ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Проект посвящён изучению механизма функционирования системы окислительного фосфорилирования, локализованной во внутренней мембране митохондрий. Основное внимание будет уделено изучению системы переноса энергии окислительных реакций, протекающих в электронтранспортной системе митохондрий, на систему синтеза АТФ.
This project is about the functioning of OXPHOS mechanism, located in inner membrane of mitochondria. Studies of the transport system of the energy of oxidative reactions in electron transport system are of main interest for our investigations.
В проекте поставлена задача установления принципов работы систем транспорта протона в фосфорилирующей системе митохондрий, работающей в режиме суперкомплекса. При выполнении этой программы планируется сформировать теоретическую базу для создания устройства на основе БЛМ, осуществляющего процесс формирования фракции неравновесно связанных с мембраной ионов водорода за счёт использования энергии электрического поля. Анализ результатов работы будет проводиться в рамках модели, согласно которой процесс переноса протонов с участием эндогенных переносчиков, жирных кислот, и процесс синтеза АТФ являются равноценными, конкурирующими биологически значимыми реакциями, одна из которых осуществляет синтез АТФ, другая – контролирует терморегуляцию у теплокровных. Для количественного описания процесса транспорта мембраносвязанных протонов в суперкомплексе, будет использовано уравнения неравновесной термодинамики (уравнения Онзагера) вместо «равновесного» уравнения Нернста.
Ранее нами были найдены условия перестройки фосфорилирующей системы митохондрий и перехода этой системы в режим работы суперкомплекса. При этом было показано, что система обладает свойством полиморфизма и, в зависимости от условий, способна функционировать в диссоциированном состоянии (в режиме модели Митчелла), а также в форме суперкомплекса (модель Вильямса), когда ионы водорода, выполняющие роль переносчиков энергии и передаются на АТФ-синтетазу в пределах мембранного суперкомплекса без выхода в водную фазу. Эффект кластеризации белков фосфорилирующей системы в суперкомплексы в настоящее время подтверждён во многих лабораториях. В проекте поставлена задача установления принципов работы систем транспорта протона в фосфорилирующей системе митохондрий, работающей в режиме суперкомплекса.
Создание модельной системы на БЛМ, в которой осуществляется процесс формирования неравновесной фракции мембраносвязанных ионов водорода за счёт энергии электрического поля. Создание теоретической и экспериментальной базы для построения устройства, которое за счёт использования энергии электрического поля имитирует процесс формирования фракции протонов, неравновесно связанных с поверхностью мембраны.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Изучение процесса транспорта протонов в Фосфорилирующей системе митохондрий, функционирующей в режиме суперкомплекса. |
Результаты этапа: Настоящий проект посвящён изучению условий формирования суперкомплекса фофсфорилирующей системы митохондрий, его функционированию и строению. Показана более высокая устойчивость суперкомплекса OxPhoS в митохондриях сердца по сравнению с митохондриями печени. Получены данные, указывающие на существование в митохондриях сердца двух функционально гомологичных суперкомплекса, различающихся по ультраструктуре. Проведено параллельное изучение температурной зависимости изменений строения мембран митохондрий и функциональной активности OxPhoS в условиях образования суперкомплекса. Показано, что в температурных точках фазовых переходов, при 19 и 25оС, локализованы фазовые структурные переходы мембран митохондрий. При этом обнаружено, что именно в этих точках происходят специфические изменения функциональной активности фосфорилирующей системы. Начато изучение реакционной способности протонов в составе фракции неравновесно связанных с мембраной ионов водорода. Установлено, что в отсутствие ингибитора неспецифической поры (АДФ), ионы водорода в составе указанной фракции индуцируют эффект открывания неспецифической поры, которая в условиях фосфорилирования (в присутствии АДФ) блокируется этим ингибитором. Было получено экспериментальное доказательство взаимосвязи открывания поры в митохондриях с процессом генерации активных форм кислорода, который активируется неравновесно связанными с мембраной ионами водорода. Эти эксперименты показали, что субстрат фосфорилирования , АДФ, одновременно играет роль блокатора побочного процесса – открывания поры, который индуцируется переносчиками энергии – ионами водорода. На модели БЛМ с помощью синтезированного ранее поверхностно активного протонофора создан метод трансформации энергии электрического поля в энергию термодинамического потенциала ионов водорода. | ||
2 | 1 декабря 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Изучение процесса транспорта протонов в Фосфорилирующей системе митохондрий, функционирующей в режиме суперкомплекса. |
Результаты этапа: В работе найдены условия, при которых в митохондриях сердца реализуется пространственное разделение мембран на две составляющие – ламеллярную фазу, обогащённую липидами, и на белково-липидную фракцию, обогащённую белками. Установлено образование рафтоподобных структур в митохондриях и показана количественная корреляция этого процесса с увеличением фосфорилирующей активности митохондрий. Получены данные, свидетельствующие в пользу локального поышения активности протонов (переносчиков энергии) в зоне связывания с мембраной АТФсинтетаз на рафтоподобных мембранных кластерах. Показана возможность создания модельной системы индукции образования рафтоподобных кластеров, обладающих высоким сродством к ионам водорода. | ||
3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Изучение процесса транспорта протонов в Фосфорилирующей системе митохондрий, функционирующей в режиме суперкомплекса. |
Результаты этапа: Работа направлена на изучение условий образования и функционирования полного суперкомплекса системы окислительного фосфорилирования (ОКСФОС) митохондрий [1]. При функционировании системы ОКСФОС в режиме суперкомплекса основной поток энергии не связан с трансмембранным переносом протона. В работе изучалось устройство системы ОКСФОС митохондрий в условиях функционирования этой системы в режиме полного суперкомплекса, способного осуществлять синтез АТФ. В таких условиях основной поток энергии (ионов водорода) протекает внутрикомплексно. Целью проекта явилось изучение внутрикомплексного переноса энергии (ионов водорода) на энеропреобразующий механизм АТФ-синтетазы в условиях работы ОКСФОС в режиме суперкомплекса. Известные принципиальные различия молекулярного устройства дыхательных протонных помп предполагали возможность существования различий в устройстве звена переноса энергии (ионов водорода) на АТФ-синтетазу в системе ОКСФОС, функционирующей в режиме полного суперкомплекса, что соответствует существованию нескольких изозимных форм полного суперкомплекса. В работе был найден новый путь перевода системы ОКСФОС в режим работы суперкомплекса [2,3]. Было показано, что в условиях непродолжительного воздействия гипоксии на суспензию митохондрий система ОКСФОС начинает функционировать как суперкомплекс [2]. Это было доказано методом двойного ингибиторного титрования по Бауму с использованием карбоксиатрактилазида и малоната. Строгое доказательство природы наблюдаемого эффекта было получено в экспериментах, проведённых в атмосфере азота. Важно указать, что в экспериментах, проведённых без специального удаления кислорода, было обнаружено также, что после инкубации препарата густой суспензии выделенных митохондрий приблизительно в течение 1 часа (при 1–4о С) система ОКСФОС [3] «спонтанно» переходит в режим работы суперкомплекса. Этот эффект учитывался нами в работе с митохондриями. Интактными митохондрии наблюдались только в начальном периоде после выделения препарата, до того момента, когда в суспензии кислород был поглощён митохондриями. Используя метод электронной микроскопии мы обнаружили, что в условиях гипоксии происходит набухание митохондрий, однако, если в гипотонических условиях происходит набухание матрикса, то в условиях гипоксии увеличивается объём межмембранного пространства [2]. Важно подчеркнуть, что, в случае гипоксии и гипотонии пусковым механизмом перехода системы ОКСФОС в режим работы суперкомплекса является сигнал повышения давления на внутреннюю митохондриальную мембрану. Согласно классическим работам Пфейффера [Pfeiffer H.et al. 2003 Biochim Biophys Acta. 1609, 144–152], давление повышает степень гидратации липидного бислоя модельных мембран. Согласно проведённым нами экспериментам на мембранах митохондрий, повышение давления увеличивает не только гидратацию мембран, но также увеличивает гидратацию белок-липидных контактов. При этом мы продемонстрировали (в условиях гидратации в мембранах митохондрий) появление трёх температурных фазовых перехода. Это свидетельствует о глубокой структурной перестройке мембран митохондрий в условиях внешнего давления. Специальные исследования, проведённые на примере транслокатора нуклеотидов, показали, что гипоксия, также как и гипотонический стресс, способны вызывать одинаковые структурно-функциональные изменения отдельных ферментных систем ОКСФОС [2,4]. Оба типа воздействия переводят транслокатор нуклеотидов в форму функционально активного димера. При этом активность димера подавлялась не двумя, а одной молекулой высокоспецифического ингибитора - карбоксиатрактилазида. Более глубокие исследования показали, что гипоксия и гипотония, несмотря на вышеуказанное сходство условий воздействия, индуцируют формирование двух различных по структуре и активности изозимных форм суперкомплекса. Так, прямые эксперименты на препарате митохондрий сердца показали, что при последовательном воздействии гипоксии и гипотонии аддитивный эффект не наблюдался. Вместо этого при помощи метода электронной микроскопии была обнаружена глобальная структурная перестройка внутренней мембраны митохондрий, сопровождающаяся резким увеличением объёма матрикса [2]. Таким образом, проведённая работа подтвердила предположение о существовании нескольких (трёх) изозимов системы ОКСФОС, функционирующей в режиме полного суперкомплекса (все три варианта дают положительный ответ в тесте Баума). Строение внутренней мембраны при образовании этих изозимов качественно различается. Наблюдаемые различия обусловлены разным направлением вектора осмотического давления: давления на мембрану со стороны матрикса, давления со стороны межмембранного пространства и давления с обеих сторон. Такое различие условий обеспечило в наших экспериментах, с одной стороны, сходную активность ОКСФОС, соответствующую работе суперкомплекса, и, с другой стороны, индукцию образования трёх структурно различных изозимов системы ОКСФОС. Структурные различия изозимов были установлены путём количественных измерений ультраструктуры крист, проводившимися параллельно двумя методами - методом малоуглового рассеяния нейтронов на кристах митохондрий и методом электронной микроскопии. Согласно данным литературы, обнаруженные изозимы системы ОКСФОС должны обладать не только структурными, но и функциональными различиями, связанными с устройством терминального звена переноса энергии (протонов) на АТФ-синтетазу. Из литературы известно, что в условиях гипоксии при участии ОРА1 специфически изменяется характер связи АТФ-синтетазы с внутренней мембраной, в которую встроены протонные помпы [Faccenda et al., 2017, Cell Reports 18, 1869–1883]. Как мы показали, именно в таких условиях (при стабилизации связи АТФ-синтетазы с мембраной) наблюдается образование одного из изозимов суперкомплекса. При этом образовавшийся суперкомплекс должен заведомо отличаться по звену контакта протонных помп и АТФ-синтетазы от другого изозима, образующегося в аэробных условиях при осмотическом стрессе, когда ОРА1 отсутствует. При последовательном воздействии гипоксии и гипотонии реализуется третий вариант образования изозима полного суперкомплекса, связанный с глобальной перестройкой внутренней мембраны. В работе был проведён также поиск новых сигнальных систем в митохондриях в условиях, имитирующих гипоксию, что привело к обнаружению двух сигналов в митохондриях мозга и сердца, функционирование которых ранее связывали только с клетками нервной системы – это сигналы глутаматного рецептора и сигнал гамма-аминомасляной кислоты [5,6]. Показано, что оба сигнала кальций-зависимы. Они играют важную роль в регуляции работы этих органелл. Присутствие рецепторов было доказано методами обычного иммуноферментного анализа и также методом иммуноголдинга, показавшего связывание рецепторов с внутренней мембраной митохондрий мозга и сердца. Имеются косвенные указания на то, что функционирование одного из этих каналов, также как и переход работы системы ОКСФОС в режим работы суперкомплекса, зависит от давления. 1. Sardar E. Gasanov, Aleksandr A. Kim, Lev S. Yaguzhinsky, Ruben K. Dagda Non-bilayed structures in mitochondrial membranes regulate ATP synthase activity. Biochim.Biophys.Acta, Biomembranes (2018) 1860 (2) 586–599 2. И.М. Бывшев, Т.Н. Муpугова, О.О. Иваньков, А.И. Куклин, И.М. Вангели, В.В. Теплова, В.И. Попов, C.В. Неcтеpов, Л.C. Ягужинcкий. Cигнал гипокcии как потенциальный индуктоp обpазования cупеpкомплекcа cиcтемы окиcлительного фоcфоpилиpования в митоxондpияx cеpдца. Биофизика (2018) 63 (4) 703–715. 3. Л.С.Ягужинский, Ю.А.Скоробогатова, С.В.Нестеров Функционально значимые низкотемпературные структурные изменения в митохондриальных мембранах теплокровных животных. Биофизика (2017) 62(3) 518-524. 4. В.С.Моисеева,Т.Н.Муругова, И.М.Вангели, И.М.Бывшев, С.Равауда, Р.А.Симонян, В.И.Горделий,Е.Пебай-Пейрула, Л.С.Ягужинский О механизме и функциональной значимости димеризации ADP/ATP переносчика (ААС). Биологические Мембр. (2017) 34(4) 321-329 5. Nesterov Semen V., Skorobogatova Yulia A., Panteleeva Alisa A., Pavlik Lyubov L., Mikheeva Irina B., Yaguzhinsky Lev S., Nartsissov Yaroslav R. NMDA and GABA receptor presence in rat heart mitochondria. Chemico-Biological Interactions (2018) 291,40-46. 6. Selin Alexey A., Lobysheva Natalia V., Nesterov Semen V., Skorobogatova Yulia A., Byvshev Ivan M., Pavlik Lyubov L., Mikheeva Irina B., Moshkov Dmitry A.,Yaguzhinsky Lev S., Nartsissov Yaroslav R. On the regulative role of the glutamate receptor in mitochondria. Biological Chemistry (2016) 397 (5) 445-458 |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".