ИСТИНА

Проект направлен на решение фундаментальной задачи, связанной с исследованием молекулярных механизмов эволюционных процессов, ведущих к появлению в геноме новых генов и формированию новых генных сетей.

The project is aimed at solving a fundamental problem related to the study of the molecular mechanisms of evolutionary processes leading to the appearance of new genes in the genome and the formation of new gene networks. The most important sources of new components of the genome are mobile elements, which can occupy more than half of the nucleotide sequence of the genome of higher eukaryotes, as well as viruses, mainly retroviruses, whose life cycle includes the obligatory integration of a DNA copy into the host genome. Among the mobile component of the genome, a special place is occupied by retroelements, which are similar in their mechanisms of integration into the genome with retroviruses. By integrating into the genome, both the sequences of retroviruses and the sequences of retroelements remain there forever, either degrading or undergoing selection. The process of positive selection aimed at preserving certain sequences of mobile elements and retroviruses in the host genome is commonly called molecular domestication. In the course of domestication, the sequences can be preserved entirely or undergo changes that contribute to a change in function and the emergence of new adaptations in the organism. There are many examples of evolutionary transformations of the sequences of mobile elements and retroviruses that led to the emergence of new regulatory gene sequences, as well as a number of examples of molecular domestication of key retroelement genes (gag, pol, env). The most famous case of env gene domestication is syncytins, which are necessary for the placenta to function and determine the formation of syncytiotrophoblast. Most examples of gag domestication are described in vertebrates, in particular in mammals, in which many domesticated gag genes have been transformed into transcription factors that regulate practically all known biological processes - proliferation, differentiation and programmed cell death, embryogenesis, metabolism, inflammation reactions, etc. Drosophila is a model for studying the molecular processes associated with the evolution of sequences of retroelements and retroviruses in the host genome, since, firstly, in the genome of the most studied species, Drosopila melanogaster, two domesticated retroelement genes - Gagr (a homolog of the gag gene of retroelements, discovered in our laboratory) and Iris (homologue of env retroelements); secondly, to date, the genomes of more than 20 species of Drosophila and dozens of other insect species have been sequenced, which makes it possible to effectively identify the evolutionary transformations of domesticated genes by comparative genomic analysis. According to bioinformatics analysis, the Gagr gene was domesticated in the ancestors of Hemiptera and insects with complete transformation. Protein products of the Gagr gene of its homologues in different Drosophila species have a highly conserved structure, but, despite this, gene inactivation does not lead to visible changes in the phenotype. Nevertheless, according to the data of large-scale proteomic analysis and according to the data obtained in our and other laboratories, the Gagr gene in D. melanogaster is a component of the protein complex involved in the stress response. The specific task to be solved by this project is the study of evolutionary processes that led to the formation of a new function in the domesticated gag gene and its tissue-specific adaptation to the participation of the stress response in Drosophila. The data obtained in this work will contribute to expanding the understanding of the role of molecular domestication in the formation of new genetic networks involved in the stress response in insects. Studies on a model object can be useful for extrapolation to other types of insects (hymenoptera, beetles, lepidoptera) of agricultural importance.

Будет получена линия D.melanogaster с нокдауном гена Gagr, и будут проведены исследования морфо-физиологических характеристик мутантных самцов и самок на стандартной среде и в условиях стресса, индуцированного несколькими стрессорами (менадионом, парактватом, персульфатом аммония) – измерение продолжительности жизни, измерение физиологических характеристик (плодовитость, двигательная активность). Будут секвенированы и проанализированы транскриптомы самцов и самок D.melanogaster с нокдауном гена Gagr. Будут выявлены гены с дифференциальной экспрессией, регулируемой в ответ на стресс, вызванный персульфатом аммония. Планируется выявить половой диморфизм ответа на стресс. По результатам анализа транскриптомов будет составлена панель стресс-индуцируемых генов, которую можно будет использовать в дальнейшем анализе мух с нокдауном гена Gagr в отдельных тканях. Будет осуществлена верификация панели методом ОТ-ПЦР. Будут подобраны сублетальные концентрации персульфата аммония, менадиона и параквата для разных видов (D.mauritiana, D. simulans, D. yakuba, D. teissieri, D. pseudoobscura, D. virilis, D. funebris) отдельно для самцов и самок и изучено влияние персульфата аммония на продолжительность жизни у разных видов дрозофил. Будет проведено сравнение стресс-индуцированных изменений в экспрессии гена Gagr в ответ на персультфат аммония в сравнение с D.melanogaster. Будет проведен анализ транскрипции гомологов гена Gagr у видов дрозофил в ответ на персультфат аммония в сравнении с D.melanogaster и сделаны выводы об значимости обнаруженных изменений в 5’-регуляторной области гена Gagr у разных видов дрозофил с выраженностью ответа на стрессовое воздействие. Будет проведен биоинформатический анализ гомологичных комплексов Gagr и его партнеров (14-3-3epsilon, Pdi, eIF3j, CG6013, CG3687) у видов с жесткокрылых, полужесткокрылых, перепончатокрылых, чешуекрылых с секвенированными геномами, будут сделаны выводы об особенностях организации комплекса у насекомых и возможности экстраполяции полученных на дрозофиле данных на другие виды насекомых (перепончатокрылые, жуки, чешуекрылые), имеющих сельскохозяйственное значение.

Обнаружен и охарактеризован ген Gagr— геномный гомолог гена gag ДКП-ретротранспозонов, появившийся в геноме дрозофилы в результате молекулярной доместикации (Nefedova et al., 2014). Для него изучена тканевая и онтогенетическая специфичность экспрессии, показано наличия белкового продукта, было исследовано изменение его экспрессии в ответ на различные внешние воздействия, при этом обнаружена индукция его экспрессии в ответ на введение некоторых патогенов, а также при наличии активно перемещающейся копии эндогенного ретровируса gypsy (Makhnovskii et.al. 2016; Nefedova, Kim, 2018). Выявлено, что ген Gagr есть у всех видов Drosophila, его структура высококонсервативна, что свидетельствует о действии на ген стабилизирующего отбора и о важной функции гена. Показано, что белок Gagr имеет трансмембранную локализацию, которая также появилась у Sophophora в процессе эволюции (Nefedova et al., 2014). В ходе биоинформатического анализа обнаружено, что промоторная область гена Gagr содержит мотив связывания с транскрипционным фактором kayak консервативен у видов рода Drosophila, а мотив связывания со Stat92E появляется у только подгруппы melanogaster (Makhnovskii et al., 2020). Показано, что стресс, вызванный персульфатом аммония, приводит к значительной активации транскрипции гена Gagr у имаго D. melanogaster в тканях каркаса, уровень этой активации зависит от предъявления стрессового фактора и снижается в короткий период восстановления. Изоформа транскрипта Gagr-A наиболее представлена в базальных условиях и играет основную роль в изменении экспрессии Gagr в ответ на стрессовый фактор (Makhnovskii et al., 2020).

Будет получена линия D.melanogaster с нокдауном гена Gagr, и будут проведены исследования морфо-физиологических характеристик мутантных самцов и самок на стандартной среде и в условиях стресса, индуцированного несколькими стрессорами (менадионом, парактватом, персульфатом аммония) – измерение продолжительности жизни, измерение физиологических характеристик (плодовитость, двигательная активность). Будут секвенированы и проанализированы транскриптомы самцов и самок D.melanogaster с нокдауном гена Gagr. Будут выявлены гены с дифференциальной экспрессией, регулируемой в ответ на стресс, вызванный персульфатом аммония. Планируется выявить половой диморфизм ответа на стресс. По результатам анализа транскриптомов будет составлена панель стресс-индуцируемых генов, которую можно будет использовать в дальнейшем анализе мух с нокдауном гена Gagr в отдельных тканях. Будет осуществлена верификация панели методом ОТ-ПЦР. Будут подобраны сублетальные концентрации персульфата аммония, менадиона и параквата для разных видов (D.mauritiana, D. simulans, D. yakuba, D. teissieri, D. pseudoobscura, D. virilis, D. funebris) отдельно для самцов и самок и изучено влияние персульфата аммония на продолжительность жизни у разных видов дрозофил. Будет проведено сравнение стресс-индуцированных изменений в экспрессии гена Gagr в ответ на персульфат аммония в сравнение с D.melanogaster. Будет проведен анализ транскрипции гомологов гена Gagr у видов дрозофил в ответ на персульфат аммония в сравнении с D.melanogaster и сделаны выводы об значимости обнаруженных изменений в 5’-регуляторной области гена Gagr у разных видов дрозофил с выраженностью ответа на стрессовое воздействие. Будет проведен биоинформатический анализ гомологичных комплексов Gagr и его партнеров (14-3-3epsilon, Pdi, eIF3j, CG6013, CG3687) у видов с жесткокрылых, полужесткокрылых, перепончатокрылых, чешуекрылых с секвенированными геномами, будут сделаны выводы об особенностях организации комплекса у насекомых и возможности экстраполяции полученных на дрозофиле данных на другие виды насекомых (перепончатокрылые, жуки, чешуекрылые), имеющих сельскохозяйственное значение. Будут получены пять трансгенных линий с выключением гена Gagr в отдельных тканях (нервной системе, генеративных тканях, жировом теле, задней кишке, эмбриональных клетках). Будут изучены морфофизиологические характеристики мутантов (продолжительности жизни, плодовитость, двигательная активность). Будет проведен анализ транскрипции панели стресс-чувствительных генов и генов-партнеров Gag в целых мухах и отдельных тканях с целью выявления значимости экспрессии гена Gagr в исследуемых тканях. Будут подведены итоги работы и подготовлено 3 публикации в журнале WoS/Scopus.