Многомасштабное моделирование сложных химических реакций в фотоактивных белкахНИР

Multiscale modeling of complex chemical reactions in photoactive proteins

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Многомасштабное моделирование сложных химических реакций в фотоактивных белках
Результаты этапа: 1. В работах 2022 г. по данному проекту, выполненных методами молекулярного моделирования, полностью характеризован механизм фото-индуцированной реакции гидратации хромофора белка Dreiklang (ON → OFF переход), согласующийся со всей совокупностью структурных и спектроскопических экспериментальных данных. Важной предпосылкой данной серии расчетов и анализа был полученный ранее [Sen, T., Polyakov I., Grigorenko B., et al., J. Phys. Chem. B 2021, 125, 757] результат, что возбуждение системы ON из основного состояния S0 приводит к практически изоэнергетическим уровням S1 и CT. Символ CT (charge-transfer) относится к возбужденному электронному состоянию с переносом электрона на хромофор от расположенного рядом амино-кислотного остатка Tyr203, причем плоскости фенольных колец хромофора и Tyr203 практически копланарны. Рассматривались два типа молекулярных моделей – полная модель белка (см. Рис.1а) и 158-атомная кластерная модель, содержащая хромофор и окружающие его группы. Полная модель использовалась для расчетов структур и энергий на потенциальной поверхности основного электронного состояния методом квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ). Кластерная модель и методы квантовой химии использовались для анализа поведения системы при электронном возбуждении, для нахождения структур на поверхности возбужденного состояния, поиска точек конических пересечений и для расчетов спектров поглощения от стационарных точек на основном состоянии. 2.Монооксигеназа RutA играет важную роль в метаболизме ксенобиотиков, в частности, катализирует первую стадию деградации урацила. Научный интерес представляет детальный механизм активации молекулярного кислорода этим флавин-содержащим ферментом, в составе которого нет металлических центров, обычно отвечающих в биомолекулах за превращение молекулы кислорода в триплетном состоянии в активные формы. В соответствие с планом, в работах первого года проекта рассматривалась реакция с участием активного центра фермента RutA, молекулярного кислорода O2 и урацила. Формулы реактантов приведены на Рис. 5. Макромолекула RutA содержит нековалентно-связанный кофактор FMN (flavin mononucleotide) с восстановленной формой флавина. Предметом текущих исследований является выяснение, по какому из атомов изоаллоксазинового кольца флавина (С4а, N5, C6) происходит первичное присоединение атома кислорода активированной молекулы O2. Одну из основных проблем моделирования представляет начальная структура реакционного комплекса RutA-FMN-O2-uracil – экспериментально крайне сложно зафиксировать положение молекулы кислорода в полости белковой макромолекулы. В работе [A. Matthews, et al., Nature Chemical Biology 2020, 16, 556] по результатам рентгеноструктурного анализа определены координаты тяжелых атомов комплекса, полученные при давлении газа кислорода 15 бар, однако, отмечаются трудности с расшифровкой структуры PDB 6TEG, помещенной в базу данных белковых структур (PDB). С теоретической стороны, использование традиционных методов молекулярной механики (ММ) для моделирования структур биомолекулярных комплексов с включенными молекулами кислорода сталкивается с проблемой надежных силовых полей, особенно учитывая то обстоятельство, что при приближении молекулы O2 к восстановленному флавину происходит частичный перенос электронной плотности на кислород (что и является причиной активации кислорода). Поэтому в работах по проекту были использованы как методы классической молекулярной динамики (МД), так и методы MД с потенциалами квантовой механики/молекулярной механики (КM/MM MД). В первом случае использовалась программа NAMD с силовым полем CHARMM36 с дополнительными параметрами для молекул FMN и O2, взятыми из литературных данных. Для расчетов методом КM/MM MД использовался оригинальный интерфейс программы NAMD и программы квантовой химии TeraChem.
2 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Многомасштабное моделирование сложных химических реакций в фотоактивных белках
Результаты этапа: A) Механизм химической реакции заключительной стадии формирования флуоресцентного состояния в белке Venus66azF Этот проект является продолжением проекта по моделированию формирования хромофора в белке Venus66azF (Chemical science, 2021, 12, 7735-7745, https://doi.org/10.1039/D0SC06693A). В данной работе мы рассматриваем варианты на основе белков superfolderGFP и Venus, в которых аминокислота Tyr66, ответственная за формирование фенольного кольца (P-кольца) созревшего хромофора в GFP-подобных белках, заменена на azF (рисунок A1). @ Рисунок A1 приведен в приложенном файле Рисунок A1. 4-азидо-L-фенилаланина (azF) В соответствующих белках, названных sfGFP66azF и Venus66azF, фотолиз фенилазида высвобождает N2, что приводит к образованию нитренового промежуточного соединения. Арилнитреновые интермедиаты, в свою очередь, инициируют различные химические реакции, которые, в частности, могут приводить к образованию стабильных флуоресцентных частиц. Предварительно предполагалось ранее, возможным путем реакции является восстановление нитрена до амина, однако детальный механизмы реакции неизвестен. Цель настоящей работы – моделирование химических реакций, инициируемых арилнитреновыми интермедиатами после фотохимического распада азидной группы в sfGFP66azF и Venus66azF. Главный вывод этого моделирования заключается в том, что восстановление нитренового промежуточного соединения до хромофора фениламина сочетается с окислением близлежащей боковой цепи гистидина, His148, в обоих белках. Химические реакции образования фениламинсодержащих хромофоров в вариантах sfGFP и Venus моделировали, исходя из фенилнитреновых интермедиатов. Имеющиеся кристаллические структуры белковых макромолекул служили источником атомных координат тяжелых атомов. Молекулярные модели были созданы с использованием структур исходного варианта белков с заменой гидроксильной группы Tyr66 на азот. Были выполнены серии расчетов на поверхности потенциальной энергии методом КM/MM с целью построить профили потенциальных энергий вдоль пути реакции. Для этого использовался пакет NWChem. Квантово-механическая часть включала хромофор, боковые цепи His148, Arg96, Ser205, Glu222, Tyr203, фрагменты основной цепи и 28 молекул воды (всего 192 атома). Для QM части использовался DFT метод с PBE0 функционалом и базисом 6-31G*, для ММ части параметры силового поля AMBER99. На рисунке A2 показан путь реакции образования фениламинсодержащего хромофора в белке Venus66azF. @ Рисунок A2 приведен в приложенном файле Рисунок A2. Путь реакции от системы, содержащей His148 и phenyl nitrene, к системе содержащий оксо-His и фениламин в Venus66nF. Профиль реакции синим цветом соответствует триплетному состоянию системы. Красные точки и красная линия соответствуют синглетному состоянию. В начале пути система находится в триплетном состоянии, т.к. триплетное состояние является основным для этой системы. Молекула воды, которая инициирует реакцию REAC-INT1, обозначена на рисунке. Атом водорода направляется к азоту хромофора, а OH радикал присоединяется к атому Cs(His148). Образуется бирадикал Chro· и His148·-OH. Далее по цепочке водородных связей происходит перераспределение протонов на атом азота хромофора с другой стороны. Из графика на рисунке A2 видно, что в INT1 синглетное состояние также выше триплетного, как и в REAC. И только в INT2 синглетное состояние опускается ниже триплетного, в синглетном состоянии происходит перенос электрона с His148·-OH на хромофор. Второй этап реакции – это реорганизация протона с Cs(His148) на Cγ(His148) как показано на рисунке A3. @ Рисунок A3 приведен в приложенном файле Рисунок A3. В синглетном состоянии через барьер в 9 kcal/mol происходит перегруппировка протона с Cδ на Cγ Еще один аспект, который рассмотрен в статье, являются масс-спектрометрические исследования Venus66azF. Масс-спектры Venus66azF при УФ-облучении в течение 30 мин показали, что полная длина Venus66azF составляет 30806 Да, при этом преобразование в амин приводит к потере 26 Да (потеря N2 и протонирование фенилнитрена). Это оставляет дефицит массы в 15 Да по сравнению с наблюдаемым пиком, который можно объяснить потерей водорода и последующим добавлением кислорода к Cδ-His148. Сделан вывод, что основной пик соответствует массе, которая предположительно представляет собой разновидность Cδ-оксо-His (рисунок A4(b)) @ Рисунок A4 приведен в приложенном файле Рисунок A4. Масс-спектры Venus66azF при УФ-облучении в течение 30 мин Таким образом, нами in silico охарактеризован механизм реакции восстановления арилнитреновых интермедиатов, образующихся при светоиндуцированном распаде хромофоров в вариантах GFP-подобных белков sfGFP66azF и Venus66azF, содержащих неканонический аминокислотный остаток п-азидо фенилаланин вместо тирозина (остаток 66) внутри хромофора. Применение подходов, основанных на КМ/ММ, позволило оценить энергетические профили реакций от нитреновых интермедиатов до аминов и показать, что восстановление арилнитренсодержащего хромофора сопровождается окислением и возможным дальнейшим распадом боковой цепи гистидина His148, расположенной вблизи P-кольца хромофора. Работа принята к печати в журнал Organic & Biomolecular Chemistry. B) Компьютерное моделирование взаимодействия молекулярного кислорода с белком miniSOG (светоиндуцированный источник синглетного кислорода) Экспериментальные и теоретические исследования реакций белков с молекулярным кислородом представляют собой один из самых сложных предметов в науках о жизни. Химически инертная молекула O2 в основном триплетном спиновом состоянии (3Σg-) может активироваться внутри белковых полостей, инициируя реакции, которые часто приводят к созданию активных форм кислорода, таких как синглетный кислород 1Δg, супероксид O2·- и перекись водорода H2O2 [Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 4642; Chem. Rev. 2018, 118, 1742–1769]. В данной работе мы рассмотрели небольшой флавинзависимый белок miniSOG (синглетный кислород генератор), который был создан как светоиндуцированный источник синглетного кислорода. Белок miniSOG используется как в качестве фотосенсибилизатора для раковых клеток, так и в качестве маркера для флуоресцентной визуализации. Понимание фотофизического свойств miniSOG требует знания структуры белка, желательно с захваченными молекулами кислорода. На рисунке B1 показаны химические формулы FMN и RF, а также общепринятую нумерацию атомов в хромофоре — изоаллоксазиновое кольцо FMN или RF. Целью сделанных мутаций в структуре исходного miniSOG было увеличить квантовый выход генерации синглетного кислорода, чем в наблюдаемом исходном варианте. Одной из причин низкого квантового выхода (0,03 против 0,51 для FMN в растворах) объясняется ограниченным доступом триплетного молекулярного кислорода к изоаллоксазиновому кольцу FMN внутри белка. Целью настоящей работы является предсказание мест связывания кислорода в белке miniSOG с помощью молекулярно-динамического моделирования (МД) с использованием потенциалов взаимодействия силового поля, а также с использованием QM/MM (квантовой механики/молекулярной механики) потенциалов. @ Рисунок B1 приведен в приложенном файле Рисунок B1. Химические формулы FMN и RF и условное обозначение атомов изоаллоксазинового кольца. Кристаллические структуры PDB ID 6GPU и 7QF4 использовались как стартовые структуры для построения полноатомных молекулярных модельных систем miniSOG с кофакторами FMN и RF. Соответствующие модели мы обозначили как miniSOG[FMN] и miniSOG[RF] соответственно. @ Рисунок B2 приведен в приложенном файле Рисунок B2. Вид модельных систем, созданные по кристаллическим структурам. Желтый и оранжевый цвета относятся к структуре PDB ID 6GPU; голубой и синий цвета относятся к структуре PDB ID 7QF4. Классические траектории МД моделировались с помощью программного пакета NAMD 3.0 с использованием изотермического изобарического (NPT) ансамбля при P = 1 атм и T = 300К с контролем постоянного давления с использованием модифицированного метода Нозе-Гувера, в котором динамика Ланжевена используется для управления колебаниями баростата. Периодические граничные условия и алгоритм Эвальда для учета дальнодействующего электростатического взаимодействия применялись, шаг интегрирования был установлен на 2 fs. В общей сложности для модели miniSOG[FMN] получено 3300 ns по 5 траекториям, а для модели miniSOG[RF] получено 7555 ns по 6 траекториям. На рисунке B3 суммированы результаты классического МД-моделирования. Кислород связывающие карманы A и B, выделенные желтым цветом на рисунке B3, были практически одинаковыми в обеих модельных системах: miniSOG[FMN] и miniSOG[RF]. @ Рисунок B3 приведен в приложенном файле Рисунок B3. Кислород связывающие карманы в miniSOG[FMN] и miniSOG[RF] Таким образом, результаты настоящего МД-моделирования позволили нам идентифицировать несколько кислород связывающих карманов внутри белковых макромолекул в miniSOG[FMN] и miniSOG[RF]. Идентифицированный карман А (см. рисунок B4) показал наиболее подходящее расположение молекулы кислорода, прямо над изоаллоксазиновым кольцом, и эту позицию следует рассматривать в первую очередь в дальнейших исследованиях фотоиндуцированных процессов в miniSOG. @ Рисунок B4 приведен в приложенном файле Рисунок B4. Флавин-кислородный комплекс в модельной системе miniSOG[RF], наблюдаемый в кадре QM/MM MD траектории (область кармана А) Моделирование c использованием классического силового поля, а также гибридным методом QM/MM MD позволило нам локализовать места связывания молекулы кислорода вблизи флавинового хромофора для двух вариантов miniSOG (FMN и RF), где молекула кислорода находится на расстоянии около 3,3 Å до центра геометрии изоаллоксазинового кольца хромофора. Результаты работы опубликованы в статье: Polyakov I.V., Kulakova A.M., Nemukhin A.V. “Computational Modeling of the Interaction of Molecular Oxygen with the miniSOG Protein—A Light Induced Source of Singlet Oxygen”, Biophysica (MDPI), 2023, V3, N2, pp.252-262, https://doi.org/10.3390/biophysica3020016 Вторая часть работы по miniSOG относится к моделированию непосредственно самой реакции окисленного флавина с кислородом. Эта часть проекта в настоящее время находится в работе, построена модель, сделаны пилотные расчеты. В работе (https://doi.org/10.1038/s41598-019-38955-3) представлены 3 возможных сценария: @ Рисунок B5 приведен в приложенном файле Рисунок B5. Модель фотосенсибилизации кислорода с помощью miniSOG. Используя результаты опубликованной статьи (Polyakov I.V., Kulakova A.M., Nemukhin A.V. “Computational Modeling of the Interaction of Molecular Oxygen with the miniSOG Protein—A Light Induced Source of Singlet Oxygen”, Biophysica (MDPI), 2023, V3, N2, pp.252-262, https://doi.org/10.3390/biophysica3020016) по положению кислорода в активном сайте белка, была сделана QM/MM оптимизация структуры белка с флавином и кислородом на поверхности основного состояния. @ Рисунок B6 приведен в приложенном файле Рисунок B6. Структура активного сайта белка miniSOG Для полученной геометрии был рассчитан спектр возбуждения с основного состояния на несколько возбужденных состояний. Расчет проводился методом MCQDPT2 на CASSCF орбиталях. Результат приведен на рисунке B7. @ Рисунок B7 приведен в приложенном файле Рисунок B7. Рассчитанный спектр для активного сайта белка miniSOG. Полученные данные демонстрируют порядок электронных уровней в системе флавин-3O2 (триплетный кислород). Таким образом, можно предположить, что существуют 2 определяющих сценария: 1) Поглощение света (441 nm) – флуоресценция (513 nm) 2) Поглощение света (441 nm) – переход на триплетную поверхность – далее реакция кислорода с флавином в триплетном состоянии Дальнейшее моделирование предполагает: 1) Расчет спин-орбитального взаимодействия для оценки вероятности синглет-триплетного перехода; 2) QM/MM и QM/MM-MD моделирование взаимодействия триплетного кислорода с флавином в триплетном состоянии; 3) Переход из триплетного состояния в синглетное C) QM/MM моделирование функционализации флавина в RutА монооксигеназы Данный проект связан с предыдущим тем, что белок RutA также является флавинсодержащим белком, где флавин находится в восстановленной форме. Этот факт делает возможным моделирование на поверхности потенциальной энергии основного состояния, что позволяет нам рассматривать много сценариев взаимодействия молекулярного кислорода с флавином без больших затрат компьютерных ресурсов. А полученная информация поможет в построении модели для белка miniSOG. Оксигеназная активность флавинзависимого фермента RutA обычно связана с образование флавин-кислородных аддуктов в активном центре фермента. В данной работе представлены результаты моделирования гибридным методом квантовой механики/ молекулярной механики (QM/MM) возможных путей реакций, реализующихся в различных триплетных комплексах: молекулярный кислород и восстановленный флавинмононуклеотид (FMN) (см. рисунок C1), которые образуются в различных местах захвата молекулярного кислорода. @ Рисунок C1 приведен в приложенном файле Рисунок C1. Восстановленная и окисленная формы флавина В центре показано изоаллоксазиновое кольцо с принятыми обозначениями атомов В разделе (B) представлены результаты моделирования реакции кислорода с флавином в окисленном состоянии, тогда как в этом разделе рассматриваются различные сценарии взаимодействия кислорода с восстановленной формой флавина. Принципиальная разница между этими двумя проектами состоит в том, что в первом случае процессы начинаются с возбуждения системы светом, тогда как в случае с восстановленным флавином реакция с кислородом происходит на потенциальной поверхности основного состояния. Согласно результатам молекулярно-динамического моделирования, комплекс флавин-кислород может располагаться как на re-, так и на si-side изоаллоксазинового кольца флавина (рисунок C2). @ Рисунок C2 приведен в приложенном файле Рисунок C2. FMN и ближайшие молекулярные группы на re-side (Asn134 и Thr105) и на si-side. На этом и других рисунках атомы углерода показаны зеленым цветом, кислорода - красным, азота - синим цветом, а водород белым Насколько нам известно, компьютерное моделирование образования продуктов флавин кислородного взаимодействия внутри белковых полостей в монооксигеназах методом QM/MM не проводилось. В данной работе мы построили модельную систему RutA–FMNred–O2, используя координаты тяжелых атомов кристаллической структуры PDB (ID 6SGG). Метод QM(DFT)/MM применяется для локализации нескольких структур комплексов молекулы кислорода в триплетном состоянии с аминокислотами вокруг изоаллоксазинового кольца флавина. Различные положения молекулы кислорода в RutA были обнаружены в нашем моделировании. Далее, используя различные места захвата молекулы кислорода, мы моделируем образование продуктов флавин-кислородной реакции. Помимо структур флавин-кислородных комплексов RutА, мы рассчитали энергии возбуждения переходов S0 → S1 и S0 → S2 и соответствующие силы осцилляторов, которые позволяют оценить поглощение в электронных спектрах. Для расчета спектров мы использовали расширенную многоконфигурационную квазивырожденную теорию возмущений второго порядка (XMCQDPT2). Из сделанного моделирования можно сделать ряд важных наблюдений для полученных флавин-кислородных комплексов. Во-первых, молекулы кислорода могут быть расположены по обе стороны (re-side и si-side) изоаллоксазинового кольца (см. Рисунок C2). Во-вторых, в каждом найденном кислород-флавиновом комплексе молекула кислорода идентифицирована, как супероксидный анион О2-, то есть при подходе к восстановленному флавину происходит спонтанный перенос заряда с флавина на кислород. В-третьих, энергии триплетных и синглетных состояний в таких флавин-кислородных комплексах почти вырождаются. В подтверждение второго и третьего выводов проанализируем результаты расчетов методом полного активного пространства самосогласованного поля (CASSCF) полученных комплексов флавин-молекула кислорода (ниже). Таким образом, полученное вырождение дает нам основание предполагать триплет-синглетный переход на потенциальных поверхностях. На пути такого триплет системного интер-кроссинга возникает несколько сценариев образования продуктов реакции. Далее обсудим продукты реакции восстановленного флавина с молекулой кислорода для различных мест захвата молекулярного кислорода в активном сайте белка. Сценарий 1: Образование C4a-пероксифлавина. На рисунке C3 слева показан комплекс флавин-кислород в белковом окружении (минимум на поверхности потенциальной энергии в триплетном спиновом состоянии, Комплекс-1), на этом и других рисунках мы показываем критические расстояния (в Å) между тяжелыми атомами, также выделены водородные связи, которые образуют молекулы воды с молекулой кислорода. @ Рисунок C3 приведен в приложенном файле Рисунок C3. (a) Комплекс Flred-O2 в триплетном состоянии (Комплекс-1) образуется на si-side. (b) FlC4aOO- в синглетном состоянии. На этом и других рисунках расстояния указаны в Å. Для Комплекса-1 (рисунок C3(a)) отметим, что расстояние Ox1-Ox2 в молекуле кислорода увеличивается с 1,20 Å характерного для триплетного состояния молекулы до 1,32 Å, что свидетельствует об образовании супероксид-аниона. Последний образует водородные связи с четырьмя ближайшими молекулами воды, с типичными для водородных связей расстоянием между атомами кислорода 2,6 - 2,9 Å). Атом C4a изоаллоксазинового кольца является ближайшим к молекуле кислорода с расстоянием C4a-Ox1 3,21 Å; расстояние N5-Ox1 составляет 3,89 Å. Взяв структуру Комплекса-1 (рисунок C3(a)) в качестве отправной точки для оптимизации геометрии, методом QM/MM на поверхности потенциальной энергии синглетного состояния, мы приходим к структуре, показанной на рисунке C3(b). В этой системе атом кислорода Ox1 ковалентно связан с C4a, что приводит к искажению изоаллоксазинового кольца. Энергия структуры RutА с С4а-пероксифлавином (рисунок B3b) на 16,8 ккал/моль ниже, чем энергия реагентов (рисунок C3(a)). Энергия возбуждения S0 → S1 модельной системы RutА с С4а-пероксифлавином (рисунок C3(b)) рассчитанная методом XMCQDPT2 получается 3,47 эВ (357 нм, с силой осциллятора 0,57), что прекрасно согласуется с известной экспериментальной полосой поглощения для интермедиата C4a-пероксифлавина. Сценарий 2: Взаимодействие кислород-N5 флавина в сайте si-side Другой комплекс восстановленного флавина с молекулой кислорода в триплетном состоянии, расположенный в кармане si-side, показан на рисунке C5. Энергия QM/MM этого Комплекса-2 на 1,5 ккал/моль ниже, чем энергия Комплекса-1, что указывает на то, что эти структуры могут быть почти одинаково заселены. Комплекс-2 имеет те же характеристики, что и Комплекс-1, в том смысле, что также образуется супероксид-анион, расстояние Ox1-Ox2 составляет 1,30 Å, а заряд молекулы кислорода почти -1. Однако, в Комплексе-2 молекулы кислорода находится ближе к изоаллоксазиновому кольцу -расстояние Ox2-N5 (2,58 Å) примерно на 0,6 Å короче, чем в Комплексе-1. Комплекс-2 также демонстрирует иную структуру водородных связей по сравнению с Комплексом-1. @ Рисунок С5 приведен в приложенном файле Рисунок C5. Сценарий 2: (а) Комплекс Flred-O2 в триплетном состоянии (Комплекс-2) образуется на si-side. (б) Система синглетного состояния с гидропероксид-анионом. (c) Возможный путь к продуктам реакции, Flox…H2O2…OH-(Wat6). Пурпурные стрелки показывают путь переноса протона от Wat6. Система, показанная на рисунке C5(b), соответствует минимальной энергетической структуре в синглетном состоянии PES, полученной в результате минимизации на поверхности потенциальной энергии методом QM/MM. Гидропероксид-анион HO2- (связанный водородными связями с молекулами воды Wat4, Wat5) получается в результате безбарьерного переноса переноса атома водорода от N5. Энергия QM/MM модельной системы, показанной на рисунке C5(b) на 7,8 kcal/mol ниже энергии начального Комплекса-2 (рисунок C5(a)). Энергии возбуждения S0 → S1 и S0 → S2, рассчитанные на уровне XMCQDPT2 в конфигурации, показанной на рисунке C5(b), составляют 2,46 эВ (503 нм с силой осциллятора 0,20 ) и 3,60 эВ (344 нм с силой осциллятора). Сценарий 3: Взаимодействие кислород-N5 флавина в сайте re-side В данном сценарии представлен вариант, когда кислород находится вблизи N5 атома флавина, но с другой стороны от изоаллоксазинового кольца, на re-side. Наличие молекулы кислорода на re-side было обнаружено на рентгеновской структуре PDB ID 6SGG. Структура флавин-кислородного комплекса в триплетном состоянии с O2 с обратной стороны, полученная при QM/MM-оптимизации в настоящей работе (Комплекс-3), показана на рисунке C6. Заметим, что молекулу кислорода снова следует отнести к супероксиду O2−; расстояние Ox1-Ox2 составляет 1,31 Å, а заряд молекулы кислорода близок к -1. Геометрия комплекса отличается от структуры PDB ID 6SGG молекула кислорода связана водородными связями с флавином, Thr105 и водой, тогда как расстояние Ox1-N(Asn134) значительно длиннее (3,3 Å против 2,6 Å в кристалле), а также расстояние Ox1-N5 (2,6 Å против 2,1 Å в кристалле). @ Рисунок С6 приведен в приложенном файле Рисунок C6. Точки минимальной энергии на поверхностях потенциальной энергии для сценария 3: (а) комплекс с кислородом в триплетном состоянии; (b) окисленный флавин и перекись водорода с близлежащими гидроксильными группами. (c) окисленный флавин, перекись водорода с отдаляющимся гидроксилом. Две структуры с минимальной энергией на поверхности потенциальной энергии синглетного состояния представлены на рисунке C6(b) и C6(c). Структура, показанная на рисунке C6(b), почти изоэнергетическая с триплетным состоянием Комплекса-3. В соответствии со сценарием 2 (см. рисунок C5), молекула кислорода заимствует атом водорода от N5. В сценарии 3 увеличение электронной плотности на молекуле кислорода приводит к спонтанному образованию перекиси водорода за счет близлежащей молекулы воды Wat7. Структура, показанная на рисунке C6(b), на 6,8 ккал/моль ниже исходного Комплекса-3. Цепочка молекул воды представляет собой подходящую протонную цепь для перемещения отрицательного заряда гидроксила дальше от изоаллоксазинового кольца. Энергии возбуждения S0 → S1 и S0 → S2, рассчитанные на уровне XMCQDPT2 для системы, показанной на рисунке B6b, составляют 2,46 эВ (503 нм с силой осциллятора 0,20) и 3,64 эВ (344 нм с силой осциллятора 0,20). Таким образом, сценарии 2 и 3 описывают механизм окисления флавина Flred− + O2 (+H2O) → Flox + H2O2 + OH-. Сценарий 4: Образование аддуктов N5-оксида. Интригующий сценарий 4 также начинается с триплетного состояния флавин-кислородного комплекса (Комплекс-4) на re-side, хотя следует отметить, что его QM/MM энергия на 5,6 ккал/моль выше энергии Комплекса-3. Структура, показанная на рисунке C8, отличается от ранее описанного Комплекса-3 расположением молекулы кислорода — расстояния Ox1-N5 в обоих случаях одинаковы (2,62 Å), но атом Ox2 направлен в сторону Wat7 в Комплексе-3 и в сторону Asn134 в Комплексе-4. Как и все ранее описанные флавин-кислородные комплексы, Комплекс-4 размещает супероксид-анион в полости белка - расстояние Ox1-Ox2 составляет 1,32 Å; заряд молекулы кислорода почти -1; и энергетическая щель между триплетным и синглетным состояниями мала. @ Рисунок С8 приведен в приложенном файле Рисунок C8. Сценарий 4: (a) начальное триплетное состояние комплекса 4; (b) минимум на поверхности потенциальной энергии синглетного состояния Переключение с триплетного состояния на поверхности потенциальной энергии структуры C8(a) на синглетное спиновое состояние и последующая оптимизация геометрии привели к структуре (рисунок C8(b)), где расстояние Ox1-Ox2 1,44 Å. Энергия этой структуры на 12,8 ккал/моль ниже уровня исходного Комплекса-4. Заметим попутно, что все оптимизированные по QM/MM структуры как в триплетном, так и в синглетном состояниях модельных систем не показывают короткое расстояние кислород-азот 2,09 Å между любым из атомов молекулы кислорода и атомом флавина N5, как в кристаллической структуре PDB ID 6SGG. Постепенное уменьшение расстояния Ox2-N5 приводит к образованию ковалентной связи NO с одновременным разрывом связи Ox1-Ox2, что приводит к образованию флавин-N(5)-оксида, как показано на рисунке C9. Этот аддукт N5-O отвечает за функционализацию во флавоферменте EncM. Согласно расчетам QM/MM, его энергия на 28,5 ккал/моль ниже энергии начального Комплекса-4 в триплетном состоянии. Как показано на рисунке C8(b), гидроксил Ox1-H, образовавшийся после разрыва связи Ox1-Ox2, взаимодействует с молекулой воды Wat7, что приводит к образованию вновь образованной молекулы воды Wat9 и гидроксильного аниона. Энергии возбуждения S0→S1 и S0→S2, рассчитанные методом XMCQDPT2 в конфигурации, показанной на рисунке С9(а), 2,44 eV (508 нм с силой осциллятора 0,12) и 3,25 эВ (381 нм с силой осциллятора 0,16). Энергии возбуждения S0→S1 и S0→S2, рассчитанные методом XMCQDPT2 в конфигурации, показанной на рисунке С9(b), 2,73 eV (454 нм с силой осциллятора 0,38) и 3,54 eV (350 нм с силой осциллятора 0,12). Эти значения можно сравнить с максимумами полос поглощения 463 нм (2,69 eV) и 360–380 нм (3,26-3,44 eV) флавин-N5-оксида, зафиксированного для белка EncM. Сценарий 5: Образование разновидностей C6-гидропероксифлавина из si-side кислородного кармана. Наконец, в сценарии 5 представлен необычный путь взаимодействия кислорода с флавин, где в качестве места связывания молекулы кислорода с изоаллоксазиновым кольцом рассматривается C6 атом изоаллоксазинового кольца. Спонтанное ковалентное связывание гидропероксида по атому C6 было также отмечено при QM/MM MD моделировании. На рис. С10 показан фрагмент модельной системы триплетного состояния (Комплекс-5), образованной в кармане si-side. Энергия этой структуры на 5,4 ккал/моль выше, чем у Комплекса-1, инициирующего образование аддукта С4a-флавин, и на 6,9 ккал/моль выше, чем у Комплекса-2. @ Рисунок С10 приведен в приложенном файле Рисунок C10. Структуры на сценария 5: (а) Точка минимальной энергии триплетного состояния с молекулой кислорода (Комплекс-5); (b) Структура с аддуктом гидропероксида флавина-C6; (c) Структура с аддуктом эпоксида C6-C7. Стартуя с Комплекса-5 (рисунок C10(a)), после переключения из триплетного состояния на поверхности потенциальной энергии в синглетное состояние легко получить структуру, показанную на рисунке C10(b), с аддуктом флавин-C6-гидропероксид с образованием ковалентной связи С6-Ох1 в сочетании с переносом протона от N5 к Ох2. Энергия этой структуры на 6,5 ккал/моль ниже, чем у Комплекса-5 (рисунок C10(a)). В принципе, этот путь можно продолжить дальше. Преодолев потенциальный барьер около 14 ккал/моль, разрывается связь Ox1-Ox2 и приходим к структуре, показанной на рисунке С10(c), образуется C6-C7-эпоксид. Энергия полученной таким образом структуры (рис. C10(c)) на 30,1 ккал/моль ниже, чем у структуры C10(a), и этот аддукт может выступать в качестве возможного промежуточного продукта реакции. Энергия возбуждения S0→ S1, рассчитанная методом XMCQDPT2 - 2,57 eV (483 нм с силой осциллятора 0,06). Таким образом, в этом проекте мы использовали гибридный метод квантовой механики и молекулярной механики (QM/MM) для характеристики точек на поверхности потенциальной энергии триплетного и синглетного состояний вдоль возможных путей реакций, инициируемых взаимодействием молекулы кислорода флавином в белке RutА. Результаты работы доложены на конференции: Одинцов К.В., Домрачева Т.М., Григоренко Б.Л. Моделирование реакций связывания молекулярного кислорода флавином в монооксигеназе EncM. Биокатализ-2023 Суздаль, 25-29 июня 2023 (стенд) Результаты работы опубликованы в статье: Bella Grigorenko, Tatiana Domratcheva and Alexander Nemukhin “QM/MM Modeling of the Flavin Functionalization in the RutA Monooxygenase” Molecules (MDPI, IF=4,6, Q1), 2023, V28, N5, pp.2405-2422; https://doi.org/10.3390/molecules28052405 D) Механизм работы обратимо фотопереключаемого флуоресцентного белка Dreiklang Этот проект окончательно был завершен и опубликован на втором году проекта. Обратимо фотопереключаемый флуоресцентный белок Dreiklang относится к семейству зеленого флуоресцентного белка GFP (green fluorescent protein). В белке Dreiklang хромофор формируется из трипептида Gly65-Tyr66-Gly67 в отличие от мотива Ser65-Tyr66-Gly67 в GFP, мутация в 65й позиции на Gly делает его переключаемым при возбуждении (405 нм (3,06 эВ)) с ON в OFF, и наоборот, (365 нм (3,40 эВ)) OFF → ON. Уникальность белка Dreiklang среди всех фотопереключаемых белков состоит в том, что переключение от активного состояния (ON) к неактивному (темному) состоянию (OFF) осуществляется за счет фотохимической реакции гидратации хромофора в белковой макромолекуле. Предполагается, что после возбуждения 3,06 эВ (405 нм) система эволюционирует на поверхности возбужденного состояния S1 в интермедиат X, который был зафиксирован в фемтосекундном эксперименте, а затем переходит в продукты реакции – систему в состоянии OFF с гидратированным хромофором. Рассматривались два типа молекулярных моделей – полная модель белка и 158-атомная кластерная модель, содержащая хромофор и окружающие его группы. Полная модель использовалась для расчетов структур и энергий на потенциальной поверхности основного электронного состояния методом квантовой механики/молекулярной механики (QM/MM). Энергии и силы, действующие на атомы, рассчитывались методом КМ(DFT)/MM(AMBER) с использованием в КМ-подсистеме функционала M06-L и базиса 6-31G*. Расчеты проводились по программе NWChem. @ Рисунок D1 приведен в приложенном файле Рисунок D1. Модельные системы для ON-состояния. (а) Суперпозиция фрагментов активного сайта в структуре, оптимизированной методом QM/MM (разноцветный) и кристаллическая структура PDB ID 3ST4(желтый); (b) Активный сайт с нейтральной формой хромофора; (c) Активный сайт с анионной формой хромофора. Межатомные расстояния в Å. Геометрические параметры оптимизированы для всего белка. Методы квантовой химии в кластерной модели использовались для анализа поведения системы при электронном возбуждении, для нахождения структур на поверхности возбужденного состояния, для поиска точек конических пересечений и для расчетов спектров поглощения в стационарных точках на поверхности основного состояния. Для анализа поведения системы с нейтральным хромофором после возбуждения от точки минимума основного состояния использовалась 158-атомная кластерная модель (рисунок D1), описываемая методом SA2-CASSCF(8/6)/6-31G. Т.е. используется многоконфигурационный метод ССП в варианте полного пространства активных орбиталей (CASSCF) с распределением 8 электронов по 6 орбиталям и с усреднением электронной плотности по двум низшим состояниям (SA2). Результаты расчетов показаны на рисунке D2. На потенциальной поверхности состояния CT фиксируется минимум на 1 eV ниже франк-кондоновской точки (рисунок D2(b)). После перевала через барьер высотой 2 ккал/моль в состоянии СТ продолжается спуск до точки минимальной энергии конического пересечения CT/S0 (рисунок D2(c)). Переход после этой точки на потенциальную поверхность основного состояния позволяет локализовать минимум, отвечающий интермедиату Х (рисунок D2(d)), отделенный барьером 1 ккал/моль от продукта реакции – системы в состоянии OFF с гидратированным хромофором (рисунок D2(е)). На этом пути происходят переносы протонов, изначально приписанные Tyr203 и реакционной молекуле воды Wat (см. рисунок D2(f), а также вставки (a-e) рисунка D2). @ Рисунок D2 приведен в приложенном файле Рисунок D2. Эволюция системы после возбуждения в состояние с переносом заряда CT. Для лучшей визуализации – переносимые протоны, изначально приписанные Tyr203 и реакционной молекуле воды Wat показаны светло-голубым и розовым цветом. Представленные в Таблице D1 результаты подтверждают адекватность использованных моделей. @ Таблица D1 приведена в приложенном файле Таблица D1. Рассчитанные значения энергий возбуждения S0 → S1, соответствующие длины волн, силы осцилляторов электронных переходов и экспериментальные величины. Таким образом, результаты моделирования позволяют существенно уточнить и дополнить гипотетическую схему, предложенную по результатам фемтосекундных спектральных исследований. В нашей работе показано, что интермедиат реакции, названный Х (см. вставку рисунка D3) соответствует катионной форме хромофора. Результаты работы доложены на конференции: Поляков И.В., Григоренко Б.Л., Немухин А.В. Квантовохимическое моделирование фотореакции гидратации хромофора флуоресцентного белка Dreiklang, МАТЕМАТИКА. КОМПЬЮТЕР. ОБРАЗОВАНИЕ. МКО-2023, 23-27 января 2023 (устный) Результаты работы опубликованы в статье: Grigorenko Bella L., Polyakov Igor V., Nemukhin Alexander V. “Modeling Light-Induced Chromophore Hydration in the Reversibly Photoswitchable Fluorescent Protein Dreiklang”, Molecules (MDPI, IF=4,6, Q1), 2023, V28, N3, pp.505-517; https://doi.org/10.3390/molecules28020505 F) Флуоресцентный таймер mRubyFT, запертый в синей форме mRubyFT — это мономерный флуоресцентный таймер, полученный путем мутации из флуоресцентного белка mRuby2. Это флуоресцентный белок, для которого характерно полное созревание синей формы с последующим преобразованием в красную форму. Он имеет более высокую яркость в клетках млекопитающих и более высокую фотостабильность по сравнению с другими флуоресцентными таймерами. Структура высокого разрешения была получена для mRubyFT с хромофором в красной форме, но структурные детали в его синей форме были не ясны. Чтобы разрешить структурные особенности белка mRubyFT в синей форме, экспериментально был получен вариант с мутацией S148I, который блокирован по времени в синей форме хромофора. Разрешение рентгеновской структуры позволило предположить конформацию хромофора и его взаимодействие с соседними остатками. Метильный мостик между имидазольной и фенильной частями хромофора не окисляется в красную форму, что и обеспечивает гибкость. Молекулярно-динамическое моделирование с комбинированными КМ/ММ потенциалами продемонстрировало, что синяя форма в основном состоянии существует как а анионной форме, так и в цвитерионной. Как показывают расчеты, эти две формы имеют схожие энергии возбуждения. Кроме того, молекулярно-динамическое моделирование в возбужденном состоянии показало, что флуоресцирует анионное состояние. Результаты работы опубликованы в статье: Boyko Konstantin M., Khrenova Maria G., Nikolaeva Alena Y., Dorovatovskii Pavel V., Vlaskina Anna V., Subach Oksana M., Popov Vladimir O., Subach Fedor V. “Combined Structural and Computational Study of the mRubyFT Fluorescent Timer Locked in Its Blue Form”, International Journal of Molecular Sciences (MDPI, IF=5.6, Q1), 2023,V24, N9, p7906-7919; https://doi.org/10.3390/ijms24097906
3 1 января 2024 г.-31 января 2024 г. Многомасштабное моделирование сложных химических реакций в фотоактивных белках
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".