекан наблюдается селективное тушение флуоресценции в присутствии ионов индия, алюминия или свинца. Для серии макроциклических 5-стирилизоксазолов была также изучена противораковая активность. Было показано, что большинство соединений обладает низкой цитотоксичностью, за исключением 3-нафтилизоксазолов, которые проявляют активность по отношению к ряду раковых клеток в МТТ тесте в микромолярном диапазоне концентраций. В рамках Проекта было впервые изучено влияние изоксазольного цикла на флуоресцентные свойства соответствующих BF2-комплексов 1,3-дикетонов. В этой части работы с помощью различных подходов, включающих использование реакции гетероциклизации 1,3-дикетонов под действием гидроксиламина, нуклеофильное ароматическое замещение в ряду 5-нитроизоксазолов, электрофильное ароматическое замещение и реакции кросс-сочетания, была получена серия эфиров изоксазол-3-карбоновых кислот с различными заместителями в положении 4 и 5 изоксазольного цикла. Найдены оптимальные условия реакции конденсации сложных эфиров изоксазол-3-карбоновых кислот с ароматическими и гетероциклическими метилкетонами. Полученная в ходе реакции конденсации большая серия изоксазолзамещенных 1,3-дикетонов (23 соединения) были использованы для получения соответствующих BF2 комплексов, содержащих ароматические или гетероциклические заместители различной электронной природы в ароматическом цикле и в положениях 4 и 5 изоксазольного цикла (23 соединения). Для всех соединений были зарегистрированы спектры поглощения и флуоресценции. В ходе анализа полученных спектральных данных был выявлен ряд закономерностей: 1) Наличие мезомерных доноров (OMe, SMe) в ароматическом цикле или использование полициклических ароматических и бифенильных заместителей увеличивает квантовый выход флуоресценции. Наибольшая интенсивность флуоресценции наблюдалась для BF2 комплексов, содержащих метоксигруппу в ароматическом кольце, при этом наиболее слабая флуоресценция наблюдалась при наличии в молекуле CF3-группы – сильного индуктивного акцептора. 2) Наличие сильного мезомерного донорного заместителя в изоксазольном цикле приводит к резкому падению интенсивности флуоресценции, однако введение в изоксазольный фрагмент алкильных заместителей (индуктивных доноров) приводит к соединениям с максимальным значением квантового выхода (ψ > 80%). На примере BF2 комплексов с 4-метилизоксазольным и 4-метоксифенильным фрагментами, обладающих высокими квантовыми выходами флуоресценции, был продемонстрирован положительный сольватохромизм и были изучены сенсорные свойства на катионы металлов и различные анионы. Было показано, что для изучаемых флуорофоров наблюдается гашение флуоресценции в присутствии анионов фтора. Для ряда 1,3-дикетонов и BF2-комплексов на их основе был проведен скрининг противораковой активности. Было показано, что исследуемые соединения в целом характеризуются низкой цитотоксичностью. Таким образом, с учетом низкой токсичности изоксазолсодержащие BF2-комплексы могут быть использованы в биоимиджинге.