|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Нанозимы «искусственная пероксидаза» для медицинской диагностики и терапииНИР
Nanozymes "artificial peroxidase" for medical diagnostics and therapy
- Руководитель НИР: Карякин А.А.
- Ответственные исполнители: Андреев Е.А., Дабосс Е.В., Комкова М.А.
- Участники НИР: Вохмянина Д.В., Никитина В.Н., Плешаков В.М., Тихонов Д.В., Шавокшина В.А., Шарапова О.Е., Щербачева Е.В.
- Подразделение: Химический факультет
- Срок исполнения: 19 мая 2022 г. - 31 декабря 2023 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 19-13-00131
- Номер ЦИТИС: АААА-А19-119041190068-2
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Функциональные материалы, наноматериалы и технологии
- Приоритеты и перспективы НТР Российской Федерации согласно Стратегии НТР РФ: переход к высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
- Критическая технология России: Биокаталитические, биосинтетические и биосенсорные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 31.15.33 Электрохимия
- 31.19.15 Анализ неорганических веществ
- 31.19.29 Анализ органических веществ
- Классификатор OECD: Аналитическая химия, Электрохимия, Наноматериалы и нанотехнологии
-
Ключевые слова:
нанозимы, неивазивная диагностика, наноструктурированные катализаторы
nanostructured catalysts, nanozymes, noninvasive diagnostics -
Описание:
Научная проблема, изучаемая в рамках проекта № 19-13-00131 «Нанозимы «искусственная пероксидаза» для медицинской диагностики и терапии», по-прежнему является крайне актуальной. Согласно Web of Science, количество публикаций по нанозимам (наночастицам) с пероксидазной активностью растет в последние годы экспоненциально, в 2020 г. превысило 1200. Наша статья, послужившая основой проекта № 19-13-00131 (J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 11302−7; IF = 15.4), за 2019 – 2021 гг. процитирована 106 раз. В рамках проекта № 19-13-00131 опубликовано одиннадцать научных статей в журналах Q1, что более чем вдвое превышает запланированные показатели. В продолжение проекта сформулированы новые научные задачи: - определение фундаментальных пределов эффективности катализа нанозимами: a) связь бимолекулярных констант скорости (на два порядка превышающие таковые для ферментов) с размерами нанозимов и наличием в них функциональных групп; b) предстационарная кинетика для выявления констант связывания с восстанавливающим субстратом. - темплатный синтез сверхмалых нанозимов: a) заключительные исследования синтеза в обращенных мицеллах с подготовкой научной статьи; b) использование других темплатов (апоферритина). - высокоэффективные (био)сенсоры на основе нанозимов: a) разработка пероксидных сенсоров с использованием как предобработки поверхности для сорбции нанозимов, так и включения нанозимов в графитовые пасты для трафаретной печати; b) создание на основе наночастиц берлинской лазури твердоконтактных K+/Na+ селективных электродов для анализа биологических жидкостей; c) разработка биосенсоров с дополнительной диффузионно-лимитирующей мембраной для повышения стабильности и увеличения линейного диапазона. - определение антиоксидантной активности по каталитическому и некаталитическому поглощению пероксида водорода; - неинвазивный мониторинг диабета и гипоксии по непрерывному анализу пота: a) выявление корреляции по концентрации глюкозы между потом и кровью больных сахарным диабетом; b) непрерывный мониторинг уровня лактата в поте на фоне его периодического контроля в крови при гипоксии, вызванной тяжелой физической нагрузкой. - пробоотбор выдыхаемого аэрозоля и его анализ высокоэффективными (био)сенсорами: a) современные средства науки об аэрозолях для конденсации выдыхаемого аэрозоля; b) оксиды графена с нанозимами для анализа аэрозоля на содержание пероксида водорода. - лекарства для терапии двойного действия с использованием нанозимов как противовоспалительных средств; - создание реальных ДНК-/иммуносенсоров. Комплексность решаемых задач подтверждает использование разнообразных физических и физико-химических методов, а также вовлечение в проект различных областей знания: нанотехнологий (синтез и исследование наночастиц), катализа (каталитический синтез, методы химической кинетики), биохимии, молекулярной биологии и медицинской химии (синтез коньюгатов с антителами, ДНК, гибридные липосомы для терапии двойного действия), аналитической химии и медицинской диагностики (сенсоры, биосенсоры и электроаналитические системы, ДНК-/иммуносенсоры, неинвазивная диагностика). Успешная реализация проекта будет способствовать установлению фундаментальных закономерностей действия нанозимов, в частности, оценке пределов величин бимолекулярных констант скорости в катализе восстановления пероксида водорода. Выявленная противовоспалительная активность нанозимов позволит разрабатывать лекарственные препараты терапии двойного действия. Создаваемые сенсоры и биосенсоры в совокупности с устанавливаемыми корреляциями в концентрациях метаболитов между кровью и экскреторными жидкостями заложат основы развития неинвазивной диагностики, одной из неотъемлемых составляющих медицины будущего
-
Abstract:
The scientific problem investigated in the frame of the project # 19-13-00131 “Nanozymes “artificial peroxidase” for medical diagnostics and therapy” is still actual. According to Web of Science, the number of publications on nanozymes (nanoparticles) with peroxidase-like activity grows exponentially, and in 2020 it exceeded 1200. Our own paper, which provided a background for the project # 19-13-00131 (J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 11302−7; IF = 15.4), during 2019-2021 has been cited 106 times. Eleven scientific papers in Q1 journals published in the frame of the project # 19-13-00131, which twice exceeds the planned value, confirm that the scientific problem is actual. For the project extension the novel scientific tasks are formulated: - estimation of fundamental limits for the nanozyme catalysis efficiency; a) the dependence of bimolecular rate constants (which by the two orders of magnitude exceed those for the enzymes) on the nanozymes size and their functionality; b) pre-steady-state kinetics for evaluation of binding constants with reducing substrate; - template synthesis of ultra-small nanozymes: a) final studies of nanozymes synthesis in reversed micelles with preparing of scientific paper; b) other templates (apoferritine) for nanozymes synthesis. - nanozyme based advanced (bio)sensors; a) elaboration of peroxide sensors using as surface pre-treatment, as nanozymes entrapment in carbon screen-printing inks; b) Prussian Blue nanoparticles based solid-contact K+/Na+ selective electrodes for analysis of biological liquids; c) elaboration of biosensors with additional diffuse-limiting membrane for improvement of stability and increase of the linear range. - evaluation of antioxidant activity according catalytic and non-catalytic hydrogen peroxide scavenging; - non-invasive hypoxia and diabetes monitoring through continuous sweat analysis; a) investigation of correlation in glucose content between sweat and blood of diabetic patients; b) continuous monitoring of sweat lactate level with its simultaneous periodic control in blood upon hypoxia caused by exhaustive physical exercise. - exhaled aerosol sampling and its analysis by advanced (bio)sensors; a) modern approaches of aerosol science for condensation of exhaled aerosol; b) graphene oxides with nanozymes for hydrogen peroxide detection in aerosol. - medical drugs for dual action therapy with the use of nanozymes as anti-inflammatory agents; - elaboration of real DNA-/immunosensors. Complexity of the proposed tasks is illustrated by using of various physical and physico-chemical methods, as well as by involvement in the project different scientific areas: nanotechnology (synthesis and investigation of nanoparticles), catalysis (catalytic synthesis, methods of chemical kinetics), biochemistry, molecular biology and medical chemistry (synthesis of conjugates with antibodies and DNA, hybrid liposomes for dual action therapy), analytical chemistry and medical diagnostics (sensors, biosensors, electroanalytical systems, DNA-/immunosensors, non-invasive diagnostics). The successful realization of the project would lead to discovery of fundamental laws of nanozymes action, particularly, for estimation of limits for bimolecular rate constants in catalysis of hydrogen peroxide reduction. The discovered anti-inflammatory activity of nanozymes opens a possibility for elaboration of dual action therapy medical drugs. The elaborated sensors and biosensors in combination with the evaluated correlations in metabolite content between blood and excretory liquids would found the basis of non-invasive diagnostics, which is considered as essential part of the future medicine.
-
Планируемые результаты:
Результаты продолжения проекта № 19-13-00131 «Нанозимы «искусственная пероксидаза» для медицинской диагностики и терапии» будут иметь как фундаментальное, так и прикладное значение. Нанозимы являются новой быстро развивающейся областью. В частности, как указывалось, число публикаций только по наночастицам, обладающим пероксидазной активностью, в последние годы растет экспоненциально. Таким образом, выявление теоретических пределов их катализа принципиально важно для современной науки. В рамках проекта № 19-13-00131 было показано, что каталитически синтезированные наночастицы берлинской лазури демонстрируют бимолекулярные константы скорости (включая константу лимитирующей стадии), в 100 раз превышающие таковые для ферментов пероксидаз. В продолжении проекта будут выявлены зависимости бимолекулярной константы скорости лимитирующей стадии от размера наночастиц, а также от наличия у них функциональных групп. Кроме того, для определения константы скорости присоединения на первой стадии (k1), осуществление которого невозможно методами стационарной кинетики, будет применен метод остановленной струи. Значения бимолекулярных констант, а также их зависимости от различных факторов позволят оценить теоретические пределы активности нанозимов, имитирующих пероксидазу. Фундаментальным результатом, принципиально важным для современных физиологии и медицины, будет установление корреляционных соотношений по концентрациям ключевых метаболитов между экскреторными жидкостями и кровью. Непрерывный мониторинг концентрации лактата в поте, собираемом с разных участков тела, позволит существенно продвинуться в понимании механизма возникновения гипоксии, вызванной физической нагрузкой, а также разработать методики неинвазивного контроля тренировочного процесса. Подтверждение, как ожидается, для больных сахарным диабетом выполнения корреляционных соотношений по содержанию глюкозы между потом и кровью, полученных на здоровых добровольцах, позволит перейти к разработке прототипов коммерческих неинвазивных мониторов, призванных в недалеком будущем улучшить качество жизни для сотен миллионов людей. Фундаментальным результатом с точки зрения аналитической химии, имеющим, в то же время, важное практическое значение будет разработка новых сенсоров и ферментативных биосенсоров на основе нанозимов «искусственная пероксидаза». В частности, ожидается, что невзирая на субмиллимолярную константу Михаэлиса лактатоксидазы, применение диффузионно-лимитирующей мембраны позволит не просто сдвинуть динамический диапазон лактатного биосенсора в область возможных содержаний лактата в поте и крови (0.5-100 мМ), но и добиться линейной градуировки в данной области концентраций, что существенно упростит создание электроники для неинвазивного монитора. Практически важным для пищевой промышленности будет новый способ оценки антиоксидантной активности по сравнению каталитического и некаталитического поглощения пероксида водорода. Важнейшей экскреторной жидкостью не только с точки зрения пульмонологии, но и для медицинской диагностики вообще является выдыхаемый человеком аэрозоль. Разрабатываемые в продолжении проекта способы как его сбора без охлаждения (чтобы избежать разбавления парами воды), так и непосредственного анализа без предварительной конденсации позволят создать простые и дешевые средства индивидуального неинвазивного контроля. Трудно переоценить создание лекарств терапии двойного действия с использованием нанозимов «искусственная пероксидаза». В рамках проекта № 19-13-00131 были показаны противовоспалительная активность и отсутствие цитотоксичности последних. C учетом длительности медико-биологических экспериментов, а также их численности при создании лекарств, работы не могли быть выполнены в течение трех лет, таким образом, они должны быть продолжены. Наконец, демонстрация принципиальных возможностей создания как ДНК-сенсора, так и иммуносенсора на основе нанозимов «искусственная пероксидаза» (проект № 19-13-00131), позволяет в течение двух лет разработать реальный ДНК-/иммуносенсор на конкретную мишень. Как указывалось, иммуно- и ДНК- (РНК-) сенсоры являются неотъемлемой частью жизнедеятельности современного общества, поскольку используются в различных его сферах от медицины до сельского хозяйства. Проект является мультидисциплинарным. Его результаты также важны для нанотехнологий, биохимии и молекулярной биологии, аналитической химии и медицинской диагностики.
-
Научный задел:
25 лет назад в работах нашей научной группы был открыт гексацианоферрат железа, или берлинская лазурь, как наиболее эффективный электрокатализатор восстановления пероксида водорода. В нейтральных водных растворах, благоприятных для биоаналитических и биомедицинских приложений, преимуществами электродов, модифицированных берлинской лазурью, по сравнению с обычно используемой платиной являются: (а) на 2 порядка величины более высокая каталитическая активность в реакции восстановления пероксида водорода, а также (б) на 3 порядка более высокая селективность в реакции восстановления пероксида водорода по сравнению с восстановлением кислорода. Многолетний опыт работы с берлинской лазурью, включая создание электрохимического сенсора с рекордными аналитическими характеристиками, предопределили успех синтеза нанозимов, имитирующих пероксидазную активность. У научного коллектива имеется большой опыт работы в области синтеза (электро)катализаторов и создания на их основе биосенсорных устройств. Заявителем синтезированы нанозимы «искусственная пероксидаза» с рекордными каталитической активностью и стабильностью, механизм действия нанозимов впервые исследован с применением подходов ферментативной кинетики; показана эффективность применения нанозимов «искусственная пероксидаза» для создания электроаналитических систем; предложены подходы амперометрической детекции неэлектроактивных ионов и молекул; показана возможность создания систем неинвазивного мониторинга состояний гипоксии и гипо-/гипергликемии путем анализа пота/конденсата выдыхаемого воздуха с помощью электрохимических биосенсоров на основе берлинской лазури; реализован упрощенный протокол детекции аналитов с помощью амперметра и высокоэффективных биосенсоров на основе берлинской лазури, не уступающий классическому режиму с использованием потенциостата по параметрам чувствительности и рабочего диапазона и обладающий повышенным соотношением сигнал/шум (до одного порядка)
-
Основные результаты:
Фундаментальными разделами РНФ 19-13-00131П являются кинетика и механизм действия нанозимов, а также синтез новых каталитических наночастиц. 1. Синтез сверхмалых нанозимов в обращенных мицеллах и исследование их каталитической активности. В системе обращенных мицелл (аэрозоль ОТ|изооктан|вода) каталитически синтезированы нанозимы диаметром 4-5 нм, как у фермента пероксидазы. Каталитическая константа для данного диаметра принадлежит размерной зависимости традиционно синтезированных нанозимов. Таким образом, наночастицы, синтезированные в темплатах, пополняют семейство нанозимов «искусственная пероксидаза». Сверхмалые наночастицы позволяют дополнять размерные зависимости физико-химических свойств традиционных нанозимов. 2. Стационарная и предстационарная кинетика действия нанозимов «искусственная пероксидаза». Размерная зависимость константы скорости лимитирующей стадии указывает на проникновение пероксида водорода в объем наночастиц. Для крупных нанозимов (Ø=300 нм) эти константы на 4-5 порядков выше по сравнению с пероксидазой. Метод остановленной струи позволил определить бимолекулярные константы скорости восстановления нанозима K4[Fe(CN)6] (5·10^9 М-1·с-1) и гидрохиноном (6·10^8 М-1·с-1). Величины согласуются с оценкой на основе стационарной кинетики (~10^9 М-1·с-1). Сенсоры на пероксид водорода важны сами по себе и как трансдьюсеры биосенсоров на основе ферментов-оксидаз. 3. Сенсоры на пероксид водорода, объемно модифицированные нанозимами «искусственная пероксидаза» на стадии трафаретной печати. Сенсоры на пероксид водорода, полученные в результате объемной модификации электродов на стадии печати, характеризуются существенно (до 6 раз) повышенным соотношением сигнал:шум, позволяющим достигать низких пределов обнаружения (0.1 мкМ). Сенсоры применимы для создания биосенсоров на глюкозу и лактат, пригодных для анализа биологических жидкостей. Данный способ существенно облегчает масштабирование и удешевляет (био)сенсоры при массовом производстве. 4. Метод оценки антиоксидантной активности (АОА) по каталитическому и некаталитическому поглощению пероксида. Антиоксидантную активность характеризовали константой скорости поглощения Н2О2. Кроме способности продуктов непосредственно восстанавливать Н2О2, предложен каталитический метод оценки АОА в присутствии нанозимов. Субстанции, не проявляющие некаталитической АОА, возможно дифференцировать по каталитической АОА. Редокс реакции берлинской лазури сопряжены с переносом однозарядных катионов, что обусловило использование нанозимов для ионоселективных электродов. 5. Ионоселективные электроды на основе наночастиц берлинской лазури (НЧ БЛ) в качестве твердого контакта Селективность самой БЛ в режиме проточно-инжекционной амперометрии к К+ относительно Na+: lgk ≈ –2.5. Чувствительность калий-селективного электрода с мембраной, содержащей валиномицин, – 40-60 мкА/см2·М, натрий-селективного на основе ионофора VI – 4±1 мкА/см2·М. Диапазоны линейности для обоих датчиков: от 1·10^-6 до 1·10^-4 М. Проточно-инжекционная амперометрия обеспечивает в 100 раз более низкие пределы обнаружения по сравнению с потенциометрией. Правильность работы ионоселективных электродов подтверждена анализом контрольных сывороток крови. С целью заменить в биохимическом анализе фермент пероксидазу на нанозимы разработан ДНК-сенсор. 6. ДНК-сенсор с нанозимными электрокаталитическими метками. На основе функционализированных азидо-группами нанозимов «искусственная пероксидаза» разработан ДНК/РНК-сенсор «сэндвич»-типа. Последовательная гибридизация олигонуклеотида HULC с зондами на электроде, а затем с мечеными цепочками позволяет детектировать этот маркер карциномы в концентрациях от 0.2 нМ до 100 нМ (Kd=2.8±0.2·10^-8 M). Методом введено-найдено показана возможность детекции HULC в сыворотке крови в наномолярных концентрациях. В терапии двойного действия важно заменить пероксидазу, инактивируемую протеазами, на нанозимы. 7. Препараты двойного действия на основе нанозимов «искусственная пероксидаза» для снижения содержания активных форм кислорода. Синтезированы гибридные наночастицы на основе миРНК (подавление экспрессии белка ганкирина PSMD10) и нанозимов «искусственная пероксидаза», инкапсулированных в липидные оболочки. Сколковским институтом науки и технологий показано существенное снижение уровня АФК в опухолевых тканях, обеспечивая двукратное увеличение эффективности противоопухолевого препарата. В Проекте предусмотрена разработка систем сбора и анализа конденсата выдыхаемого воздуха без охлаждения, чтобы избежать разбавления образца парами воды. 8. Электроаналитическая система детекции компонентов аэрозоля на основе капиллярной конденсации. Для детекции компонентов аэрозоля в момент выдоха электрохимические сенсоры на основе берлинской лазури модифицированы KF (≈6 мкмоль·см-2) и конденсирующим покрытием на основе оксида графена (> 15 мкг·см-2). В режиме предварительной поляризации (0.65 В) система обеспечивает детекцию Н2О2 от 1 мкМ до 15 мкМ. Сигнал слабо зависит от скорости потока, так что система применима для экспресс-детекции пероксида в выдыхаемом аэрозоле. 9. Система сбора выдыхаемого аэрозоля на основе смешения турбулентных потоков. Моделируя воздушные потоки, разработана система сбора выдыхаемого аэрозоля, позволяющая получить концентрацию Na+ на 1-2 порядка выше, чем в системах с охлаждением. Разброс значений ионной силы, оцененной из спектров электрохимического импеданса образцов здоровых субъектов, неделями оставался в пределах погрешности. Биосенсоры на основе нанозимов «искусственная пероксидаза» позволяют детектировать глюкозу и лактат в собранных образцах. Заключительные разделы Проекта посвящены неинвазивно собираемому поту и биосенсорам для его анализа. 10. Сравнение уровней глюкозы в поте и крови больных для неинвазивного мониторинга сахарного диабета. Средняя скорость потоотделения больных сахарным диабетом (12 женщин и 10 мужчин) примерно в два раза ниже, чем для здоровых субъектов, что достаточно для непрерывного мониторинга проточными биосенсорами. Выявлена взаимосвязь между содержаниями глюкозы в поте и крови (статистика по 20 больным). Неинвазивный контроль гипо-/гипергликемии возможен благодаря наблюдаемому для одного и того же больного постоянству отношения концентрации глюкозы в крови к ее содержанию в поте вплоть до месяца. 11. Лактатные биосенсоры с пролонгированным линейным диапазоном и неинвазивный мониторинг гипоксии с их помощью. Ввиду необходимости детектировать высокие концентрации лактата биосенсор покрывался дополнительной мембраной перфторсульфонированного иономера. Линейный диапазон такого биосенсора (от 0.5 мМ до 100 мМ) превышает диапазон физиологических содержаний лактата как в поте, так и в крови человека при стабильности: ≈100% в течение 5 часов в 20 мМ лактата или 3 часа в потоке пота. Разработанный лактатный биосенсор был интегрирован в проточный потосборник, и полученный монитор крепился на здорового добровольца. Во время тренировки (приседания) концентрация лактата в поте с зоны работающей мышцы (бедра) росла, а после окончания упражнений – быстро снижалась; динамика оказалась схожей с изменением содержания лактата в капиллярной крови. Это позволяет использовать монитор для непрерывного неинвазивного контроля гипоксии.
- Добавил в систему: Карякин Аркадий Аркадьевич
Источник финансирования НИР
| грант РНФ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 19 мая 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Нанозимы «искусственная пероксидаза» для медицинской диагностики и терапии |
| Результаты этапа: 1. Определение бимолекулярных констант скорости взаимодействия комплекса нанозима и восстанавливающего субстрата с пероксидом водорода для нанозимов различного размера с использованием подходов стационарной ферментативной кинетики. На предыдущей стадии проекта был установлен механизм действия нанозимов «искусственная пероксидаза», что позволило оценить бимолекулярные константы отдельных элементарных стадий. Было также показано, что активность каталитически синтезированных наночастиц берлинской лазури существенно зависит от их диаметра. Это обусловило необходимость выявить зависимость констант элементарных стадий от размера нанозимов. Скорость-лимитирующей является стадия окисления полученного комплекса нанозим-восстанавливающий субстрат пероксидом водорода, характеризующаяся константой k2. Зависимость последней от диаметра нанозима линеаризуется для разных восстанавливающих субстратов в билогарифмических координатах с тангенсом угла наклона, приблизительно равным 3.0. Это указывает на то, что пероксид водорода одинаково хорошо реагирует с активными центрами катализатора, расположенными во всем объеме наночастиц. Очевидно, восстанавливающие субстраты ввиду их размера не способны так же легко проникать в объем наночастиц. Соответствующая зависимость линеаризуется с тангенсом наклона приблизительно 2.5. Ввиду кубической зависимости скорость-лимитирующей константы от размера следует ожидать сверх-высоких значений бимолекулярных констант. Действительно, для нанозимов с диаметром около 300 нм значения k2 для случая низкопотенциального субстрата желтой кровяной соли достигают ~2·10^11 М-1с-1, для катехола ~2·10^10 М-1с-1. Полученные значения на 3-4 порядка величины превосходят константы для ферментов пероксидаз для стадии их взаимодействия с пероксидом водорода (наиболее быстрой стадии) и на 4-5 порядков – константы скорость-лимитирующей стадии действия фермента. Таким образом, для больших нанозимов бимолекулярные константы скорость-лимитирующих стадий на 4 – 5 порядков выше по сравнению с ферментом пероксидазой. 2. Применение подходов предстационарной кинетики ферментативных реакций для исследования механизма действия нанозимов. Успехи в исследовании стационарной кинетики восстановления пероксида водорода, катализируемого нанозимами «искусственная пероксидаза», полученные в результате выполнения основной части проекта, обусловили интерес к предстационарной кинетике, тем более что данный метод к нанозимам ранее никем не применялся. Поскольку регистрация скорости пероксидазной реакции возможна только на последней стадии, в начале было решено исследовать предстационарную кинетику восстановления берлинской лазури различными субстратами, то есть в отсутствии пероксида водорода. Как оказалось, даже в такой простейшей системе не представляется возможным оценивать константу скорости реакции по псевдопервому порядку, поскольку зависимость концентрации продукта от времени в полулогарифмических координатах не линеаризуется. По-видимому, это связано с влиянием обратной реакции, распада нанозим-субстратного комплекса, даже на миллисекундных временах. Соответственно было решено исследовать тангенс угла наклона в полулогарифмических координатах в начальный момент времени. Найденные значения констант оказались линейно зависящими от концентрации восстанавливающего субстрата. Это позволяет оценить кажущуюся бимолекулярную константу скорости делением константы скорости псевдопервого порядка на концентрацию восстанавливающего субстрата. Как оказалось, кажущаяся бимолекулярная константа уменьшается до трех порядков при увеличении формального редокс-потенциала субстрата в пределах 0.25 В. Такое поведение константы подтверждает, что активность субстратов в реакции восстановления пероксида водорода, катализируемой нанозимами «искусственная пероксидаза», существенно зависит от их восстанавливающей способности, то есть определяется термодинамикой восстановления каталитически синтезированной белинской лазури. 3. Заключительные исследования, посвященные синтезу сверхмалых нанозимов в обращенных мицеллах и исследованию их каталитической активности. В течение основного проекта были синтезированы сверхмалые нанозимы, диаметр которых (4-5 нм) практически совпадает с размером фермента пероксидазы. Установлено, что зависимость каталитической константы от диаметра наночастиц для сверхмалых наночастиц, каталитически синтезированных в системе обращенных мицелл, принадлежат той же зависимости, что и константы для традиционно синтезированных нанозимов. Таким образом, полученные сверхмалые наночастицы берлинской лазури можно отнести к семейству нанозимов «искусственная пероксидаза». Сверхмалые нанозимы ввиду их размеров, намного уступающих размерам каталитически синтезированных наночастиц берлинской лазури без использования темплатов, позволили дополнить размерные зависимости физико-химических свойств последних. Модификация электродов берлинской лазурью путем нанесения суспензии наночастиц впервые в истории модифицированных электродов позволила оценить долю материала, вовлеченную в электрохимическую реакцию. Эта доля существенно отличающаяся от 100%, оказалась зависящей от диаметра наночастиц. Как оказалось, доля электроактивной берлинской лазури в случае модификации сверхмалыми нанозимами (93%) прекрасно укладывается в полученную ранее зависимость. Таким образом, сверхмалые наночастицы, полученные методом темплатного каталитического синтеза берлинской лазури, позволяют проверять и дополнять размерные зависимости физико-химических свойств нанозимов «искусственная пероксидаза». По синтезу и каталитическим свойствам сверхмалых нанозимов подготовлена и опубликована статья в журнале Bioelectrochemistry (Q1; IF = 5.76). 4. Создание на основе наночастиц берлинской лазури твердоконтактных ионселективных амперометрических сенсоров на K+/Na+ для анализа биологических жидкостей. Ранее в рамках проекта нами был продемонстрирован принципиально новый подход к регистрации сигнала твердоконтактных ионселективных электродов. В продолжении проекта проточно-инжекционная амперометрия неэлектроактивных ионов (калия и натрия) применена к электродам на основе берлинской лазури в качестве твердого контакта. Установлено, что берлинская лазурь обладает собственной селективностью к ионам калия: отклик на ионы калия в 2.5 - 4 раза превышает таковой на ионы натрия. Как в кислой, так и в нейтральной (рН 6.0) средах максимальная величина отклика достигается при потенциале 0.1 В. Коэффициент чувствительности сенсоров на основе наночастиц в 6 раз выше, чем у сенсоров на основе плёнок. Коэффициент селективности (kNa/K) для сенсоров на основе пленок берлинской лазури лежит в диапазоне от 0.15 до 0.42, в то время как для сенсоров на основе наночастиц он варьируется от 0.31 до 0.54. Селективности к ионам натрия при использовании берлинской лазури в качестве твердого контакта удается добиться нанесением дополнительной натрий-селективной мембраны на основе ионофора-6 (Bis[(12-crown-4)methyl] dodecylmethylmalonate). В результате чувствительность сенсора к калию снижается на порядок, а к натрию практически не изменяется. Таким образом, электроды на основе наночастиц берлинской лазури и натрий-селективных мембран оказываются в 1.5 – 5 раз селективнее к ионам натрия. С другой стороны, применение калий-селективных мембран на основе валиномицина в качестве ионофора приводит к дальнейшему улучшению как чувствительности, так и селективности к ионам калия. Увеличение толщины ионоселективной мембраны ведет к повышению чувствительности сенсора. Напротив, более тонкие мембраны в нейтральной среде являются более селективными. Преимущество сенсоров на основе берлинской лазури и ионоселективной мембраны в проточно-инжекционной амперометрии состоит в том, что отклик на ионы калия практически не зависит от pH и состава внешнего раствора, что недостижимо в традиционной потенциометрии. Предложен одностадийный метод изготовления твердоконтактных ионоселективных электродов. При этом наночастицы берлинской лазури вносятся непосредственно в смесь для формирования ионоселективной мембраны. Для сенсоров на основе такой, композитной, мембраны чувствительность к ионам калия оказалась в 5 раз выше и не зависела от задаваемого потенциала. Таким образом, кроме технологического преимущества (одностадийного приготовления), полученные сенсоры характеризовались также улучшенными аналитическими характеристиками. 5. Разработка биосенсоров для непрерывного мониторинга физиологических концентраций лактата в поте с дополнительной диффузионно-лимитирующей мембраной. Концентрация лактата в поте значительно выше, чем в крови: от 4 до 60 мМ в норме и до 60–100 мМ при интенсивных физических нагрузках. Таким образом, для анализа неразбавленного пота верхний предел обнаружения лактатных биосенсоров должен быть не менее 100 мМ. Можно предположить, что дополнительная полимерная мембрана, благодаря своему отрицательному заряду, ограничивает транспорт отрицательно заряженного субстрата (лактата) и тем самым влияет на динамический диапазон биосенсора. Действительно, при концентрации иономера в исходной смеси для формирования дополнительной мембраны 3.5 % и выше наблюдается резкое смещение диапазонов определяемых концентраций в сторону высоких содержаний лактата. Последнее, очевидно, связано с созданием диффузионных затруднений из-за применения дополнительной мембраны. С другой стороны, перевод действия сенсора в диффузионно-контролируемый режим должен вызвать повышение его операционной стабильности. Действительно, время полуинактивации разработанных лактатных биосенсоров повышается в десятки раз. Биосенсор с диффузионно-лимитирующей мембраной, содержащей 4 % иономера, представляется наиболее оптимальным по аналитическим характеристикам: широкий динамический диапазон (0.5–500 мМ), высокая чувствительность (0.11 ± 0.03 мА М-1 см-2) и увеличенное до нескольких десятков часов время полуинактивации (35 ± 1 ч). Линейный диапазон такого биосенсора простирается от 0.5 до 100 мМ лактата, что даже превышает диапазон физиологических концентраций лактата как в неразбавленном поте, так и в крови человека. Что касается операционной стабильности, биосенсор с дополнительной полимерной мембраной сохраняет на уровне 100% начального токового отклика в течение 5 ч в 20 мМ лактата. Кроме того, даже в растворе с экстремально высокой концентрацией лактата, 60 мМ, в течение первых 2 часов непрерывного мониторинга не наблюдается снижения токового отклика. Также была исследована стабильность разработанного биосенсора непосредственно в неразбавленном поте: стабильный токовый отклик наблюдается в течение 3 часов непрерывной работы в потоке пота, что достаточно для анализа пота даже во время длительных тренировок. По результатам данного и следующего разделов подготовлена и опубликована статья в журнале Analytical Chemistry (Q1; IF = 8.01). 6. Непрерывный мониторинг уровня лактата в поте проточным биосенсором с диффузионной мембраной в сочетании с параллельным периодическим контролем в крови в условиях гипоксии, вызванной тяжелой физической нагрузкой. Для неинвазивного мониторинга гипоксии разработанный лактатный биосенсор был интегрирован в проточный потосборник. Чувствительность биосенсоров в составе неинвазивного монитора всего на 10–15 % ниже, чем аналогичная величина, полученная в периодическом режиме при перемешивании. Разработанный монитор гипоксии прошел валидизацию с использованием альтернативного метода. Наблюдается корреляция между онлайн-показаниями монитора гипоксии и результатами проточно-инжекционного анализа: коэффициент корреляции Пирсона превышает 0.99. Апробацию проводили во время тренировки (приседания) здорового добровольца, использовали одновременно два монитора. Первый монитор помещали на поверхность кожи бедра (рабочая мышца), а второй – на поверхность кожи предплечья (нерабочая мышца). Независимо концентрацию лактата в поте контролировали в образцах, отобранных на выходе из монитора. Во время тренировки концентрация лактата в поте с работающей мышцы растет, а после окончания упражнений – довольно быстро снижается; динамика схожа с изменением концентрации лактата в крови. Напротив, лактат в поте с неработающей мышцы существенно не меняется во время тренировки. Это согласуется с ранее полученными нашей научной группой данными, что только концентрация лактата в поте, собранном с области над работающими мышцами, может наряду с уровнем лактата в крови выступать в качестве индикатора гипоксии в ходе изнурительной физической нагрузки. 7. Создание систем для конденсации выдыхаемого воздуха в циклонном потоке. Оптимизация конструкции системы на основе параметров эффективности (в том числе скорости конденсации). Предложена конструкция ячейки для конденсации выдыхаемого воздуха, использующая геометрию циклонных сепараторов. Моделирование профилей воздушной среды, имитирующей упрощенный выдох человека, в такой ячейке в среде Solidworks, показало возникновение турбулентности. Кроме того, в угловых элементах поток сместили вбок от центральной оси поперечного сечения и предусмотрели ответвление для потенциального отбора слюны с обратным клапаном, сменный мундштук, а также крепление пластиковых микропробирок на выходе для сбора образца. Производительность разработанной ячейки варьируется от 2 до 5 микролитров отбираемого конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ) в минуту. Проведено определение ключевых метаболитов – глюкозы и лактата – в образцах отобранного конденсата. Содержание лактата находится в промежутке от 40 до 250 мкМ, содержание глюкозы - от 5 до 200 мкМ. Правильность измерений концентрации лактата в биологических образцах была подтверждена методом ионной хроматографии. Предварительное сравнение образцов КВВ, отобранных различными методами показывает, что конденсат, отобранный с использованием переохлаждения (EcoScreen (Erich Jaeger GmbH, Германия), система на основе элементов Пельтье) содержит в десятки раз меньше ионов натрия (данные ИСП-МС) по сравнению с конденсатом, полученным при помощи предложенной ячейки. Это указывает на то, что отказ от стадии охлаждения позволяет уменьшить разбавление КВВ сконденсированными парами воды, содержащимися в выдохе в значительном количестве. 8. Разработка метода оценки антиоксидантной активности по каталитическому и некаталитическому поглощению пероксида водорода с использованием свободных и иммобилизованных нанозимов «искусственная пероксидаза». Антиоксидантную активность (АОА) образца характеризовали константой скорости реакции поглощения пероксида водорода (природного стабильного оксиданта) под действием антиоксидантов различной природы. Показано, что наночастицы берлинской лазури сами по себе не проявляют антиоксидантной активности. Действительно, ни оксидазная (восстановление кислорода), ни каталазная (диспропорционирование пероксида водорода) активности для каталитически синтезированных наночастиц берлинской лазури не отмечены. Кроме способности пищевых продуктов непосредственно восстанавливать пероксид водорода (так называемая, некаталитическая АОА), была изучена и каталитическая АОА. Действительно, наблюдалось значительное усиление антиоксидантной активности образцов соков при добавлении нанозимов, даже для образцов, собственная некаталитическая АОА которых ранее была за пределами чувствительности метода. При этом наблюдалась линейная зависимость констант скорости разложения пероксида водорода от концентрации добавленных наночастиц. Измеренная антиоксидантная активность не зависела от используемого сенсора, но зависела от исходной некаталитической антиоксидантной активности. Таким образом, в дополнении к предложенному ранее методу оценки АОА по разложению природного оксиданта, пероксида водорода, разработан каталитический метод, сущность которого заключается в катализе нанозимами восстановления Н2О2 пищевыми продуктами. Метод особенно ценен для продуктов, которые практически не проявляют некаталитического поглощения пероксида водорода. 9. Подготовка публикаций в высокорейтинговых журналах. В течение этапа подготовлено и опубликовано 2 статьи в журналах Bioelectrochemistry (Q1; IF = 5.76) и Analytical Chemistry (Q1; IF = 8.01), а также обзор в журнале Microchimica Acta (Q1; IF = 6.41). Получен патент на изобретение. 10. Участие в конференциях. На международных и Всероссийских конференциях сделано 2 пленарных, 4 устных и 3 стендовых доклада. 11. Участие в конкурсах научных работ молодых ученых и студентов. Основные исполнители проекта Комкова М.А., Дабосс Е.В. и Андреев Е.А. стали лауреатами премии Правительства Москвы молодым учёным. Член научного коллектива проекта Щербачева Е.В. награждена медалью РАН с премией для студентов высших учебных заведений России, а также стала победителем программы УМНИК 12. Защита курсовых и дипломных работ студентами химического факультета МГУ. Под руководством участников научного коллектива выполнены и защищены 2 дипломные работы по аналитической химии, а также 3 курсовые работы по аналитической химии и 2 курсовые работы по физической химии. | ||
| 2 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Нанозимы «искусственная пероксидаза» для медицинской диагностики и терапии |
| Результаты этапа: 1. Бимолекулярные константы скорости как функции размера нанозимов. На предыдущей стадии проекта был установлен механизм действия нанозимов «искусственная пероксидаза». Скорость-лимитирующей является стадия окисления комплекса нанозим-восстанавливающий субстрат пероксидом водорода (константа k2). Зависимость последней от диаметра нанозима линеаризуется в билогарифмических координатах с тангенсом угла наклона ~3.0. Таким образом, пероксид водорода одинаково хорошо реагирует с активными центрами, расположенными во всем объеме наночастиц. Такая зависимость для восстанавливающих субстратов (с ограниченной способностью проникать внутрь наночастиц) имеет тангенс наклона ~2.5. Для нанозимов с диаметром ~300 нм k2 для желтой кровяной соли достигает ~2·10^11 М-1с-1, для катехола ~2·10^10 М-1с-1. Эти значения на 3-4 порядка величины выше констант взаимодействия ферментов пероксидаз с Н2О2 и на 4-5 порядков выше констант скорость-лимитирующей стадии действия фермента. 2. Применение подходов предстационарной кинетики ферментативных реакций для исследования механизма действия нанозимов. Предстационарная кинетика для изучения катализа нанозимами ранее не применялась. Значения констант скорости псевдопервого порядка, найденные из наклона зависимости концентрации продукта от времени в начальный момент, линейно зависят от концентрации восстанавливающего субстрата. Кажущаяся бимолекулярная константа, найденная из их отношения, уменьшается до трех порядков при увеличении формального редокс-потенциала субстрата в пределах 0.25 В. Такое поведение константы подтверждает, что активность субстратов в катализе нанозимами «искусственная пероксидаза» существенно зависит от их восстанавливающей способности. 3. Заключительные исследования, посвященные синтезу сверхмалых нанозимов в обращенных мицеллах и их активности. В течение основного проекта были синтезированы сверхмалые нанозимы, диаметр которых (4-5 нм) практически совпадает с размером фермента пероксидазы. Модификация электродов берлинской лазурью путем нанесения суспензии наночастиц впервые позволила оценить долю электроактивного материала модифицированных электродов. Как оказалось, доля электроактивной берлинской лазури в случае модификации сверхмалыми нанозимами (93%) прекрасно укладывается на полученную ранее зависимость. Таким образом, сверхмалые наночастицы, полученные методом темплатного каталитического синтеза берлинской лазури, позволяют проверять и дополнять размерные зависимости физико-химических свойств нанозимов «искусственная пероксидаза». По синтезу и каталитическим свойствам сверхмалых нанозимов подготовлена и опубликована статья в журнале Bioelectrochemistry (Q1; IF = 5.76). 4. Создание твердоконтактных ионселективных амперометрических сенсоров на K+/Na+. Ранее в рамках проекта нами была предложена проточно-инжекционная амперометрия как альтернатива потенциометрии для твердоконтактных ионселективных электродов. Берлинская лазурь обладает селективностью к ионам калия, отклик на них в 2.5 - 4 раза выше, чем на ионы натрия. Селективности к ионам натрия (kNa/K = 1.5 - 5) удается добиться нанесением дополнительной натрий-селективной мембраны на основе ионофора-6, понижающей чувствительность к ионам калия на порядок. С другой стороны, калий-селективные мембраны на основе валиномицина приводят к улучшению как чувствительности, так и селективности к ионам калия. Преимущество проточно-инжекционной амперометрии с наночастицами берлинской лазури в качестве твердого контакта, недостижимое в потенциометрии, это независимость отклика от pH. Предложен одностадийный метод изготовления сенсоров, при котором наночастицы берлинской лазури вносятся непосредственно в смесь для формирования ионоселективной мембраны. Для сенсоров на основе такой, композитной, мембраны чувствительность к ионам калия оказалась в 5 раз выше и не зависела от задаваемого потенциала. 5. Биосенсоры для непрерывного мониторинга лактата в поте на основе дополнительной диффузионно-лимитирующей мембраны. Ввиду необходимости детектировать высокие концентрации лактата (содержание в поте от 4 мМ до 60 мМ в норме и до 60 мМ – 100 мМ при интенсивных физических нагрузках) биосенсор покрывался дополнительной отрицательно заряженной мембраной. Биосенсор с диффузионно-лимитирующей мембраной, содержащей 4 % перфторсульфонированного иономера, наиболее оптимален по аналитическим характеристикам: широкий диапазон (0.5 мМ – 500 мМ), достаточная чувствительность (0.11 ± 0.03 мА М-1 см-2) и высокая операционная стабильность (~100% начального отклика в течение 5 часов в 20 мМ лактата или 3 часа в потоке пота). Линейный диапазон такого биосенсора от 0.5 мМ до 100 мМ лактата перекрывает диапазон физиологических концентраций лактата как в поте, так и в крови человека. По результатам данного и следующего разделов опубликована статья в наиболее престижном аналитическом журнале: Analytical Chemistry (Q1; IF = 8.01). 6. Непрерывный мониторинг лактата в поте биосенсором с диффузионной мембраной в условиях гипоксии. Для неинвазивного мониторинга гипоксии разработанный лактатный биосенсор был интегрирован в проточный потосборник. Правильность работы монитора подтверждена независимым методом: коэффициент корреляции Пирсона >0.99. Один монитор помещали на поверхность кожи бедра (рабочая мышца), другой –предплечья (нерабочая мышца). Во время тренировки (приседания) здорового добровольца концентрация лактата в поте с работающей мышцы растет, а после окончания упражнений – довольно быстро снижается; динамика схожа с изменением концентрации лактата в крови. Напротив, содержание лактата в поте с неработающей мышцы существенно не меняется во время тренировки. Следовательно, содержание лактата в поте может служить индикатором гипоксии в ходе интенсивной физической нагрузки. 7. Создание систем для конденсации выдыхаемого воздуха в циклонном потоке. Предложена конструкция ячейки для конденсации выдыхаемого воздуха, использующая геометрию циклонных сепараторов. Содержание лактата в отбираемом конденсате находится в промежутке от 0.04 мМ до 0.25 мМ, содержание глюкозы - от 0.005 мМ до 0.2 мМ. Предварительное сравнение показывает, что конденсат, отобранный с использованием переохлаждения, содержит в десятки раз меньше ионов натрия (данные ИСП-МС) по сравнению с конденсатом, полученным при помощи предложенной ячейки. 8. Оценка антиоксидантной активности по каталитическому и некаталитическому поглощению пероксида водорода. Антиоксидантную активность (АОА) характеризовали константой скорости поглощения Н2О2. Показано, что наночастицы берлинской лазури не проявляют АОА. Кроме способности пищевых продуктов непосредственно восстанавливать Н2О2 (некаталитическая АОА), изучена и каталитическая АОА. В присутствии нанозимов АОА появляется даже для образцов, собственная некаталитическая АОА которых не регистрировалась. Каталитическая антиоксидантная активность не зависит от используемого сенсора, но зависит от исходной некаталитической антиоксидантной активности. 9. Подготовка публикаций в высокорейтинговых журналах. В течение этапа подготовлено и опубликованы статьи в журналах Bioelectrochemistry (Q1; IF = 5.76) и Analytical Chemistry (Q1; IF = 8.01). Получен патент на изобретение. Обзор в журнале Microchimica Acta (Q1; IF = 6.41) под заголовком «Берлинская лазурь: от наилучшего электрокатализатора до нанозимов, побеждающих природный фермент» резюмирует основные достижения проекта до настоящего времени. 10. Участие в конференциях. На международных и Всероссийских конференциях сделано 2 пленарных, 4 устных и 3 стендовых доклада. 11. Участие в конкурсах научных работ молодых ученых и студентов. Комкова М.А., Дабосс Е.В. и Андреев Е.А. стали лауреатами премии Правительства Москвы. Щербачева Е.В. награждена медалью РАН, а также стала победителем программы УМНИК. 12. Защита курсовых и дипломных работ студентами химического факультета МГУ. Под руководством участников проекта выполнены и защищены 2 дипломные и 5 курсовых работ. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".