| Результаты этапа: Впервые проведено комплексное исследование актинобиомов, ассоциированное с муравьями различных видов, с целью оценки их биотехнологического потенциала и изучения экологических аспектов зоо-микробных взаимодействий .
В ассоциации с муравьями-жнецами Messor structor, черными древотоцчами Camponotus vagus, черными садовыми Lasius niger и прыткими степными Formica cunicularia, а также с материалами их гнезд были обнаружены актиномицеты-продуценты широкого ряда антибиотиков - альбомицина ẟ2, 6-гидроксилтетраценомицина Х, пикромицина, антимицинов, гранатицина, кандицидина, эхиномицина, новобиоцина.
Исследование ведется с применением разнообразных модельных микроорганизмов в качестве тест-объектов, а та же репортерной системы pDualrep2(с), позволяющей с высокой точностью детектировать новые антибиотики и одновременно определять механизм их действия.
Разработан метод целевого скрининга штаммов на способность продуцировать перспективный класс антибиотиков - сидеромицины и сидерофоры в целом. Согласно недавним исследованиям они обладают значительным потенциалом для разработки лекарственных средств, преодолевающих проблему антибиотикорезистентности.
Описан новый вид актиномицетов Amycolatopsis camponoti, выделенный из муравьев древоточцев Camponotus vagus, продуцирующий ароматический поликетидный антибиотик тетраценомицин Х и близкие соединения, обладающие способностью в различной степени ингибировать синтез белка у про- и эукариот.
Собрана уникальная коллекция штаммов, ассоциированная с муравьями среди которых проведен скрининг гидролитической активности в отношении ряда природных полимеров.
Научное исследование осуществляется с активным привлечением сил “гражданской науки” для сбора образцов. Исследование представляет интерес для энтузиастов мирмикиперов со всей России. |
| Результаты этапа: Изучение микробоценозов ассоциированных с муравьями Messor structor, Camponotus vagus, Lasius niger, Formica cunicularia отобранными в различных климато-географических зонах показало, что в каждой группе насекомых в исследуемом локусе приурочено как правило от 6 до 15 штаммов актиномицетов, примерно половина из которых проявляет активность на репортерной системе DualRep(с). Наш опыт показывает, что в случае выделения штаммов из почвы и иных местообитаний эта доля редко превышает 20%, таким образом, локусы, ассоциированные с насекомыми, можно считать весьма перспективными для поиска продуцентов антибиотиков. Доля штаммов, проявляющих активностью против тест-объектов с ненарушенной природной резистентностью к антибиотикам составляла порядка 20-30% от исходно показавших активность на искусственно-ослабленных репортерных штаммах. Эксперименты по «содержанию в неволе», помещению пойманных особей в формикарии показали, что со временем (в течении нескольких месяцев) исходное сопровождающие их микробное биоразнообразие снижается, в частности для Camponotus vagus мы через 4 месяца содержания в формикарии с помощью посева выделяли лишь один штамм из 9 исходно обнаруженных. При этом данный штамм продолжал проявлять широкий спектр антибиотической активности. Эти данные являются предварительными, требуют повторения и подтверждения с помощью метагеномных подходов, позволяющих количественно и в динамике оценивать микробное разнообразие in situ. Это будет неотъемлемой задачей в продолжении и развитии данного исследования.
Во всех группах встречались в разных пропорциях штаммы-продуценты активные в отношении ингибирования синтеза белка, нарушения ДНК и «прочих механизмов» (подавление роста репортерных штаммов без индукции экспрессии репортерных флуоресцентных белков). Не выявлено закономерностей мишеней действия антибиотиков.
В ходе реализации этапа удалось выявить наличие защитных симбиозов, приуроченных к муравьям вида Lasius niger (doi: 10.15298/rusentj.32.4.09). Из взрослых рабочих особей, отобранных на территории г. Москвы, методом посева на питательные среды выделена коллекция мицелиальных представителей филума Actinomycetota. Показано, что культивируемые участники актиномицетных сообществ приурочены к головному отделу насекомых, а в таксономическом отношении представлены родами Nocardia и Streptomyces. Среди штаммов, выделенных из муравьев внутри одной семьи, превалируют продуценты антибактериальных, а не антигрибных соединений. Актиномицеты с антибактериальной активностью подавляют развитие энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis VKPM B-6650 и Paenibacillus alvei VKM B-502, что может предполагать симбиотическую природу зоо-микробной ассоциации, а также рост оппортунистической бактерии Staphylococcus aureus ATCC 25923, одного из наиболее распространенных патогенов человека по всему миру.
В то же время отмечена способность отдельных штаммов к сдерживанию роста энтомопатогенных грибов Beauveria bassiana VKPM F-1357, Conidiobolus coronatus VKPM F-1359, а также клинически значимых дрожжей Candida albicans ATCC 14053.
Это дает подтверждение нашей гипотезы о том, что каждую колонию муравьев “сопровождает” один или несколько штаммов актиномицетов, которые помогают им адаптироваться к условиям внешней среды и воздействию неблагоприятных факторов, включая патогенов.
Требуются дальнейшие исследования для уточнения локализации возможных симбионтов и способности их синтезировать антимикробные метаболиты in vivo. С этой целью проведены работы по разрабатке методики FISH для оценки распределения микробиоты в туловищах насекомых, а также экспрессии генов биосинтетического кластера in siitu.
В ходе реализации проекта мы с помощью посевов и выделения штаммов актиномицетов, наиболее распространенных в местообитаниях и на самих муравьях, а также филогенетического анализа выявили, что наиболее распространены среди них представители рода Streptomyces, который известен как наиболее обширный источник антибиотиков и бактериальных ферментов.
Обнаруженный нами актинобактериальный штамм 3IZ-6, обладает способностью ингибировать синтез белка. Методами полифазной таксономии штамм 3IZ-6 отнесен к виду Streptomyces rochei (doi: 10.1134/S1064229323600161). Активное вещество S. rochei 3IZ-6 выделяли и очищали при помощи гравитационной обращеннофазовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии. С помощью toe-print анализа и данных масс-спектрофотометрии продуцируемый антибиотик идентифицировали как боррелидин. При совместном культивировании на твердых средах штамм 3IZ-6 способен подавлять рост фитопатогенных микроорганизмов: Fusarium solani, F. sambucinum, Botrytis cinerea, а также карантинного объекта Curtobacterium flaccumfaciens. Установлено выраженное фитотоксическое действие культуральной жидкости 3IZ-6 на семена пшеницы мягкой (Tritiсum aestivum L). Штамм Streptomyces rochei 3IZ-6 может найти применение в биотехнологии как продуцент боррелидина – ценного природного соединения с широким спектром антибиотического действия, в частности, как агент биоконтроля для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенов и сорняков.
Для обнаруженных новых ингибиторов синтеза белка эффект и степень ингибирования подтверждены в системах бесклеточной трансляции, отобраны устойчивые мутанты, которые позволят определить непосредственные центры и мишени связывания антибиотиков, а также подготовлен чистый материал лидерных молекул для исследования стадий остановки трансляции, важнейший параметр действия ингибитора.
Проведены исследования «терапевтического индекса», выявлен ряд соединений с соотношением цитотоксичность / (МПК бактерий) в районе 30, что дает надежды на возможность разработки на их основе лекарственных средств.
По нашему мнению, на основе анализа химической структуры антибиотиков, механизма их действия и филогенетической близости родства штаммов продуцентов, доминирующих в микробоценозах позволяет сделать выводы о том, что основным движущим фактором в формировании зоо-микробных взаимодействий является активность штаммов против наличествующих во внешней среде патогенов, а не филогенетическая близость или родство химических структур антибиотиков. Обнаруживаемые молекулы относятся к самым разным классам.
Анализ антагонистической активности выявил, что помимо антибиотического действия, важную роль может играть и ферментативная, в частности хитинолитическая активность для сдерживания фитопатогенных микромицетов. Для ряда штаммов, у которых обнаружена антифунгальная активность, обусловленная не вторичными метаболитами, а ферментами, получены данные по гидролизу модельного субстрата карбоксиметил-целлюлозы, а затем и коллоидного хитина. Активности гидролаз лежат преимущественно в кислом и нейтральном диапазоне и преимущественно температурно-стабильны до 50 градусов.
В продолжение проекта мы планируем детально изучить обнаруженные активности и возможность их практического применения, идентифицировать структуру ферментов и при необходимости – клонировать их для создания супер-продуцентов.
На данный момент собрана коллекция из 89 изолятов, активных в отношении модельных тест-объектов. Половина проявляет подавляющую способность относительно фитопатогенной микробиоты. Для этих штаммов разработаны и оптимизированы лабораторные регламенты культивирования и очистки активных фракций, что позволит в дальнейшем проводить более масштабные исследования механизма действия, полевые эксперименты и доклинические испытания.
У ряда изолятов обнаружена высокая гидролитическая активность, в частности хитинолитическая, способная подавлять рост патогенных микромицетов.
Задачи этапа – выполнены в полном объеме.
Полученные результаты и штаммы-продуценты представляют собой важный вклад как в экологические представления о зоо-микробных взаимодействиях, так и в прикладные области биохимии и биотехнологии. |
