Поиск новых клеточных партнеров интегразы ВИЧ-1 и их валидация как потенциальных терапевтических мишенейНИР

Search for new cellular partners of HIV-1 integrase and their validation as potential therapeutic targets

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 16 мая 2022 г.-31 декабря 2022 г. Поиск новых клеточных партнеров интегразы ВИЧ-1
Результаты этапа: 1. Идентификация клеточных белков - потенциальных партнеров интегразы, найденных при двух вариантах кросс-линкинга с последующей иммунопреципитацией комплексов на смоле с иммобилизированными анти-НА антителами и LС-MS анализом. Анализ белков, связавшихся ковалентно с интегразой ВИЧ-1 под действием формальдегида, позволил нам идентифицировать белки LEDGF/p75, PARP1, Cofilin-1 (CFL1), DNAJA1, DNAJA2, Hsp60 (HSPD1), UBR5, RBBP7, AHCY, IPO5, CACYBP, WDR82, SDF2L1 и 14-3-3 zeta/delta (YWHAZ). В результате анализа образцов белков, сшитых с интегразой под действием DSSO, были также идентифицированы известные партнеры интегразы LEDGF/p75 и Ku70, что подтверждает корректность проведенного эксперимента. Помимо этого, были идентифицированы белки PARP1, AHCY и 14-3-3 zeta/delta, ранее обнаруженные нами по результатам кросс-линкинга формальдегидом, а также SFPQ. Для белков PARP1, Cofilin-1, DNAJA2, WDR82, DNAJA1, Hsp60 и SFPQ уже было показано их участие в репликации ВИЧ-1, однако ни для одного из них, кроме SFPQ, не было экспериментально обнаружено связывания с интегразой. Для найденных нами белков UBR5, RBBP7, AHCY, IPO5, CACYBP, SDF2L1 и 14-3-3 zeta/delta данных об их участии в репликации ВИЧ-1 нет. 2. Получение эукариотических экспрессионных векторов, кодирующих выявленные партнеры интегразы ВИЧ-1 с 3xFlag-довеском на C-конце. Эукариотические экспрессионные вектора с 3xFlag-довеском на C-конце были получены на базе имеющегося в лаборатории вектора pcDNA3.1-Ku70_3xFlag путем замены гена Ku70 последовательностью гена исследуемого белка. Наработка целевых генов была осуществлена с использованием ПЦР с праймерами к 5’- и 3’-концевым областям белок кодирующей последовательности каждого целевого гена с использованием кДНК, полученной с помощью обратной транскрипции, в качестве матрицы. Удалось получить гены всех белков, кроме PARP1. Соответственно, были получены экспрессионные вектора, содержащие гены CFL1, DNAJA1, DNAJA2, HSPD1, UBR5, RBBP7, AHCY (две изоформы), IPO5, CACYBP (две изоформы), WDR82, SDF2L1, SFPQ и YWHAZ. 3. Дополнительный отбор белков-партнеров интегразы по результатам анализа взаимодействия эктопически экспрессированных НА-тагированной интегразой ВИЧ-1 и 3xFlag-тагированных исследуемых белков методом ко-иммунопреципитации c использованием анти-НА антител. С помощью ко-иммунопреципитации эктопически экспрессированных НА-тагированной интегразой ВИЧ-1 и 3xFlag-тагированных исследуемых белков нам удалось подтвердить взаимодействие между интегразой ВИЧ-1 и клеточными белками: DNAJA1, AHCY1, AHCY2, Hsp60 (HSPD1), 14-3-3 zeta/delta (YWHAZ), CACYBP1. Для белков RBBP7, CACYBP2, DNAJA2, WDR28 и Cofilin-1 (CFL1) нам не удалось показать образования комплекса с интегразой ВИЧ-1 данным методом. Учитывая, что нам не удалось получить экспрессионный вектор для белка PARP1, для анализа его связывания с интегразой ВИЧ-1 был использован рекомбинантный белок PARP1, любезно предоставленный нам академиком Лаврик О.И. В результате было установлено, что рекомбинантная интеграза ВИЧ-1 способна эффективно связываться с белком PARP1. 4. Идентификация партнеров интегразы ВИЧ-1, влияющих на репликацию ВИЧ-1, по результатам анализа эффективности трансдукции клеток лентивирусным вектором в условиях измененной внутриклеточной конценрации целевых белков. С использованием VSV-G-псевдотипированного репликативно-некомпетентного вектора на основе генома ВИЧ-1, в геноме которого закодирована люцифераза светлячка, было показано, что суперэкспрессия только двух белков из всего исследуемого набора статистически значимо влияет на эффективность трансдукции лентивирусным вектором. Один из таких белков 14-3-3 zeta/delta (YWHAZ) негативно влиял на репликацию ВИЧ-1, второй белок – Hsp60 (HSPD1), наоборот, активировал репликацию. В дальнейшем мы планируем проверить полученные результаты, повторив эти эксперименты и в условиях суперэкспрессии 3xFlag-тагированных целевых белков и при понижении их внутриклеточного уровня с помощью миРНК. На основе проведенных экспериментов по связыванию интегразы ВИЧ-1 с исследуемыми белками и их влияния на трансдукцию клеток линии HEK293T VSV-G-псевдотипированным репликативно-некомпетентным вектором на основе генома ВИЧ-1 мы планируем в дальнейшем продолжить работу с белками PARP1, DNAJA1, Hsp60 (HSPD1), AHCY (двумя изоформами AHCY1 и AHCY2), CACYBP (изоформа CACYBP1) и 14-3-3 zeta/delta (YWHAZ), а также SFPQ, который был идентифицирован нами по результатам кросс-линкинга реагентом DSSO.
2 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Идентификация новых клеточных партнеров интегразы ВИЧ-1
Результаты этапа: 1. В результате проведения экспериментов по определению эффективности трансдукции клеток линии HEK293T VSV-G-псевдотипированным репликативно-некомпетентным вектором на основе генома ВИЧ-1 в условиях измененной внутриклеточной концентрации исследуемых белков отобраны белки, SFPQ, VBP1, DNAJA1 и CACYBP1, обеспечивающие наибольшее влияние на эффективность трансдукции клеток линии HEK293T этим вектором. 2. Установлено, что изменение уровня белка PARP1 не оказывает влияния на уровень экспрессии люциферазы, который коррелирует с эффективностью трансдукции, однако экспрессия люциферазы увеличивается при снижении уровня белка PARP2 в клетках. Установлено, что каталитическая активность белка PARP2 важна для эффективной репликации используемого нами VSV-G-псевдотипированным репликативно-некомпетентным вектором на основе генома ВИЧ-1. 3. Установлено, что белки DNAJA1 и CACYBP1 влияют не на ранние стадии репликации ВИЧ-1, а на транскрипцию с CMV-промотора. 4. Установлено, что белок SFPQ влияет на стадию интеграции. 5. Методом соосаждения белков установлено, что рекомбинантные белки SFPQ, VBP1 и PARP2 взаимодействуют с рекомбинантной интегразой ВИЧ-1. Этот результат подтверждает, что идентифицированные нами белки, влияющие на репликацию ВИЧ-1, действительно являются партнерами интегразы ВИЧ-1. 6. С использованием делеционных мутантов интегразы ВИЧ-1 проведены эксперименты по установлению участков интегразы, ответственных за связывание с исследуемыми белками-партнерами. Достоверно установлено, что для взаимодействия с PARP1 достаточно региона 51-190 а.к., который находится в каталитическом домене, а сайт связывания SFPQ находится в регионе 160-190 а.к. Методом пептидного «фишинга» показано, что с SFPQ специфично связывается пептид 171-202 а.к., который как раз находится в определенном нами участке связывания. Методом сайт-направленного мутагенеза показано, что только замена остатка R187 нарушает связывание между интегразой и SFPQ. 7. Охарактеризованы точечные мутанты интегразы с заменами I182A, R187А и K188A. Установлено, что аминокислота R187 важна для репликации вируса как на стадии обратной транскрипции. Аминокислота K188 оказалась важна для успешного протекания обратной транскрипции и не влияла на интеграцию. Аминокислотная замена I182А, наоборот, снижала эффективность интеграции. 8. Осуществлен анализ способности ряда низкомолекулярных соединений блокировать взаимодействие интегразы с ДНК-связывающей субъединицей ДНК-зависимой протеин-киназы (ДНК-ПК) – белком Ku. Впервые установлено, что ингибитор связывания интегразы с Ku способен подавлять репликацию псевдовируса в клетках на уровне пост-интеграционной репарации. Крайне важно при этом, что этот ингибитор никак не влияет на репарацию двуцепочечных разрывов в ДНК по механизму негомологичного соединения концов, основным участником которой является ДНК-ПК.
3 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Характеристика новых клеточных партнеров интегразы ВИЧ-1
Результаты этапа: 1. За отчетный период были получены клоны клеток НЕК 293Т с моноаллельным нокаутом PARP1 (клон №114), PARP2 (клон №224), а также обоих белков (клон №122). При трансдукции этих клеток VSV-G-псевдотипированный репликативно-некомпетентный вектор на основе генома ВИЧ-1, кодирующим вместо вирусных белков люциферазу светлячка (псевдовирусом), наблюдалось снижение сигнала люциферазы, которое было наиболее сильным (до 20-25% по сравнению с исходными клетками НЕК 293Т) в случае пониженного уровня обоих белков (клон №122) и наименее выраженным при нокауте PARP2 (клон №224). Этот псевдовирус позволяет изучать влияние различных факторов на ранние этапы репликативного цикла ВИЧ-1: обратную транскрипцию, интеграцию и пост-интеграционную репарацию, поэтому можно сделать вывод, что белки PARP1 и PARP2 влияют на эффективность этих этапов, причем снижение уровня PARP1 оказывает более сильное влияние, чем уровня PARP2. 2. Установлено, что при сниженном внутриклеточным уровне не только белка PARP1, но и белка PARP2 ингибитор их каталитической активности олапариб продолжает также эффективно ингибировать трансдукцию клеток НЕК 293Т псевдовирусом, как и клеток с нормальным уровнем этих белков, только в клетках с пониженным уровнем обоих белков снижение сигнала люминесценции было менее сильным. Мы предполагаем, что негативный эффект олапариба, детектируемый даже в клоне с пониженным уровнем обоих белков, может быть связан с подавлением каталитической активности третьего члена семейства белков PARP – PARP3, который также ингибируется олапарибом. Нами начата работа по изучению влияния PARP3 на жизненный цикл ВИЧ-1. 3. С целью понять характер влияния каталитической активности белков семейства PARP на репликацию ВИЧ-1, мы определили, на какую из ранних стадий жизненного цикла ВИЧ-1 влияет олапариб. Для этого мы использовали ранее описанные методы определения количества тотальной, интегрированной и репарированной форм вирусной ДНК, основанные на методе количественной ПЦР. Установлено, что олапариб не влияет на протекание стадий обратной транскрипции и интеграции ВИЧ-1, но дозозависимо снижает эффективность постинтеграционной репарации (количество репарированной формы ДНК). При этом снижение эффективности постинтеграционной репарации коррелирует со снижением уровня люминесценции в исследуемых образцах. 4. Установлено, что клеточный белок VBP1 является положительным фактором репликации ВИЧ-1 и стимулирует стадию постинтеграционной репарации: снижение внутриклеточной концентрации VBP1 не приводит к статистически значимому изменению количества тотальной и интегрированной вирусной ДНК, т.е. не влияет на протекание обратной транскрипции и интеграции ВИЧ-1, но снижает количество репарированной формы ДНК. При этом снижение эффективности постинтеграционной репарации коррелирует со снижением уровня люминесценции в исследуемых образцах 5. С использованием метода соосаждения рекомбинантного белка VBP1 и набора делеционных мутантов интегразы установлено, что участок взаимодействия интегразы с VBP1 находится в районе 51-160 а.к. и перекрывается с активным центром фермента (аминокислотные остатки D64, D112 и E152). Дополнительно проведен анализ литературы по влиянию аминокислотных замен в каталитическом домене интегразы (51-200 а.к.) на инфекционность вируса, который показал, что замены большинства аминокислот в этом домене приводят к потере инфекционности. По этой причине решено в дальнейшем идентифицировать сайт связывания интегразы в составе VBP1, а затем проанализировать, оказывает ли суперэкспрессия мутанта VBP1, неспособного связываться с интегразой, такой же эффект на трансдукцию клеток псевдовирусом, как и суперэспрессия VBP1 дикого типа. 6. Для определения точного сайта связывания рекомбинантного белка SFPQ в составе интегразы с помощью сайт-направленного мутагенеза получены варианты интегразы с заменами: K160A/I161A/I162A, Q164A/V165A/R166A, T174A/V176A/Q177A/M178A, D167A, D167H, D167K. Установлено, что только замены V165A и R166A нарушают связывание интегразы с SFPQ. Однако, по литературным и нашим экспериментальным данным, эти замены приводят к потере каталитической активности интегразы и инфекционности вируса. По этой причине, решено не получать псевдовирус с заменами V165A и R166A в составе интегразы, а идентифицировать сайты связывания интегразы в составе SFPQ. 7. С целью идентификации сайта связывания интегразы в составе клеточного белка SFPQ получен набор делеционных мутантов SFPQ и с их помощью установлено, что сайт связывания интегразы расположен в N-концевом домене. Проведен анализ аминокислотной последовательности этого домена, который показал, что в нем присутствуют два мотива R19GGGGGR25GG и R236GGGGGR242GG, которые могут участвовать в белок-белковых взаимодействиях. Показано, что единичные замены аминокислот в каждом из этих доменов снижают эффективность связывания SFPQ с интегразой на 70-80%, а рекомбинантный белок SFPQ, содержащий единичные замены аминокислот в обоих мотивах, SFPQR19A/R242A, практически не связывается с интегразой. С учетом того, что мы идентифицировали в составе ИН два положения, замены аминокислот в которых (V165A/R166A и R187A) нарушают связывание с SFPQ, тот факт, что в составе SFPQ также присутствуют два участка, отвечающих за взаимодействие с ИН, позволяет сделать вывод о двухсайтовом механизме связывания ИН с белком SFPQ. 8. Суперэкспрессия SFPQ с заменами SFPQR19A/R242A не оказывает влияния ни на эффективность трансдукции клеток НЕК 293Т VSV-G-псевдотипированным репликативно-некомпетентным вектором на основе ВИЧ-1, ни на эффективность интеграции в отличие от суперэкспрессии белка SFPQ дикого типа. Этот результат подтверждает, что влияние SFPQ на интеграцию обусловлено именно его взаимодействием с интегразой. 9. Исследовано влияние белков DNAJA1 и CACYBP1 на транскрипцию с LTR-промотора ВИЧ-1 с использованием линии клеток НЕК 293Т, содержащей интегрированный провирус, в котором ген люциферазы светлячка находится под контролем LTR-промотора. Параллельно проверено, как изменение уровня этих белков в клетках влияет на трансдукцию клеток НЕК 293Т VSV-G-псевдотипированным репликативно-некомпетентным вектором на основе ВИЧ-1, в геноме которого закодирована люцифераза также под контролем LTR-промотора. Установлено, что в обоих случаях изменение внутриклеточного уровня белков DNAJA1 и CACYBP1 совершенно одинаково влияет на активность люциферазы. Следовательно, влияние белков DNAJA1 и CACYBP1 на трансдукцию клеток всевдовирусом обусловлено их влиянием на стадию транскрипции, причем белки DNAJA1 и CACYBP1 влияют на транскрипцию гена люциферазы, независимо от промотора (в 2023 г. показано, что они влияют на транскрипцию с CMV-промотора). 10. Проведены дополнительные эксперименты для того, чтобы достоверно выяснить, влияют ли белки 14-3-3 zeta/delta (YWHAZ) и Cofilin-1 (CFL1) на репликацию ВИЧ-1. Проверено, как изменение внутриклеточного уровня этих белков влияет на трансдукцию клеток HEK293T псевдовирусом, содержащим ген люциферазы светлячка, и установлено, что нокдаун этих белков с помощью миРНК приводит к увеличению сигнала люминесценции в среднем в 1.5 раза, а их суперэкспрессия снижает сигнал люминесценции на 30-40% по сравнению с контрольными клетками. Анализ конкретной стадии жизненного цикла вируса, на которую влияют эти белки, с помощью количественной ПЦР достоверно показал, что они негативно влияют на стадию обратной транскрипции ВИЧ-1. Таким образом впервые обнаружено, что белки 14-3-3 zeta/delta и Cofilin-1 являются негативными регуляторами стадии обратной транскрипции ВИЧ-1. 11. Получены рекомбинантные белки AHCY1, AHCY2 и Hsp60, содержащие GST-таг на N-конце, и исследовано их связывание с интегразой ВИЧ-1, содержащей His6-таг на N-конце, методом соосаждения. Установлено, что все три исследованных белка непосредственно способны взаимодействовать с интегразой ВИЧ-1.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".