ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Проект направлен на установление закономерностей природного явления, состоящего в эффективной и регулируемой трансформации энергии, освобождающейся при дыхании, в фосфорильный потенциал АТР, разменной энергетической «валюты» для оплаты всех энергетических нужд клетки. Молекулярные механизмы функционирования «машин», обеспечивающих синтез АТР и образование его предшественника – протондвижущей силы (разность потенциалов ионов водорода по разные стороны сопрягающей мембраны, proton motive force, pmf), во многом остаются неизвестными. Цель нашего проекта – выяснение механизмов регулирования работы этих машин: Fo∙F1 H+-АТРазы/синтазы (далее Fo∙F1-АТРазы), потребителя pmf, обеспечивающего синтез АТР, и дыхательного комплекса I, генератора pmf.
Exact molecular mechanisms by which mitochondrial energy-transducing enzymes operate remain largely unknown. This project aims to elucidate how does the transmembrane electrochemical potential of hydrogen ions (proton motive force, pmf) help to maintain catalytically active structures of energy-transducing enzymes: Fo∙F1-АТРase and NADH:ubiquinone-oxidoreductase in the coupled membranes of eukaryotes and prokaryotes. We put forth a new testable model for pmf-induced АТРase activity, that explains the mechanism of Fo∙F1-complex regulation by ADP and pmf, and we plan to quantify parameters (constants) of this model. According to our model, Fo∙F1-complex can be viewed as two equilibrating forms: hydrolytically active form Ea and hydrolytically inactive form Ein∙ADP. ADP shifts the equilibrium towards the inactive form (Ein·ADP). The pmf energy is partially spent on recovering the hydrolytically active form (Ea). To evaluate the regulation of Fo∙F1 catalytic activity by pmf we will measure the stoichiometry of protons vectorially transported through the proton channel of Fo∙F1-АТРase to hydrolyzied (or synthesised) ATP molecules. Previously we have shown that mitochondrial proton-pumping NADH:ubiquinone-oxidoreductase exists in two equilibrating forms: catalytically active A-form and catalytically inactive D-form, unable to catalyze steady-state oxidation of NADH by ubiquinone. Currently, transitions between these two forms are viewed as one of possible ways of Complex I activity regulation but the exact mechanism of A/D-transition as well as its physiological functions are unknown. We hypothesize that pmf across a coupling membrane induces a conformational change in the A-form of Complex I. In this state A-form functions as an intermediate of the proton-translocating activity of the enzyme. We plan to measure kinetics and thermodynamics of transitions between active and deactivated forms of Complex I and to evaluate how does the energization of mitochondrial membrane due to ATP hydrolysis by Fo∙F1-АТРase (pmf) affects those transitions; we will also answer the question whether it is possible for the deactivated form of Complex I to transition to an active form in the pmf-dependent reactions of reverse electron transfer to NAD+ and hexaammineruthenium. We also plan to evaluate the effect of pmf on the structure of substrate-binding sites of Complex I involved in the catalysis of NADH:ubiquinone-oxidoreductase activity. In order to do that we will measure the pmf-dependent change in the Complex I affinities to the specific NADH-binding site inhibitor NADH-OH and to the specific ubiquinone-binding site inhibitors (rotenone, capsaicin, dihydrocapsaicin) using bovine heart submitochondrial particles and P. denitrificans plasma membrane vesicles.
Мы охарактеризуем все необходимые параметры предложенной модели активации Fo∙F1-АТРазы. Мы определим концентрации ингибиторов терминального участка дыхательной цепи, необходимые для полного торможения окисления NADH, образованного в реакции обратного переноса электронов, кислородом; константу Михаэлиса реакции обратного переноса электронов для NAD+; константу Михаэлиса Fo∙F1-АТРазы для MgАТР; исследуем влияние MgАТР на скорость обратного переноса электронов на NAD+ и зависимость скорости обратного переноса от концентрации белка. В подобранных условиях мы сравним все параметры гидролиза АТР, измеренные по восстановлению NAD+ в обратном переносе, и по ответу индикатора фенолового красного; мы проверим чувствительность АТР-зависимого восстановления NAD+ к специфическому ингибитору окислительного фосфорилирования (вентурицидину) и определим рН-зависимость реакции; исследуем влияние разобщителей СССР или S-13 на скорость АТР-зависимого восстановления NAD+ и подберем концентрации разобщителей, обеспечивающие разную степень сопряженности мембран СБЧ. В условиях, обеспечивающих разную степень сопряженности мембран СБЧ, мы определим параметры взаимодействия фермента с субстратом (АТР) и продуктами (ADP и Pi) реакции, что позволит нам приступить к оценке вклада pmf и стационарных концентраций ADP на соотношение двух равновесных форм Fo∙F1-АТРазы: гидролитически активной формы Ea и неактивного комплекса фермента и ADP. Мы выясним, влияет ли pmf на мембране СМЧ сердца быка и плазматических мембранах P. denitrificans, создаваемая Fo∙F1-АТРазой при гидролизе АТР, на сродство NADH- и убихинон-связывающих центров комплекса I к специфическим ингибиторам NADH-OH, ротенону, капсаицину и дигидрокапсаицину. Если мы продемонстрируем влияние pmf на сродство фермента к ингибиторам, это будет серьезным указанием на регуляторную роль мембранного потенциала в поддержании каталитически компетентной формы комплекса I. Мы определим кинетические параметры обратного переноса электронов на HAR, катализируемого совместной работой комплекса I и Fo∙F1-АТРазы в составе СМЧ сердца быка и плазматических мембран P. denitrificans (максимальную скорость реакции Vmax и KM для HAR и АТР, рН-зависимость реакции), подберем оптимальные условия для совместной работы комплекса I и Fo∙F1-АТРазы в этой реакции.
Предлагаемая в настоящем проекте универсальная модель, объясняющая механизм регулирования активности Fo∙F1-АТРазы в реакции pmf-генерирующего гидролиза АТР под действием ADP и pmf возникла в результате кинетических исследований, проведенных в лаборатории ранее. Мы планируем измерить стехиометрический коэффициент →Н+/АТР, основываясь на нашем опыте определения стехиометрии в NADH:убихинон-оксидоредуктазном участке дыхательной цепи митохондрий млекопитающих. Предположение о возможном влиянии pmf на термодинамику и скорость А/Д-перехода комплекса I базируется на недавно продемонстрированном нами изменении скорости деактивации комплекса I при возникновении электрохимического потенциала ионов водорода на мембране СМЧ. Предположение о возможном влиянии pmf на структуру субстрат-связывающих центров комплекса I возникло из наших предыдущих работ по изучению связывания NADH-OH и ротенона с субмитохондриальными частицами сердца быка, в которых было продемонстрировано различие чувствительности фермента к ингибиторам в реакциях окисления NADH и pmf-зависимом обратном переносе электронов. Универсальность открытого нами NADH-OH-нечувствительного, pmf-зависимого обратного переноса электронов комплексом I на HAR в СМЧ сердца быка мы будем проверять, на прокариотическом объекте, используя прочносопряженные мембраны P. denitrificans.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Изучение кинетики pmf-зависимого гидролиза АТР и оценка вклада стационарных концентраций ADP и величины pmf на соотношение двух равновесных форм Fo∙F1-АТРазы. Изучение кинетики pmf-зависимого обратного переноса электронов от убихинола на гексаамминорутений (HAR), катализируемого комплексом I, и влияния pmf на сродство NADH- и убихинон-связывающего центров комплекса I к специфическим ингибиторам фермента. |
Результаты этапа: Мы подробно охарактеризовали реакцию АТР-зависимого восстановления NAD+ сукцинатом в мембранах Paracoccus denitrificans. В результате мы получили возможность исследовать влияние pmf на гидролитическую активность Fo∙F1-АТРазы. Мы показали, что параметры гидролиза АТР, измеренные по восстановлению NAD+ в обратном переносе, в основном совпадают с таковыми, определенными ранее по ответу индикатора фенолового красного. Однако мы получили указание на то, что pmf влияет на параметры взаимодействия фермента с субстратом реакции (АТР): pmf значительно увеличивала сродство фермента к АТР. Разработанные условия измерения позволили нам детально исследовать торможение вентурицидином Fo∙F1-АТРазы/синтазы в составе прочносопряженных мембран P. denitrificans в условиях генерации мембранного потенциала. Ранее мы показали, что вентурицидин, специфический Fo-направленный ингибитор, блокирует синтез и гидролиз АТР со значительным различием в сродстве (Zharova, T.V., and Vinogradov, A.D. (2017) Biochim. Biophys. Acta, 1858, 939–944). Однако это изменение в сродстве ингибитора можно было интерпретировать как результат влияния pmf, кардинально различающейся в условиях синтеза и гидролиза АТР. Гидролиз АТР, регистрируемый по АТР-зависимому обратному переносу электронов на NAD+, позволил выровнять условия измерения синтеза и гидролиза АТР в отношении pmf. В таких условиях мы обнаружили сигмоидальную зависимость остаточной АТР-гидролазной активности и линейную зависимость остаточной АТР-синтазной активности от концентрации вентурицидина. Таким образом, в области низких концентраций ингибитора значительное торможение синтеза АТР вентурицидином не сопровождается падением скорости гидролиза. Полученные результаты мы рассматриваем как подтверждающие разрабатываемую в нашей лаборатории гипотезу, согласно которой синтез и гидролиз АТР катализируют две разные формы Fo∙F1 (Виноградов А.Д. (2019) Биохимия, 84, 1553–1563). Мы показали значительное различие в действии ингибиторов убихинон-связывающего центра комплекса I (ротенона, капсаицина и дигидрокапсаицина) в препаратах СМЧ и в плазматических мембранах P. denitrificans в прямой реакции разобщенного окисления NADH и при энергизации мембран в условиях АТР-зависимого обратного переноса электронов на NAD+. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при энергизации мембраны в условиях обратного переноса электронов связывание этих ингибиторов комплекса I становится менее прочным. Мы подробно исследовали NADH:HAR-редуктазную активность комплекса I в СБЧ и показали отклонение этой реакции от простой кинетики Михаэлиса, которое указывает на то, что в зависимости от концентрации акцептор HAR может взаимодействовать с более, чем одним центром фермента, причем редокс потенциал центра, взаимодействующего с низкими концентрациями акцептора, значительно выше редокс потенциала FMN и основной группы железо-серных центров фермента. Мы впервые подобрали экспериментальные условия и обнаружили, что комплекс I в составе СБЧ P. denitrificans катализирует обратный перенос электронов на HAR, чувствительный к действию разобщителей и ингибиторов убихинон-связывающего центра фермента и нечувствительный к NADH-OH. Таким образом, этот процесс происходит без участия FMN. Полученные результаты демонстрируют универсальность открытого нами FMN-независимого обратного переноса электронов на HAR для всех типов протонтранслоцирующих NADH:убихинон-оксидоредуктаз. | ||
2 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Определение стехиометрического соотношения между векторно перенесёнными протонами и гидролизованными (синтезированными) АТР в мембранах P. denitrificans (коэффициент →Н+/АТР). Определение кинетических и термодинамических параметров реакции перехода между активной и деактивированной формами комплекса I и исследование влияния энергизации мембраны на этот переход. Изучение способности деактивированной формы комплекса I переходить в активную форму фермента в реакции pmf-зависимого обратного переноса электронов от убихинола на NAD+ и гексаамминорутений (HAR). |
Результаты этапа: Разработан методический прием, позволяющий освободить препарат суббактериальных частиц P. denitrificans (СБЧ) от ADP. Процедура включает инкубацию препарата СБЧ P. denitrificans в присутствии щелочной фосфатазы (ЩФ) или апиразы. Мы показали, что такая обработка приводила к активации окисления NADH и падению мембранного потенциала. Субстраты/продукты F1·Fo синтазы/АТРазы – ADP (или IDP), неорганический фосфат (Pi) (или арсенат), а также ингибиторы фермента AMP-PNP (негидролизуемый аналог АТР) и вентурицидин (ингибитор Fo-канала) предотвращали и обращали вызванное ЩФ разобщение. Однако освобождение F1·Fo P. denitrificans ADP не приводило к активации латентной АТРазной активности. Мы заключили, что для понимания однонаправленного катализа F1∙Fo возможно требуются более сложные схемы, включающие участие нескольких регуляторных механизмов и взаимодействие между механизмами регуляции с помощью белков-ингибиторов и ADP(Mg2+)-торможением [1]. Для F1·Fo P. denitrificans мы определили стехиометрический коэфициент H+/ATP (отношение числа векторно перенесенных протонов к количеству гидролизованных/синтезированных молекул АТР), величина которого в разных условиях варьировала от 3 до 4,5, что близко к ожидаемому теоретическому H+/ATP, равному 4. Мы определяли H+/ATP путем измерения начальных скоростей гидролиза АТР, катализируемого F1·Fo, и начальных скоростей сопряженного с этим процессом восстановления NAD+ комплексом I в реакции АТР-зависимого обратного переноса электронов, охарактеризованного при выполнении первого этапа проекта. Мы показали, что pmf не влиял на величину H+/ATP. Высокие значения H+/ATP были получены в присутствии 100 мкМ Pi в среде измерения. Обнаруженное влияние субстратов на сопряжение между F1 и Fo, а также влияние Pi на гидролитическую активность F1·Fo в энергизованных мембранах и на величину H+/ATP мы рассматриваем в рамках гипотезы о существовании в сопрягающих мембранах двух форм фермента, характеризующихся разной эффективностью окислительного фосфорилирования и АТР-зависимой генерации потенциала [2]. Мы выяснили, как влияют на изменение сродства комплекса I к ингибиторам нуклеотид- и убихинон-связывающих центров фермента потенциал на мембране и/или восстановление его редокс-центров. С этой целью мы определили параметры связывания NADH-OH (специфический ингибитор нуклеотид-связывающего центра) в различных условиях и показали, что в отсутствие потенциала на мембране независимо от того, окислены редокс-компоненты комплекса I или восстановлены, константа скорости второго порядка k при взаимодействии NADH-OH с ферментом составляет 1,7•108 М-1мин-1. Энергизация мембраны за счет реакции гидролиза АТР в отсутствие сукцината, который в реакции обратного переноса обычно используют в качестве восстановителя убихинона, снижает эту константу до 1,2•108 М-1мин-1. Мы определили константу скорости диссоциации ингибитора из комплекса фермента с NADH-OH, равную 0,06 мин-1. На величину этой константы энергизация мембраны гидролизом MgATP не влияет. Мы исследовали связывание ротенона с комплексом I в ходе NADH-оксидазной реакции в присутствии разобщителя, когда мембрана субмитохондриальных частиц (СМЧ) деэнергизована, и в его отсутствие, когда на мембране создается pmf. Оказалось, что энергизация мембраны СМЧ приводит к замедлению взаимодействия с ротеноном и снижению константы скорости второго порядка примерно в два раза по сравнению с экспериментом, проведенным в присутствии разобщителя (k=0,16•108 М-1мин-1 в энергизованных мембранах против k=0,38•108 М-1мин-1 в условиях разобщения). Так как при окислении NADH добавление разобщителей не меняет уровень восстановленности редокс-компонентов фермента [3], наблюдаемые различия связаны прежде всего с наличием или отсутствием протонного потенциала на мембране. Такой вывод подтверждается результатами измерения константы скорости связывания ротенона в опытах, когда СМЧ инкубировали с ротеноном в отсутствие NADH, когда все редокс-компоненты комплекса I были окислены, а реакцию начинали добавлением NADH и разобщителя. Как восстановленный фермент, так и полностью окисленный комплекс I с одинаковыми скоростями взаимодействуют с ротеноном. Другой ингибитора фермента, дигидрокапсаицин, быстро и равновесно связывается с комплексом I, поэтому в качестве характеристики его связывания с ферментом мы использовали равновесную константу ингибирования Ki (константа диссоциации комплекса фермента с ингибитором). В деэнергизованных СМЧ, катализирующих NADH-оксидазную реакцию в присутствии разобщителя, падение активности в присутствии дигидрокапсаицина происходит с Ki, равной 7 мкМ. В отсутствие разобщителя, когда при окислении NADH на мембране СМЧ создается протонный градиент, или в реакции потенциал-зависимого обратного переноса электронов на NAD+ Ki увеличивается до 25 мкМ. Полученные данные, как и в случае ротенона, свидетельствуют о том, что энергизация мембраны, но не восстановление редокс-компонентов фермента, меняет параметры связывания комплекса I с ингибиторами убихинон-связывающего центра фермента. Мы исследовали, как энергизация мембраны СМЧ может влиять на скорость перехода Д-формы фермента в А-форму в энергизованных и деэнергизованных СМЧ и показали, что энергизация мембраны ускоряет переход Д-формы фермента в активное состояние: наблюдаемая константа скорости активации k при энергизации мембраны увеличивалась с 0,8 мин-1 до 1,4 мин-1 по сравнению с Д/А-переходом в отсутствие pmf. Как уже было сказано, для того, чтобы Д-форма комплекса I перешла в активное состояние (А-форма) фермент должен совершить каталитический оборот: окислить NADH и восстановить убихинон. До сих пор возможность такой трансформации для Д-формы фермента в реакции обратного переноса электронов продемонстрирована не была. Поэтому мы изучили способность деактивированной формы комплекса I переходить в активную форму в реакции pmf-зависимого обратного переноса электронов от убихинола на NAD+ и показали, что в присутствии субстратов реакции Д-форма фермента не способна переходить в А-форму и катализировать реакцию. Ранее в нашей лаборатории было показано, что переход из Д-формы в активную может происходить не только в результате каталитического оборота в прямой реакции окисления NADH, но и при инкубации Д-формы с ротеноном, который с высоким сродством взаимодействует с убихинон-связывающим центром. Мы проверили, вызывает ли Д/А переход инкубация фермента с другим ингибитором этого центра, дигидрокапсаицином, и обнаружили, что активации Д-формы комплекса I дигидрокапсаицином не происходит. Мы предположили, что ротенон вызывает активацию Д-формы фермента, взаимодействуя не с убихинон-связывающим центром, а в альтернативном сайте, недавно обнаруженном в структуре фермента и расположенном в мембранном домене в непосредственной близости к аминокислотным остаткам, принимающим участие в векторном переносе протонов [4]. По всей видимости дигидрокапсаицин не способен связываться в этом участке, поэтому он не вызывает активацию Д-формы фермента. В результате проделанной работы мы можем заключить, что энергизация мембраны приводит к конформационным изменениям в структуре комплекса I, а также влияет на скорость перехода между активной и деактивированной формами фермента таким образом, что стабилизирует комплекс I в активном состоянии. Другими словами, pmf на сопрягающих мембранах можно рассматривать как фактор, регулирующий активность комплекса I. Литература 1. Жарова Т.В., Кареева А.В. (2023) Тезисы 4 Российского микробиологического конгресса, Томск, сентябрь 2023, стр. 124. 2. Zharova T.V., Grivennikova V.G., Borisov V.B. (2023) Int. J. Mol. Sci., 24, 5417. 3. Burbaev D.Sh., Moroz I.A.,Kotlyar A.B., Sled V.D., Vinogradov A.D. (1989) FEBS Lett., 254, 47–51. 4. Kampjut D., Sazanov L.A. (2020) Science 370, eabc4209. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".