ИСТИНА

Проект направлен на разработку глюкозных биосенсоров и тест-полосок для высокоточной детекции глюкозы в условиях гипо/гипергликемии. Известно, что тест-полоски для глюкометров содержат в своем составе ферменты, которые по природе своей нестабильны. В связи с тем, что аналитический сигнал биосенсора напрямую связан с активностью фермента, то велика вероятность получения ложно-отрицательных или ложно-положительных результатов, что в случае введения пациентом инсулина может привести к коме или летальному исходу. Решением данной проблемы может стать смена лимитирующей стадии процесса за счет создания диффузионных ограничений по медиатору. В таком случае, некоторая степень инактивации фермента не приведет к значительным изменениям чувствительности сенсора. В соответствии с законами ферментативной кинетики зависимость отклика биосенсора от концентрации субстрата имеет гиперболический вид. Следовательно, в качестве дополнительного преимущества предлагаемого подхода стоит ожидать линеаризации зависимости отклика биосенсора от концентрации субстрата. Широкий диапазон линейности отклика биосенсора, в отличие от гиперболического, позволит обеспечить одинаково высокую чувствительность при высоких и при низких концентрациях глюкозы. В проекте также будет предложен способ повышения каталитических токов путем увеличения электропроводящей поверхности за счет включения в фермент-содержащую мембрану проводящих наноматериалов (углеродных или полимерных наночастиц).

Within the framework of the transition to personalized medicine, high-tech healthcare and health-preserving technologies (a development priority of STC in Russia), the current course of research is the development of simple, reliable and accurate methods of express analysis. The problem with personal blood glucose meters is the fundamental impossibility to calibrate these devices and sensors immediately before measurement. When measuring glucose, the result cannot be verified because the test strips are disposable. Test strips for glucose meters are known to contain enzymes that are naturally unstable. Due to the fact that the analytical signal of the biosensor is directly related to the activity of the enzyme, there is a high probability of obtaining false-negative or false-positive results, which, if the patient administers insulin, can lead to coma or death. The solution to this problem can be a change in the limiting stage of the process by creating diffusion barrier for the mediator. In this case, some degree of enzyme inactivation will not lead to significant changes in sensor sensitivity. As an additional advantage of this approach, we should expect the linearization of the dependence of the response of the biosensor on the substrate concentration. In accordance with the enzymatic kinetics this dependence has a hyperbolic form in general. In contrast to the hyperbolic one the wide linear range of the biosensor response will provide equally high sensitivity at high and low glucose concentrations. The essence of the proposed approach is to create a membrane-forming mixture containing an enzyme, a mediator, and a polyelectrolyte for one-stage deposition on an electrode substrate. For these purposes, methods for creating diffusion restrictions by forming additional polymeric membranes over the sensitive enzyme layer of the sensor are known. However, this complicates the technology in industrial production and leads to a decrease in reproducibility. It is necessary to take into account the magnitude of the charge of the used mediators and polymer, since the mediator must be retained in the membrane and the membrane must create a diffusion restriction. Thus, membrane-forming mixtures of the enzyme / mediator / polyelectrolyte composition contribute to the simultaneous formation of both the sensitive layer of the sensor and the creation of a diffusion barrier. First, a single act of applying and drying a mixture to electrode surface will significantly increase the reproducibility of the technological process, and reduce labor costs and costs for the production of test strips. Secondly, such an approach will ensure the independence of the response from the loss of enzyme activity and provide an ability to control the linear range of the biosensor. Third, it is proposed to use water-soluble biocompatible polymers to create membranes that will provide the most favorable environment for enzymes, which is the key to the stability of the biosensor and preserve enzyme activity during long-term storage. Another reason for the decrease in the accuracy of glucose test strips may be their insufficiently high selectivity due to background signals (competing processes with the participation of electroactive compounds present in the sample). Thus, approaches to blocking the access of interfering compounds to the electrode by forming additional semipermeable membranes on the surface of the sensitive layer of the biosensor are known. The project proposes to implement an alternative mechanism: direct transfer of an electron from an enzyme to an electrode. Biosensors based on this principle have not yet become widespread due to the low efficiency of direct bioelectrocatalysis, and, consequently, the low sensitivity of methods based on it. The project will propose a technique for increasing catalytic currents by increasing the electrically conductive surface by including conductive nanomaterials (carbon or polymer nanoparticles) into the enzyme-containing membrane. During the implementation of the project, it is planned to: 1) investgate the membrane properties of mixtures based on various polymers in relation to diffusion-mobile mediators; 2) to develop compositions of enzyme-containing membrane-forming mixtures for one-stage deposition on electrode substrates to create both mediator and mediator-free biosensors; 3) test biosensors with different membrane compositions in amperometry (coulometry) modes; 4) to approve electrochemical test strips for the detection of glucose in biological fluids (blood serum or whole blood) for monitoring hypo- / hyperglycemia/ Thus, as a result of the project, biosensors and test strips will be developed for high-precision glucose detection in hypo / hyperglycemic conditions.

В результате проекта будут получены: 1) Диффузионные мембраны на основе полиэлектролитов с контролируемой диффузионной проницаемостью по отношению к медиаторам глюкозных биосенсоров. Представления о диффузионной проницаемости полимерных мембран различной природы для широкого круга наиболее применимых в биосенсорике медиаторов позволят разработать универсальные подходы к созданию высокоточных биосенсоров. 2) Стабильные фермент-содержащие мембранообразующие смеси на основе биосовместимых полимеров для одностадийной модификации проводящих подложек. Полученные закономерности изменения свойств и эксплуатационных характеристик в зависимости от состава многокомпонентных смесей для иммобилизация ферментов позволит управлять характеристиками биосенсоров на их основе (стабильность, чувствительность, точность). Благодаря разработке высокотехнологичных составов для капельной модификации электродов осуществим переход от многостадийных и комплексных стадий производственного цикла к удобной научно обоснованной технологии для масштабного промышленного изготовления сенсоров, что повысит воспроизводимость, сократит расходы и трудозатраты. 3) Высокоточные электрохимические биосенсоры с диффузионными ограничениями по медиатору для персональных глюкометров В рамках проекта будут заложены основы создания биосенсоров с диффузионными ограничениями по медиатору, что важно для исключения влияния нестабильности и неконтролируемой потери активности фермента на аналитические характеристики биосенсоров. 4) Высокоселективные глюкозные биосенсоры на основе глюкозодегидрогеназ, включенных в прямой биоэлектрокатализ. Включение фермента в варианты прямого биоэлектрокатализа и подходы для усиления биоэлектрокаталитического тока за счет применения проводящих наноматериалов раскроет перспективы для применения альтернативного механизма действия биосенсоров для создания глюкозных тест-полосок. Успешная реализация проекта позволит раскрыть перспективы одностадийной иммобилизации ферментов и медиаторов в диффузионных мембранах, а также прямого биоэлектркатализа для создания тест-полосок для высокоточного определения состояний гипо/гипергликемии

1. Диффузионная подвижность медиаторов в мембранах с различным содержанием полиэлектролитов. Диффузионную подвижность водорастворимых медиаторов в мембранах, сформированных на поверхности электродов, изучали методом циклической вольтамперометрии в водных растворах медиаторов. Заряд медиатора и полиэлектролита, а также плотность мембраны (количество полиэлектролита) являются главными факторами, влияющими на значения кажущихся коэффициентов диффузии. Кажущийся коэффициент диффузии катиона [Ru(NH3)6]3+ в положительно заряженных матрицах (хитозан и полисилоксан) снижается в 1.5-2 раза, в то время как отрицательно-заряженный перфторсульфониированный полимер (ПФС) не оказывает влияния на коэффициент диффузии данного медиатора. Для медиатора отрицательного заряда (гексацианоферрат (III)-ион) было обнаружено его дополнительное концентрирование в мембране с увеличением количества положительно-заряженного хитозана на электроде. 2. Иммобилизация фермента в мембранах путем капельной модификации электродов. Предложена иммобилизация фермента в мембране на основе ПФС или хитозана на поверхности печатных электродов модифицированных медиаторами (гексацианоферрат (III) калия, тионин, фенотиазин) на стадии печати (в составе углеродной пасты). Определена каталитическая активность глюкозооксидазы в хитозановых мембранах с содержанием полимера от 0.01 до 0.8%. Кажущаяся константа Михаэлиса достигает своего минимального значения (2.1 ± 0.2 мМ) при увеличении количества хитозана в мембранообразующей смеси до 0.1% и выше. Максимальная чувствительность биосенсоров (49 ± 2 мА•М-1•см-2) на основе берлинской лазури достигается для мембранообразующих смесей, содержащей 0.25% хитозана. Для создания биосенсоров со смещенным в область миллимолярных концентраций глюкозы линейным диапазоном разработаны стабильные трехкомпонентные мембранообразующие смеси, содержащие и фермент и медиатор, на основе полиэлектролитов, позволяющих контролировать диффузию медиаторов в мембране. 3. Медиаторные биосенсоры на основе глюкозооксидазы, иммобилизованной в составе диффузионных мембран. Хроноамперометрические отклики регистрировали в условиях скачка потенциала используя для калибровки значение тока на 5 секунде. Максимальная чувствительность достигается в начальный момент времени после наложения потенциала, так как хроноамперограммы представляют собой экспоненциально убывающие кривые. Чувствительность сенсоров на основе гексацианоферрата (III) калия (8-13% в углеродной пасте) и глюкозоксидазы, иммобилизованной в ПФС, составила 9 – 13 мА•М-1•см-2, линейный диапазон определяемых концентраций глюкозы - от 1 до 20 мМ. Тест-полоски на основе фенотиазина в углеродной пасте характеризуются более низкой (в 5 – 10 раз) чувствительностью. Оптимальные аналитические характеристики получены для тест-полосок на основе трехкомпонентных мебранообразующей смесей. Для сенсоров на основе соиммобилизации 100 мМ гексацианоферрата (III) калия и 10 мг∙мл-1 глюкозооксидазы в 0.01% растворе хитозана кроме повышенного в 2 раза коэффициента чувствительности (23 ±1 мА•М-1•см-2), отклик линеен в диапазоне от 1 до 50 мМ глюкозы, что является рекордным значением верхнего предела для глюкозных биосенсоров. Линейность в широком диапазоне концентраций обусловлена увеличением кажущейся константы Михаэлиса (до 35± 7 мМ). 4. Глюкозные тест-полоски на основе трехкомпонентных хитозановых мембран. Для высокоточной детекции глюкозы в микролитровых объемах биосенсоры были модифицированы капилляром. Найдены составы мембранообразующих смесей на основе хитозана, глюкозооксидазы и водорастворимых медиаторов (гексацианоферрат (III) калия, метосульфат феназина, гексаамминрутения (III) хлорид, 1,1-ферроцендиметанол), обеспечивающие широкий диапазон линейности глюкозных тест-полосок: от 1 до 30-50 мМ и высокие коэффициенты чувствительности от 10 до 37 мА∙см-2∙М-1. Различное содержание хитозана в мембране позволяет управлять диффузионной подвижностью медиатора и, соответственно, характеристиками биосенсоров. Выявлена прямая зависимость коэффициентов чувствительности тест-полосок от скорости высвобождения медиатора из мембраны. Рекордная чувствительность достигнута для наиболее «быстро высвобождающегося» медиатора хлорида гексаамминрутения (III) (55 мA∙M-1∙см-2). 5. Печатные электродные структуры на основе различных углерод- и серебросодержащих паст. Для изготовления тест-полосок методом трафаретной печати предложен дизайн двухэлектродных печатных структур типа «подкова» с графитовым рабочим электродом и серебряным противоэлектродом. Для изготовления электродных структур протестированы углеродсодержащие пасты различных производителей, в том числе отечественных. Обнаружено, что некоторые материалы углеродного слоя замедляют скорость электродной реакции для отрицательно-заряженного медиатора (феррицианида), при этом чувствительность тест-полосок снижается, однако диапазон линейности сохраняется (1-50 мМ глюкозы). Наилучшие тест-полоски на основе пасты отечественного производства характеризуются значением коэффициента чувствительности 15±1 мА∙см-2∙М-1 и достаточным диапазоном линейности (1-30 мМ). 6. Биосенсоры на основе глюкозодегидрогеназы, включенной в прямой биоэлектрокатализ. Повысить эффективность прямого биоэлектрокатализа возможно путем соиммобилизации фермента с проводящими наноматериалами в полиэлектролите. Соиммобилизация глюкозодегидрогеназы с наночастицами сажи в полимерных матрицах на основе ПФС позволяет увеличить предельный каталитический ток до 25 мкА•см-2 и на порядок увеличить константу Михаэлиса до 0.15 мМ, по сравнению с иммобилизацией без полиэлектролита. Биосенсоры на основе ПФС и наночастиц боронат-замещенного полианилина, обладают сравнимыми характеристиками: KM 0.18 мМ и предельный каталитический ток 2.2 мкА•см-2. 7. Селективность и стабильность глюкозных тест-полосок на основе мембран различного состава. Мешающее влияние восстановителей оценили при потенциале 0.3 В для тест-полосок на основе гексацианоферрата (III): 0.2 мМ парацетамола, аскорбиновой или мочевой кислот не вносят значительного вклада в сигнал биосенсора. Также созданы тест-полоски на основе низкопотенциальных медиаторов: [Ru(NH3)6]3+ и метосульфата феназина, работающие при более низких потенциалах: 0.1 и 0.2В, соответственно. После пятичасового экспресс-теста при повышенной температуре (60 °С), ускоряющей инактивацию фермента, коэффициент чувствительности тест-полосок на основе [Ru(NH3)6]Cl3 и K3[Fe(CN)6] сохраняется на 86%. Коммерческие тест-полоски сохраняли лишь 25% первоначальной чувствительности уже после 3-х часов. Чувствительность тест-полосок на основе гексацианоферрата калия после одного года хранения при 4°C составила 28±2 мА•М-1•см-2 (93 % от исходного значения). Мембранообразущая смесь стабильна при 4°C как минимум в течение недели без потери характеристик тест-полосок, производящихся на ее основе. 8. Валидация разработанных глюкозных тест-полосок для анализа цельной крови Правильность подтверждена путем анализа сертифицированных сывороток крови, а также венозной крови, полученной в сертифицированных лабораториях. По сравнению с коммерческими тест-полосками, чувствительность которых в цельной крови значительно снижается по сравнению с модельными растворами (в 3 раза), для разработанных в проекте получен самый высокий показатель сохранения чувствительности в крови: 97%. Широкий диапазон линейности (1-35 мМ глюкозы) сохраняется и при измерениях в крови. Таким образом, совместная иммобилизация медиатора и фермента в хитозане позволяет добиться стабильных аналитических характеристик тест-полосок даже в цельной крови и обеспечивает точное определение концентрации глюкозы в гипо- и гипергликемических состояниях. По результатам выполнения проекта опубликовано 3 статьи: в журнале Biosensors and Bioelectronics (IF = 12.6, Q 1). Journal of Electroanalytical Chemistry (IF 4.5, Q1) и Engineering Proceedings, сделаны доклады на международных конференциях.