Создание масс-спектрометрического метода полного de novo секвенирования интактных природных биологически активных пептидов земноводныхНИР

Development of a mass spectrometry method for the complete de novo sequencing of intact natural biologically active amphibian peptides

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 22 марта 2021 г.-31 декабря 2021 г. Создание масс-спектрометрического метода полного de novo секвенирования интактных природных биологически активных пептидов земноводных
Результаты этапа: 1. Целью оптимизации процесса выделения кожного секрета земноводных было получение максимального выхода биоактивных пептидов и нейтрализация энзимов. Для этого использовали изученные ранее секреты лягушек Rana ridibunda и Rana lessonae, у которых ингибирование эндопротеаз осуществляли метанолом, соляной кислотой, а также коммерчески доступным ингибитором протеаз – фенилметилсульфонил фторидом (ФМСФ). Состав секрета данных лягушек ранее был тщательно изучен, а большинство пептидов полностью секвенированы, поэтому при дальнейшем масс-спектрометрическом профилировании мы опирались на ранее полученные данные. Лиофилизированные кожные субстраты анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии–масс-спектрометрии высокого разрешения (ВЭЖХ-МСВР) в режимах полного сканирования и тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). Полученные данные проверяли на присутствие как интактных пептидов, так и протеолитических форм по точным массам протонированных молекул, а также по основному набору фрагментных ионов, образующихся в процессе диссоциации, индуцированной соударениями (ДИС). Количество обнаруженных интактных пептидов в образцах, полученных обработкой кожных секретов соляной кислотой и метанолом варьировалось от 6 до 7, тогда как количество протеолитических форм иногда было более 100, т.е. процесс дезактивации энзимов не был поностью подавлен. ФМСФ, к сожалению, не показал должного эффекта. Для него не было обнаружено интактных пептидов вовсе. Таким образом, предварительно полученные результаты не позволили выявить наилучшего подхода для ингибирования эндопротеаз, а исследование данного вопроса требует дополнительных экспериментов. Поскольку получение новых образцов кожных секретов ограничено образом жизни и метаболизмом земноводных, за отчетный период не удалось закончить полностью данную часть намеченных планов. Было принято решение в новом сезоне (весна 2022) повторить еще раз отбор проб субстратов, используя различные подходы для ингибирования эндопротеаз, сделать большее число экспериментов, набрать статистику. Именно такого уровня результаты могут быть предметом публикации в журналах первого квартиля Web of Science. 2. Работа по выявлению изменений в кожном пептидном секрете в условиях патогенного бактериального воздействия проведена на трех самках травяных лягушек Rana temporaria, отловленных в Коломенском районе Московской области. Контрольная (К) и две подвергавшиеся экспериментальному воздействию особи (Э1 и Э2) содержались отдельно в трех пластмассовых контейнерах размерами 38 см × 32 см × 16 см. В работе использовались штамм 13267 Micrococcus luteus и непатогенный тестовый штамм 209-P Staphylococcus aureus. Оба вида относятся к грамположительным бактериям. Бактерии M. luteus присутствуют в нормальной флоре кожи млекопитающих, а отдельные штаммы Staphylococcus aureus могут быть опасны и для человека. Воздействие микроорганизмов на состав кожных выделений осуществляли помещением экспериментальных особей в пластмассовые контейнеры (24 см × 15 см × 12 см), содержащие водные суспензии бактерий M. luteus и S. aureus с концентрациями клеток 103 и 106 кл × мл–1. Последовательность бактериального воздействия была следующей: 1) М. luteus ,103 кл × мл -1; 2) M. luteus,106 кл × мл–1; 3) S. aureus,103 кл × мл–1; 4) S. aureus, 106 кл × мл–1. Время контакта с микроорганизмами в каждой концентрации составляло 30 часов (пять дней по шесть часов), высота водного слоя в контейнере равнялась 2 см. Кожный субстрат получали на следующий день после 30-часового контакта с каждой из бактерий. Интервал между воздействиями бактерий M. luteus и S. aureus в каждой из концентраций составлял 9 дней. Для учета влияния стресса, развивающегося у сухопутных лягушек R. temporaria от периодического воздействия на них водной среды, контрольная лягушка помещалась в равный по размерам (24 см × 15 см × 12 см) и высоте водного слоя контейнер (2 см). Мы отказались от полного погружения их в водный раствор, поскольку в природе травяные лягушки R. temporaria ведут преимущественно сухопутный образ жизни. Общая длительность эксперимента составила 62 дня, за которые пятикратно были получены кожные секреты спинных желез. В итоге были получены 15 образцов кожных секретов (по пять для контрольной и двух экспериментальных особей) со следующими маркировками: «И» – исходный, собранный до контакта экспериментальных особей с микроорганизмами; «Мн» – полученный от тех же лягушек после 30 часов контакта с M. luteus в низкой концентрации бактерий, 103 кл × мл–1; «Мв» – образец, собранный после 30 часов воздействия M. luteus в высокой концентрации бактерий, 106 кл•мл–1; «Sн» – отобранный после 30 часов контакта с бактериями S. аureus в низкой концентрации, 103 кл × мл–1; «Sв» – полученный после 30 часов экспонирования экспериментальных особей с S.aureus в высокой концентрации, 106 кл × мл–1. Собранные секреты трех особей различались тем, что для контрольной лягушки (К) они отражали её реакцию на длительность содержания в неволе и стрессовое воздействие водной среды (стресс «неволи в водной среде»), тогда как экспериментальные особи Э1 и Э2 испытывали дополнительное воздействие микроорганизмов. Процентное содержание каждого компонента в смеси рассчитывалось как отношение площади пика пептида на ВЭЖХ-МС/МС хроматограмме к сумме площадей всех компонентов пептидной смеси, подлежащих масс-спектрометрическому мониторингу. Пик каждого пептида на ВЭЖХ-МС/МС хроматограммах, построенных в полном ионном токе, образован разнозарядными ионами данного пептида. Поэтому площадь хроматографического пика каждого пептида вычислялась как сумма площадей пиков на масс-хроматограммах, построенных для ионов этого пептида, имеющих разные заряды. Мониторировали уровни нескольких десятков пептидов. Наиболее любопытные зависимости зарегистрировали для бревинина-2Т, бревинина-2Те, бревинина-1Та, бревинина-1Т и бревинина-1Тb, а также ряд пептидов из семейства темпоринов. Тем не менее, полученные результаты не позволили сделать надежных выводов о влиянии использованных микроорганизмов на секретирование конкретных пептидов. Например, у контрольной лягушки в течение ~ пяти недель шло 16-ти кратное падение бревинина-1Та. Контакт с бактериями S. aureus в низкой концентрации (103 кл × мл-1) активизирует его синтез. При тысячекратном увеличении концентраций бактерий S. aureus (106 кл × мл-1) доля бревинина-1Та в секрете особи Э1 возросла приблизительно втрое. Однако у второй экспериментальной лягушки Э2 такого возрастания не произошло, а отмечалось падение его выработки. Подобные разнонаправленные колебания секретирования пептидов вне зависимости от контакта с бактериями или физического состояния особи не позволяют предложить рационального объяснения происходящих изменений. Требуется более серьезный подход к проведению подобных экспериментов с набором статистики в значительно более приспособленных для этой цели лабораторных условиях. 3. С помощью масс-спектрометрии с ДИС, ДАСПЭ, диссоциации, индуцированной переносом электрона (ДПЭ), и комбинированного варианта ДПЭ-ДАСПЭ (EThcD) проведен анализ пептидов, содержащихся в кожном секрете лягушки Rana temporaria из Словенской популяции. Всего удалось идентифицировать 60 пептидов. В число идентифицированных входят 6 новых пептидов, относящихся к уже известным классам: 5 темпоринов и один бревенин 1. Подобраны условия для наиболее эффективной фрагментации пептидов. ДАСПЭ с нормализованной энергией соударений 28 показала себя довольно эффективной, поскольку в таких спектрах снижена интенсивность вторичной фрагментации и увеличено количество фрагментных ионов в области низких масс. Напротив, для классического варианта активации фрагментации соударением (ДИС) оптимальной оказалась нормализованная энергия соударений 35. Для новых пептидов частично установлены изомерные Leu/Ile в последовательностях благодаря разработанному нами подходу на основе тандемной масс-спектрометрии МС3 с регистрацией ДПЭ-ДАСПЭ спектров, т.е. без ручного выделения первичных z-ионов с последующим инициированием их фрагментации. В основе разработанного подхода стоит регистрация w-ионов, образующихся при фрагментации боковой цепи лейцина/изолейцина с выбросом изопропильного или этильного радикалов соответственно. Долгое время существующие алгоритмы автоматизированного de novo секвенирования были крайне неэффективны при работе с нетриптическими природными пептидами, в том числе пептидами амфибий. В последние годы появились новые программы для проведения секвенирования. Было проведено сравнение результатов ручного секвенирования с автоматическим с помощью программного обеспечения PEAKS Studio X Pro. Программа позволяет с высокой степенью достоверности устанавливать последовательности коротких пептидов, особенно в случае структур, богатых лизинами, однако для длинных дисульфидсодержащих пептидов результаты программы оказываются хуже. Тем не менее подобное ПО уже может быть полезным вспомогательным инструментом для ручного секвенирования. Результаты данной работы были опубликованы в журнале Analytical and Bioanalytical Chemistry (“Differentiation of Central Slovenian and Moscow populations of Rana temporaria frogs using peptide biomarkers of temporins family” https://doi.org/10.1007/s00216-021-03506-1). 4. К сожалению, результаты изучения кожного пептидома Кубинского эндемичного вида древесной квакши Octeopilus septentrionalis были опубликованы в работе «Manual mass spectrometry de novo sequencing of the anionic host defense peptides of the Cuban Treefrog Osteopilus septentrionalis» в 2021 году в журнале Rapid Communications in Mass Spectrometry, 35(7), doi.org/10.1002/rcm.9061 (Samgina TY., Tolpina MD., Surin AK., Kovalev SV., Bosch RA, Alonso IP, Garcia F A, Gonzalez Lopez LJ, Lebedev AT.), не дожидаясь решения РНФ о рассмотрении данной заявки, в связи с чем данная публикация не содержит информации о финансировании со стороны фонда. Несмотря на это данный пункт плана на 2021 выполнен в полном объеме. В работе были установлены сиквенсы шестнадцати новых анионных пептидов двух новых семейств: септенинов 1 и септенинов 2. Секвенирование было проведено на основе анализа спектров, полученных двумя методами фрагментации: ДИС и диссоциацией, активируемой столкновениями при повышенной энергии (ДАСПЭ). Для надежной идентификации зеркально-симметричных N- и С-концевых последовательностей септенинов было проведено ацетилирование N-терминальных групп. В работе рассмотрено побочное ацетилирование боковой цепи серина, в результате которого возникает задача идентификации изомерных SerO_acyl и остатка глутаминовой кислоты. Предложено дифференцировать эти изомеры по потере молекулы кетена из боковой цепи SerO_acyl при одновременном отсутствии потери воды из анализируемого фрагментного иона, что характерно для боковой цепи глутаминовой кислоты. В работе показано, что снижение энергии активирующих частиц с NCE 35 до NCE 28 (NCE нормализованная энергии активации) существенно повышает информативность спектров активации фрагментации при повышенной энергии (ДАСПЭ): серии опорных для de novo секвенирования b/y ионов удлиняются, вторичные процессы фрагментации интенсивных ионов резко снижаются, что повышает надежность процедуры масс-спектрометрического секвенирования пептидов. Все септенины 1 и септенины 2 кубинской лягушки Octeopilus septentrionalis являются анионными пептидами (отрицательно заряженными при физиологических значениях рН), для большинства которых характерно проницание мембран патогенных клеток под острым углом. Полученные в работе расчетные значения гидрофобности, гидрофобных моментов и α-спиральности септенинов 1 и септенинов 2 на основании их сиквенсов свидетельствуют, что большинство из них потенциально могут обладать свойствами наклонно-ориентированных пептидов и проявлять бактерицидную активность.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Создание масс-спектрометрического метода полного de novo секвенирования интактных природных биологически активных пептидов земноводных
Результаты этапа: 1. Были собраны кожные секреты лягушки Rana arvalis, у которых ингибирование эндопротеаз осуществляли метанолом, соляной кислотой, уксусной кислотой, а также коммерчески доступным ингибитором протеаз – фенилметилсульфонил фторидом (ФМСФ). Образцы были лиофилизированы, подготовлены и проанализированы методом ВЭЖХ-МСВР. Ведется работа со спектрами. 2. В результате изучения интактных и карбоксамидометилированных пептидов кожных секретов словенской лягушки Rana arvalis методом ВЭЖХ-МС/МС с различными методами инициирования фрагментации (ДАС, ДАСПЭ, ДПЭ и ДПЭ-ДАСПЭ (EThcd)) были установлены аминокислотные последовательности 18 пептидов. Было проведено популяционное сравнение пептидомов подмосковной и словенской популяций. Отличие кожных пептидомов словенской популяции заключалось в изменении внутри семейств темпоринов и бревининов 2, возможно, ключевых в адаптации словенской популяции к изменившимся условиям места обитания. В качестве биологических маркеров особей Rana arvalis из словенской популяции были предложены пять новых пептидов: это бревинин 2 AV, ранатуерин 2 AVc, AK-23-1 (MRP), темпорин AV и темпорин Ava, а для лягушек из подмосковной популяции - ранатуерин 2AVa, [Hyp3]RL-16 и [Glu5]RA-11. Высокое разрешение орбитальной ловушки, вдвое увеличенное время хроматографического разделения кожных секретов, отложенное сканирование интенсивных ионов и высокая скорость сканирования спектров позволили зафиксировать и секвенировать два мелиттин-родственных пептида (один из которых новый), чьи массы различались всего на 0,004 Да. Наиболее информативными для целей de novo секвенирования компонентов кожных пептидомов словенских R. arvalis оказались спектры EThcD. Они использовались для секвенирования последовательностей внутри «Rana box» (дисульфидный С-концевой цикл) в интактных дисульфидсодержащих пептидах: для установления последовательности коротких амидированных темпоринов; для точного определения сайта карбонилирования в темпорине AVa; и идентификации всех изомерных лейцинов/изолейцинов (Leu/Ile) в двух мелиттин-родственных пептидах, количество которых в их последовательности доходило до 5-6 пар. 3. Изучены интактные кожные секреты лягушек Архангельской популяции Rana temporaria комплексом методов различных вариантов масс-спектрометрической фрагментации. Были секвенированы 34 пептида, четыре из которых из семейства темпоринов (U, V, W, X) были выявлены впервые. Кроме того, в секрете этой северной популяции зафиксирован бревинин 2Td, чья последовательность ранее была предсказана cDNA клонингом, но не обнаруживалась в кожных секретах до настоящего времени. Был впервые использован прием top down для de novo секвенирования кожных пептидов, подразумевающий определение последовательностей исключительно масс-спектрометрическим путем, без использования трипсинолиза и любых других модификаций пептидных смесей. Спектры EThcD снова оказались самыми информативными для de novo секвенирования пептидов ранидных лягушек. По этим спектрам удалось установить последовательности дисульфидсодержащих пептидов с интактной внутримолекулярной S-S связью; короткие, сложно фрагментирующие в условиях других методов фрагментации, темпорины и четко дифференцировать изомерные аминокислоты в парах Ile/Leu. Сравнение кожных пептидомов четырех популяций Rana temporaria показало, что с продвижением популяций травяной лягушки в северные широты суммарное число секретируемых ею антимикробных пептидов не уменьшается.
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Создание масс-спектрометрического метода полного de novo секвенирования интактных природных биологически активных пептидов земноводных
Результаты этапа: 1. Изучен механизм фрагментации внутри С-терминального дисульфидного цикла и разрыва S-S связи, предложена общая схема протекающих реакций на основе спектров EThcD. В ходе данной фрагментации в многозарядных ионах дисульфидсодержащих пептидов электрон захватывается аминокислотным остатком основной аминокислоты внутри цикла с последующим переносом радикального центра на карбоксильный атом углерода, как это предполагает механизм ДЗЭ. Показано, что образование серий c-катион-радикалов, соответствующих последовательностям «Rana box», происходит не благодаря последовательным выбросам остатков аминокислот из ионов предшествующих поколений, а за счёт миграции радикального центра в раскрывшемся цикле, представляя тем самым концепцию мобильного радикального центра. 2. Использование тандемных масс-спектрометрических экспериментов с комбинацией методов EThcD и ДАС/ДАСПЭ продемонстрировало комплементарность получаемых структурных данных. Характерно, что информация, полученная двумя этими методами о сиквенсах внутри интактных «Rana box», была взаимодополняющей, дающей в сумме полную последовательность (бревинин 1Т, бревинин 1Та, бревинин 1Тb). Даже если раскрытия цикла в ДАСПЭ у интактных бревининов 1 не достигалось, результаты разрыва S-S связи одного EThcD позволили установить последовательность внутри «Rana box» полностью (бревинины 1AVa и 1AVb). Для дисульфидных ранатуеринов с шестичленным «Rana box» в условиях ДАСПЭ активной фрагментации внутри не происходит, тогда как в случае EThcD раскрытие цикла происходит стабильно, оставляя неразрешённой только C-концевую пару аминокислот. Однако, учитывая что на С-конце всегда находится цистеин этот момент не создает дополнительных проблем. Было продемонстрировано, что химическое модифицирование пептидов, даже самое щадящее, приводит к искажению результата из-за своей неселективности и не 100% эффективности. Что важнее, это также приводит к потере части компонентов, присутствующих в интактном образце в минимальных количествах, в процессе модифицирования и последующей очистки. Такими образом, на ряде примеров нами была показана возможность и эффективность подхода сверху-вниз (top-down) без предварительного трипсинолиза и любых других модификаций для секвенирования секретов амфибий, содержащих дисульфидные пептиды. 3. При выявлении наиболее оптимального и эффективного ингибитора протеаз кожных секретов амфибий были изучены образцы, обработанные метанолом, соляной кислотой, муравьиной кислотой и ингибитором протеаз – фенилметилсульфонил фторидом (ФМСФ). Среди исследованных ингибиторов наилучшим образом себя показал метанол и соляная кислота. Для них наблюдалось наименьшее количество протеоформ в образцах кожных секретов, а также интенсивность сигналов протонированных протеоформ относительно интактного пептида была наименьшей. Образование окисленных форм пептидов было в большей степени обнаружено в образцах, ингибированных соляной кислотой. В связи с этим метанол следует считать оптимальным ингибитором протеаз кожных секретов амфибий, а соляную кислоту можно рассматривать как дополнительную опцию. ФМСФ оказался полностью непригодным для данных целей, вероятно, в связи с неподходящим механизмом действия. 4. В составе кожного секрета словенских особей R. dalmatina обнаружены пептиды следующих семейств: бревинины 1, бревинины 2, мелиттин-родственные пептиды (MRPs), темпорины и брадикинин-родственные пептиды (BRPs). По набору пептидных семейств в кожном секрете R. dalmatina схожа с травяной лягушкой. Помимо 4-х дисульфидных бревининов 1,2, в секрете обнаружен мелиттин-родственный пептид FQ-22, полностью идентичный выделенному из секрета R. Temporaria, а также десять темпоринов. Девять из них (темпорины (A,B,C,D,F,K,G,H,М) были ранее известны, а темпорин 1Da был секвенирован впервые. В секретах всех трех особей словенской популяции R. dalmatina присутствует ряд BRPs. Это прежде всего сам брадикинин и агонист его рецептора [desArg9]BR, а также структурный аналог [Thr6]Br. Помимо них в секретах присутствуют продукты протеолиза самого брадикинина. Состав секретируемых BRPs у R. dalmatina существенно беднее в сравнении с R. temporaria, у которой брадикинин - мажорный пептид секрета: R. dalmatina уступает травяной лягушке как по разнообразию аналогов брадикинина и их протеолитических форм, так и по интенсивности сигналов всех ионов брадикинин связанных пептидов на хроматограмме. 5. Набор антимикробных пептидов, полученный клонированием кДНК (транскриптом), всегда существенно больше реально секретируемого (кожный пептидом). Изучение литературных данных показало, что результаты клонинга зависят от правильности определения рамок начала и конца считывания закодированной в кДНК информации. Неверно определенные рамки начала и конца считывания часто приводят к неверным результатам, вследствие богатого разнообразия последовательностей пептидов. Верность определения начала и конца считывания прямо зависят от изученности компонентного состава реально секретируемых кожных пептидомов. В литературе мало работ, сопоставляющих транскриптом и кожный пептидом для конкретного вида ранидных лягушек. Мы провели такое сравнение для бурой словенской лягушки Rana dalmatina, где наглядно показали, насколько правильность определения транскриптома этой лягушки зависела от предварительной изученности компонентного состава ее кожного пептидома. Данных по составу пептидома Rana dalmatina до нашей публикации в литературе отсутствовали, что сказалось на качестве определения кожного транскриптома методами клонирования. 6. Кожный секрет R. arvalis из Новосибирской популяции был собран в полевых условиях путем ручной стимуляции. В качестве ингибиторов протеаз были использованы соляная и муравьиная кислоты. Однако, ВЭЖХ-МС анализ полученных секретов показал практически полное отсутствие зрелых пептидов в зарегистрированных спектрах. Среди идентифицированных вручную пептидов были обнаружены брадикинин и его производные, протеолитические фрагменты бревининов и ранатуеринов, а также N-концевые протеолитические фрагменты ранатуерина 2 и бревинина 1. В результате такой метод пробоотбора кожного секрета амфибий был признан крайне неэффективным. 7. Пролонгированное время разделения (200 мин против обычных 85) позволило существенно увеличить количество зарегистрированных тандемных масс-спектров как мажорных, так и минорных компонентов, однако массив данных оказывается чрезмерно велик (около 28 000 спектров против 15 000). При этом количество идентифицируемых пептидов оказывается одинаковым (около 1500 приписываемых последовательностей в обоих случаях). Ввиду получения схожего результата по составу пептидома, основные усилия были сфокусированы на доработке масс-спектрометрического метода секвенирования «сверху-вниз».
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Создание масс-спектрометрического метода полного de novo секвенирования интактных природных биологически активных пептидов земноводных
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".