|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Апоптотическая протеаза растений фитаспаза: гомологичные и гетерологичные белки-мишениНИР
Plant cell death protease, phytaspase: homologous and heterologous protein targets
- Руководитель НИР: Вартапетян А.Б.
- Ответственные исполнители: Белошистов Р.Е., Галиуллина Р.А., Трусова С.В., Чичкова Н.В.
- Участники НИР: Волик П.И., Лозинский Я.Н., Морозова Е.А., Теплова А.Д., Трусова С.В.
- Подразделение: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского
- Срок исполнения: 16 мая 2016 г. - 31 декабря 2018 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 16-14-10043
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Геномика, протеомика. Белковая и генная инженерия. Трансгеноз, генотерапия. Молекулярная медицина.
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
-
Ключевые слова:
программированная клеточная смерть, абсцизовая кислота, пептидные гормоны, фитаспаза, протеолиз, растения, протеолитические ферменты, транскрипционный фактор
plants, transcription factor, abscisic acid, peptide hormones, proteolytic enzymes, proteolysis, phytaspase, programmed cell death -
Описание:
Для выяснения механизма ПКС у растений, происходящей с участием фитаспаз, необходимо знать, какие растительные (гомологичные) белки являются мишенями фитаспаз, и почему их фрагментация фитаспазами приводит к направленной гибели клеток. Поиск ответа на эти вопросы является 1-м направлением предлагаемого проекта. Однако возможна и альтернативная постановка вопроса: способны ли фитаспазы растений, попадая в организм человека и животных в составе растительной пищи, гидролизовать белки животных (гетерологичные мишени)? Если способны, то что это за белки, и к каким последствиям такой гидролиз может привести? Это является 2-м направлением настоящего проекта.
-
Abstract:
To unravel mechanisms of plant PCD occurring with the involvement of phytaspases, knowledge of plant (homologous) protein targets of phytaspase and the ways connecting their cleavage with cell death is essential. Finding answers to these questions constitutes the 1st direction of the project. However an alternative question is also feasible: can phytaspases ingested with plant food hydrolyze human and animal proteins (heterologous targets)? If they can, then what are these targets, and what could be an effect of such a hydrolysis? Addressing these questions constitutes the 2nd direction of the project.
-
Планируемые результаты:
Выявление фрагментации транскрипционного фактора ABI3 in vivo и подтверждение роли фитаспазы в этом процессе; выяснение, в каких условиях транскрипционный фактор ABI3 и фитаспаза могут найти друг друга в клетке; установление, какое значение имеет гидролиз белка ABI3 фитаспазой для функционирования сигнального пути, индуцируемого абсцизовой кислотой и приводящего к адаптации растений к стрессам. Мы также хотим выяснить, способна ли фитаспаза, поступающая с пищей, гидролизовать пептидные гормоны в организме животных и таким образом регулировать уровень их активности.
-
Научный задел:
Научная группа обнаружила и идентифицировала фитаспазы - новый класс протеолитических ферментов растений. Активность фитаспаз выявлена в широком круге растений и показано, что эта активность может очень значительно различаться у разных видов растений. Показано, что фитаспазы важны для осуществления программированной гибели растительных клеток, вызванной биотическими и абиотическими стрессами. Клонированы гены фитаспаз ряда растений, получен рекомбинантный фермент в форме фитаспаза-GST, обладающий протеолитической активностью. Показано, что активная фитаспаза в норме накапливается вне клеток, а при стрессах транспортируется внутрь клеток. Обнаружено, что механическое повреждение растительной ткани приводит к высвобождению фитаспазы. Установлена субстратная специфичность некоторых фитаспаз. Обнаружены несколько белков растений – мишеней фитаспаз. Показано, что фитаспаза A. thaliana способна гидролизовать транскрипционный фактор ABI3 in vitro. Установлено, что фитаспаза риса способна in vitro расщеплять и инактивировать пищеварительные пептидные гормоны человека – гастрин и ССК.
-
Основные результаты:
В результате выполнения проекта мы рассчитываем показать, что в гидролизе высокоспецифичной апоптотической протеазой растений фитаспазой выявленных нами гомологичных и гетерологичных белков-мишеней есть большой биологический смысл. Так, гидролизуя транскрипционный фактор ABI3 A. thaliana, фитаспаза способна переключать экспрессию генов защитного (адаптационного) ответа растений на стрессы, тем самым регулируя баланс между выживанием и гибелью растительных клеток. С другой стороны, гидролиз и инактивация фитаспазой пептидных гормонов гастрина и холецистокинина в организме человека и животных может позволить снижать избыточный уровень этих гормонов, что весьма желательно при многих патологических состояниях.
- Добавил в систему: Вартапетян Андрей Борисович
Источник финансирования НИР
| грант РНФ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 16 мая 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Апоптотическая протеаза растений фитаспаза: гомологичные и гетерологичные белки-мишени |
| Результаты этапа: | ||
| 2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Апоптотическая протеаза растений фитаспаза: гомологичные и гетерологичные белки-мишени |
| Результаты этапа: 1-ое направление: Транскрипционный фактор ABI3 как мишень фитаспазы. - в присутствие белка ABI3 фитаспаза перераспределяется внутрь эпидермальных клеток листьев A. thaliana и выявляется в ядре, околоядерной области и цитоплазме; - при этом происходит ко-локализация фитаспазы с транскрипционным фактором ABI3, имеющим преимущественно ядерную локализацию; - ко-локализация фитаспазы и транскрипционного фактора ABI3 коррелирует с фрагментацией белка ABI3; - основной (больший) продукт гидролиза транскрипционного фактора ABI3 фитаспазой сохраняет ядерную локализацию; - фитогормон абсцизовая кислота вызывает перераспределение фитаспазы по всей эпидермальной клетке, отчасти сходное с локализацией фитаспазы в присутствие транскрипционного фактора ABI3; 2-ое направление: Пептидные гормоны человека и животных гастрин и холецистокинин (ССК) как мишени фитаспазы. 1). Идентифицированный и клонированный нами ген фитаспазы перца действительно кодирует фитаспазу – протеолитический фермент с аспартатной специфичностью. Попутно мы исправили ошибки в полученной при геномном секвенировании аминокислотной последовательности этого белка. 2). Путем продукции рекомбинантной фитаспазы перца в растениях получены большие количества индивидуального высокоочищенного протеолитически активного фермента. 3). Установлена субстратная специфичность индивидуальной фитаспазы перца с использованием большого набора флуорогенных пептидных субстратов. 4). Показано, что рекомбинантная фитаспаза перца способна in vitro эффективно и специфично гидролизовать и таким образом инактивировать пептидные гормоны человека и животных гастрин и ССК. | ||
| 3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Апоптотическая протеаза растений фитаспаза: гомологичные и гетерологичные белки-мишени |
| Результаты этапа: 1-ое направление: Транскрипционный фактор ABI3 как мишень фитаспазы. 1). Проведен полнотранскриптомный анализ двух линий арабидопсиса – линии дикого типа и линии с инактивированным геном фитаспазы. Анализ показал, что в отсутствие обработки абсцизовой кислотой инактивация гена фитаспазы может сказываться на экспрессии генов как положительно, так и отрицательно. Наиболее представленными категориями генов, реагирующими на наличие/отсутствие фитаспазы, оказались гены ответа на стрессовые воздействия и гены сигнальных путей фитогормонов. Удаление гена фитаспазы сопровождается снижением экспрессии генов ответа на фитогормон ауксин; генов ответа на NO; генов, ответственных за катаболизм перекисных соединений; генов ответа на ионы железа. Активируются при удалении фитаспазы гены ответа на хитин, на поранение, на фитогормоны салициловую и жасмоновую кислоту, на холодовой стресс, на бактериальную инфекцию и сигнальный путь этилена. Анализ транскриптомов растений двух линий, обработанных абсцизовой кислотой, выявил порядка 200 генов, чья экспрессия в двух линиях в ответ на обработку фитогормонов различалась. Среди этих дифференциально экспрессирующихся генов оказалось лишь 10, про которые было известно, что они являются мишенями транскрипционного фактора ABI3. Для большинства из этих 10 генов обработка абсцизовой кислотой активировала экспрессию в линии дикого типа, в то время как в линии с нокаутированным геном фитаспазы активация была меньше, или отсутствовала, или наблюдалось подавление. Можно заключить, что для этих генов-мишеней транскрипционного фактора ABI3 фитаспаза является позитивным регулятором экспрессии. Для выбранных генов закономерности, выявленные с помощью транскриптомного анализа, были затем подтверждены с помощью количественной ПЦР. 2). Проведена оценка влияния фитаспазы на функционирование транскрипционного фактора ABI3 путем конструирования трансгенных растений арабидопсиса (производных от линий дикого типа и линии, нокаутной по гену фитаспазы), содержащих дополнительно введенный ген транскрипционного фактора ABI3 под контролем конститутивного промотора. Обнаружено, что полученные трансгенные растения драматически отличались по своему фенотипу в зависимости от наличия в них фитаспазы. В растениях, полученных из линии дикого типа, введение дополнительного гена ABI3 ожидаемо сильно подавляло развитие. В то же время, трансгенные растения, полученные из линии с инактивированным геном фитаспазы, развивались лишь несколько медленнее по сравнению с нетрансгенными растениями. 3). Проведен анализ транскрипционной активности белка ABI3 в зависимости от уровня фитаспазы в растениях с помощью репортерной плазмидной конструкции. Оказалось, что ко-продукция в листьях N. benthamiana фитаспазы арабидопсиса приводит к повышению транскрипционной активности ABI3. В то же время, сравнение растений N. benthamiana с нормальным и пониженным уровнем фитаспазы показало, что в растениях с пониженным уровнем фитаспазы транскрипционная активность белка ABI3 также снижается. 4). Показано, что перераспределение фитаспазы арабидопсиса из апопласта внутрь клетки при обработке растений арабидопсиса абсцизовой кислотой является универсальным явлением. Аналогичный эффект обнаружен и для фитаспазы табака, продуцированной в листьях растения N. benthamiana. Обнаружено, что способностью вызывать перераспределение фитаспазы внутрь клеток обладают два других фитогормона – ауксин и салициловая кислота. 5). Установлено, что ключевую роль в специфичной интернализации фитаспазы, происходящей при индукции программированной клеточной смерти, играет клатрин-зависимый эндоцитоз. 2-ое направление: Пептидные гормоны человека и животных гастрин и холецистокинин (ССК) как мишени фитаспазы. 1). Обнаружено, что фитаспаза перца, вводимая мышам перорально, вызывает статистически значимые поведенческие эффекты. Оказалось, что фитаспаза обладает не успокаивающим, а анксиогенным действием на подопытных животных. 2). Влияние фитаспазы на поведенческие реакции животных дозо-зависимо. Также, отсутствие эффекта при введении термоинактивированной фитаспазы указывает на важность протеолитической активности фермента для его действия. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".