Ансамбли циклодекстринов на малых липосомах - высокоэффективные наноконтейнеры для доставки гидрофобных соединенийНИР

Ensembles of cyclodextrins on small liposomes - highly efficient nanocontainers for the delivery of hydrophobic compounds

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. нсамбли циклодекстринов на малых липосомах - высокоэффективные наноконтейнеры для доставки гидрофобных соединений
Результаты этапа: Методом экструзии, а также методом ультразвуковой гомогенизации были получены серии катионных липосом из электронейтрального липида -диолеоилфосфатидилхолина (ДОФХ), и катионного липида - диолеоилтриметиламмоний хлорида (ДОТАП). Мольная доля катионного липида (v) варьировалась от 0 до 0.3. Размеры липосом варьировались о 60 до 180 нм. За взаимодействием анионных карбоксиметилциклодекстринов (КМЦД) и катионных липосом следили методом лазерного микроэлектрофореза. Параллельно методом динамического светорассеяния проводили измерение размеров частиц. Для электронейтральных липосом (v =0) добавление раствора КМЦД не приводило к изменению значений ЭФП, при этом изменения размера частиц также не фиксировалось. Добавление раствора КМЦД к 1 мг/мл суспензии положительно заряженных липосом с v =0.3 приводило к уменьшению значения ЭФП с +5.5 (мкм/с)/(В/см) до +2.4 (мкм/с)/(В/см) при концентрации КМЦД 1.25 мг/мл. Таким образом, можно сделать вывод об электростатической природе адсорбции КМЦД на поверхность катионных липосом. Следует отметить, что параллельное измерение размера частиц показало, что изменения размеров липосом не наблюдается вплоть до концентрации КМЦД 1 мг/мл- размер частиц в системе соответствовал диаметру исходных липосом 150 нм. Незначительное увеличение размера до 200 нм было зарегистрировано при концентрации КМЦД 1.25 мг/мл. При этом дальнейшее увеличение концентрации КМЦД приводило к резкой агрегации системы. В свою очередь, значения ЭФП практически не менялись. Дополнительная информация о характере взаимодействия КМЦД и катионных липосом в составе комплексов была получена методом кондуктометрии. Добавление раствора КМЦД к суспензии катионных липосом с v =0.3 привело к резкому увеличению (по отношению к контролю в системе без липосом) электропроводности системы в интервале концентраций КМЦД вплоть до 1.25 мг/мл. Дальнейшее увеличение концентрации КМЦД приводило к росту электропроводности, соответствовавшему увеличению концентрации свободных молекул КМЦД. Из полученных данных был произведён расчёт состава насыщенного молекулами КМЦД комплекса КМЦД/липосома. Состав (N) определяли как число молекул КМЦД, приходящихся на одну молекулу ДОТАП. Для липосом с v= 0.3 N cоставляло 2.5. В то время как для липосом с v= 0.15 N равнялось 2. Такое незначительное отличие может быть объяснено, что фактором, лимитирующим адсорбцию КМЦД является геометрический параметр, а не электростатический. Анализ строения межфазного комплекса, а также его визуализация были осуществлены методом атомно-силовой микроскопии на планарных липидные бислоях на подложке. Было установлено, что высота структур, формируемых на бислое молекулами КМЦД составляет в среднем до 2.5 нм. Очевидно, что олигосахариды формируют ассоциаты на поверхности бислоя. Принимая во внимания, что высота молекулы бета-циклодекстрина составляет 0.78 нм, можно рассчитать, что количество слоёв КМЦД в ассоциате может составлять до четырёх. Для исследования возможности взаимодействия комплексов ДОТАП/ДОФХ липосомы/ КМЦД с клетками были использованы отрицательно заряженные модельные клеточные мембраны- двухмикронный латекс, покрытый липидным бислоем (ЛПБ). На первом этапе методом лазерного микроэлектрофореза была изучена адсорбция катионных ДОТАП/ДОФХ липосом на поверхность ЛПБ. С увеличением концентрации липосом в системе ЭФП частиц ЛПМ уменьшалось по модулю от изначального значения – 0.5 (мкм/с)/(В/см) до нулевого значения с последующей перезарядкой до значений ЭФП +3 (мкм/с)/В/см). Это свидетельствует о электростатической адсорбции катионных липосом на поверхность ЛПБ. Далее рассматривали комплекс КМЦД/липосомы, в котором количество КМЦД составляло 25% от необходимого для формирования насыщенного комплекса. При этом комплекс имел исходный высокий поверхностный заряд (ЭФП = +4 (мкм/с)/(В/см)). Добавление комплекса к суспензии ЛПБ также приводило к нейтрализации исходного анионного заряда ЛПБ с последующей перезарядкой поверхности. Однако, точка нейтрализации наблюдалась при больших концентрация комплекса по отношению к исходным липосомам в расчёте на концентрацию липидов. Также, максимальное значение ЭФП перезаряженного комплекса составляло + 1.8 (мкм/с)/(В/см). Полученные результаты позволяют утверждать, что десорбции КМЦД при адсорбции комплекса на ЛПБ не наблюдается и комплекс реагирует с биомиметической мембраной как единое целое. Визуализация адсорбции комплексов КМЦД/липосомы на биомиметические мембраны была осуществлена методом флуоресцентной микроскопии. С этой целью использовали биомиметические мембраны на основе пятимикронных микросфер, покрытых липидным бислоем, (МПБ). Для визуализации использовали ДОТАП/ДОФХ липосомы, меченные пиреном. Для суспензии МПБ в оптический канал были видны микросферы со средним диаметром 5 микрон, в то время как во флуоресцентном канале не наблюдалось сигналов. Затем к суспензии МПБ добавляли суспензию комплекса КМЦД/липосом и анализировали на микроскопе. На микрофотографии, полученном в оптическом канале видны отдельные частицы, соответствующие МПБ. На снимке этой же области в флуоресцентном режиме микроскопа видно наличие синего цвета на всей поверхности БСЛМ, отражающее присутствие меченных пиреном объектов, т.е. комплексов КМЦД/липосомы, адсорбированных на МПБ. Для молекул КМЦД были оценены возможности включения гидрофобных биологически активных молекул: фенолфталеина, куркумина, фолиевой кислоты и паклитаксела. Установлено, что благодаря наличию ароматических фрагментов у органических молекул формируются комплексы с КМЦД по принципу хозяин-гость эквимольного состава для всех исследованных молекул, кроме куркумина, для растворения которого в воде требуется 2 молекулы КМЦД. Было обнаружено, что на катионные липосомы адсорбция молекул КМЦД с включенными биологическими соединениями происходит с такой же закономерностью, как и для «пустых» КМЦД. Было установлено, что характер адсорбции КМЦД на поверхность катионных липосом не зависит от диаметра везикул. Устойчивость комплексов к КМЦД/липосомы к диссоциации в водно-солевых средах исследовали методами динамического светорассеяния, а также методом лазерного микроэлектрофореза. Было установлено, что и для липосом с v = 0.15, и для липосом с v = 0.3 при физиологическом значении ионной силы диссоциации комплексов не наблюдалось. Таким образом, исследуемые системы сохраняют стабильность в физиологических средах и представляют интерес для создания на их основе средств доставки биологически активных соединений. С помощью классического МТТ-теста была исследована цитотоксичность КМЦД, катионных липосом их комплексов на клетках карциномы молочной железы. Было установлено, что исследуемые объекты, как и комплекс КМЦД/липосомы не обладают цитотоксичностью вплоть до максимальных исследованных концентраций – 2мг/мл. При этом, включение в наноконтейнер КМЦД/липосомы антибиотика паклитаксела приводило к проявлению цитотоксичности при концетрации антибиотика в 5 раз меньшей, чем для аптечной формы, и в 4 раза меньше, чем для мицеллярной формы, полученной путём включения паклитаксела в катионные смешанные полилактидные мицеллы на основе полилактида, терминированного аминогруппой, и блок-сополимеров лактида и этиленоксида. Полученные результаты демонстрируют, что формирование ансамблей КМЦД на катионных липосомах позволяет добиться значительной концентрации гидрофобных биологически активных молекул за счёт их включения в полость КМЦД. При этом формирование таких наноконтейнеров обеспечивает высокий терапевтический (противораковый) эффект по сравнению с действующими антибиотиками.
2 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. нсамбли циклодекстринов на малых липосомах - высокоэффективные наноконтейнеры для доставки гидрофобных соединений
Результаты этапа: Методом экструзии, а также методом ультразвуковой гомогенизации были получены серии катионных липосом из электронейтрального липида -диолеоилфосфатидилхолина (ДОФХ), и катионного липида - диолеоилтриметиламмоний хлорида (ДОТАП). Мольная доля катионного липида (v) варьировалась от 0 до 0.3. Размер липосом контролировали при синтезе, используя мембраны экструдера с различным диаметром. Малые липосомы размером менее 80 нм получали при помощи ультразвукового гомогенизатора. За взаимодействием анионных карбоксиметилциклодекстринов (КМЦД) и катионных липосом следили методом лазерного микроэлектрофореза. Для этого к суспензии липосом порционно добавляли раствор циклодекстринов и регистрировали изменение электрофоретической подвижности (ЭФП) системы. Параллельно методом динамического светорассеяния проводили измерение размеров частиц. Добавление раствора КМЦД к 1 мг/мл суспензии положительно заряженных липосом с v =0.05 не приводило изменению ЭФП в системе в независимости от размера исходных липосом. Концентрация добавленных КМЦД варьировалась вплоть до 2 мг/мл – т.е. концентрации, превышающей необходимую для формирования насыщенных комплексов КМЦД/липосомы с v = 0.3. Измерение размеров частиц в системе методом динамического светорассеяния также показало отсутствие изменения размеров липосом при добавлении КМЦД. Увеличение доли катионного липида в мембране липосом до v = 0.1 также не привело к изменению значений ЭФП в системе при титровании суспензии липосом раствором КМЦД. Измерение размеров частиц в системе методом динамического светорассеяния также показало отсутствие изменения размеров липосом при добавлении КМЦД. Таким образом формирование комплексов КМЦД/ катионные липосомы при физиологических условиях (рН 7/ 0.15 М NaCl) возможно при доле катионного липида в мембране более 0.1. С помощью МТТ-теста была исследована цитотоксичность КМЦД, заполненных биологически активными соединениями (БАС)- куркумином и фолиевой кислотой, катионных липосом их комплексов на клетках карциномы молочной железы. Варьирование доли ДОТАП в мембране липосом показало, что ни сами липосомы, ни комплекс КМЦД/липосомы не обладают цитотоксичностью вплоть до максимальных исследованных концентраций – 2мг/мл, внезависимости от доли ДОТАП. Включение во внутреннюю полость КМЦД БАС не влияет ни на цитотоксичность КМЦД, ни на цитотоксичность формируемых комплексов. Методом атомно-силовой микроскопии было установлено, что строение межфазного комплекса КМЦД/ липидная мембрана на основе ДОТАП/ДОФХ не зависит от доли катионного липида в мембране. Нарушение целостности мембран катионных липосом при взаимодействии с КМЦД было исследовано методом кондуктометрии. Было установлено, что адсорбция КМЦД на катионную мембрану ДОТАП/ДОФХ липосом приводит к формированию дефектов липидном бислое, а следовательно, помимо электростатического взаимодействия в системе наблюдаются взаимодействия некулоновской природы. Также формирование дефектов следует учитывать при разработке систем доставки, где внутренний объём липосомы рассматривается как резервуар для инкапсулирования гидрофильных соединений Методом атомно-силовой микроскопии было установлено, что строение межфазного комплекса КМЦД/ липидная мембрана на основе ДОТАП/ДОФХ не зависит от доли катионного липида в мембране. Визуализация адсорбции комплексов КМЦД/липосомы на биомиметические мембраны была осуществлена комбинацией методов оптической и флуоресцентной микроскопии. С этой целью биомиметические мембраны готовили на основе планарных бислоёв на, в роли которой был использован латекс размером 2 мкм. К суспензии двухмикронного латекса концентрации 2 мг/мл добавляли суспензию анионных ДОФГ/ДОФХ липосом концентрации 2.5 мг/мл и интенсивно перемешивали на вортексе в течение 30 мин. Липосомы, адсорбируясь на поверхность латекса разрушаются, формируя покрытие из липидного бислоя (ЛПБ). Для визуализации использовали ДОТАП/ДОФХ липосомы с v = 0.15, содержавшие 0.1 вес.% ДОФЕ-Пирен. Аликвоту суспензии объёмом 10 мкл наносили на предметное стекло и анализировали. Изображения микросфер получали в оптическом и флуоресцентном канале микроскопа (при УФ-фильтре возбуждения флуоресценции). Для суспензии ЛПБ в оптический канал были видны микрочастицы латекса со средним диаметром 2 микрон, в то время как во флуоресцентном канале не наблюдалось сигналов (чёрный фон). Затем к суспензии ЛПБ добавляли суспензию комплекса КМЦД/липосом с v = 0.15, в котором количество КМЦД составляло 25% от необходимого для формирования насыщенного комплекса. После перемешивания аликвоту 10 мкл наносили на предметное стекло и анализировали под микроскопом. Из-за своего размера и малой оптической плотности липосомы не могли быть обнаружены в оптическом канале микроскопа – изображение представляло собою фигуры идентичные исходной суспензии ЛПБ. На снимке этой же области в флуоресцентном режиме микроскопа было обнаружено свечение синего цвета на всей поверхности сферических частиц, отражающее присутствие меченных ДОФЕ-пирен объектов, т.е. комплексов КМЦД/липосомы, адсорбированных на ЛПБ. Ферментативный гидролиз катионных липосом v = 0.3, их комплексов с КМЦД, а также с КМЦД с включёнными БАС исследовали методом кондуктометрии. Для этого по описанной выше методике были получены липосомы, заполненные 1 М раствором NaCl. В качестве фермента была использована Липаза II из поджелудочной железы свиньи. Добавление к суспензии 0.5 мг/мл липосом фермента до итоговой концентрации 0.15 мг/мл в начале не приводило к значительному изменению электропроводности системы. Электропроводность не практически не менялась в течение 110 мин, далее наблюдался прогрессивный рост электропроводности, соответствовавший началу разрушения мембран липосом, полное высвобождение соли было зарегистрировано через 250 мин. При этом в контрольном образце, не содержавшем фермента, электропроводность не менялась в ходе данного временного интервала. Наличие индукционного периода на кондуктометрической кривой не является отражением отсутствия ферментативного гидролиза, поскольку на начальном этапе гидролиз липидов может не приводить к нарушению целостности мембран. Но для удобства сравнения были зафиксированы времена начала вытекания соли, как характеристические величины. Добавление фермента к насыщенному комплексу КМЦД/липосомы привело к увеличению времени индукционного периода, предшествовавшего нарушению целостности липидного бислоя. Этот результат может быть вызван как фактором стерического затруднения взаимодействия фермента с липидной мембраной комплекса, так и взаимодействием фермента с КМЦД. Для того, чтобы прояснить, что является определяющим фактором был сформирован комплекс КМЦД, насыщенный куркумином / липосомы. Профили кондуктометрических кривых ферментативного гидролиза комплексов, сформированных как незаполненными КМЦД, так и их комплексами с куркумином, практически совпадали. Таким образом, стерический фактор является определяющим при ферментативном гидролизе комплексов КМЦД/катионные липосомы. Было изучено взаимодействие КМЦД с липосомами при рН 5. Добавление к ДОТАП/ДОФХ липосомам с v =0.3 раствора КМЦД в ацетатном буфере с рН 5 и 0.15 М NaCl не привело к изменению значения ЭФП для суспензии. По-видимому, этот факт обусловлен тем, что в данных условиях количество диссоциированных карбоксильных групп в КМЦД пренебрежительно мало и не обеспечивает электростатической адсорбции на поверхность катионных липосом. Таким образом, формирование наноконтейнеров на основе ансамблей карбоксиметил циклодекстринов, адсорбированных на поверхности катионных липосом следует осуществлять в электронейтральной среде.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен
1. project_report_gost.pdf project_report_gost.pdf 57,9 КБ 18 декабря 2022 [sybachin]