ИСТИНА

Проект посвящен выяснению механизмов регуляции процессов электронного транспорта в хлоропластах – энергопреобразующих органеллах растительной клетки. Актуальность и практическая значимость проекта определяется тем, что процессы регуляции фотосинтеза обеспечивают оптимальное функционирование фотосинтетического аппарата растений при изменяющихся условиях среды обитания растений. Строение и функциональная организация фотосинтетического аппарата растений в настоящее время хорошо известны. Однако до сих пор остаются нерешенными задачи, связанные с выяснением структурно-функциональных механизмов регуляции фотосинтеза. Структурные перестройки, происходящие на разных уровнях организации фотосинтетического аппарата, – один из важнейших факторов регуляции фотосинтеза и адаптации растений к изменяющимся условиям среды. В центре проекта – исследование взаимосвязи между процессами электронного и протонного переноса в хлоропластах, с одной стороны, и структурными перестройками фотосинтетического аппарата растений, с другой стороны. Структурные перестройки хлоропластов включают в себя, в частности, изменения состава и свойств пигмент-белковых белковых комплексов и липидных областей тилакоидных мембран хлоропластов, а также их распределение в неоднородных тилакоидных мембранах. Выяснение механизмов структурно-функциональной регуляции электронного транспорта в хлоропластах требует комплексного исследования этих процессов, с привлечением как традиционных, так и новых, современных методов физико-химического анализа надмолекулярных структур клетки, к которым относятся хлоропласты. В этой связи становится актуальным исследование фотосинтетического аппарата хлоропластов с использованием уникального оборудования и инструментально-приборной базы мирового уровня, которой располагает ОИ АХБС. К такому оборудованию относятся, в частности, установки для прецизионной конфокальной флуоресцентной микроскопии и масс-спектрометрии. Для решения задач проекта предполагается провести цикл экспериментальных исследований структурных и функциональных свойств хлоропластов на различных уровнях организации фотосинтетического аппарата растений, от изолированных хлоропластов до листьев высших растений. В качестве объектов исследования будут изучаться растения «контрастных» видов, принадлежащих к разным экотипам (например, теневыносливые и светолюбивые растения рода Cucumis - Cucumis sativus (огурец) и Melon (дыня)), произрастающие в различных условиях (интенсивность света, режим освещения, температура, влажность). Наряду с методами конфокальной флуоресцентной микроскопии и масс-спектрометрии, которыми располагает ОИ АХБС, в работе будут использованы методы электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), оптической абсорбционной спектроскопии, методы анализа флуоресценции и термолюминесценции хлоропластов, иммуноферментный анализ белков, препаративные методы. Будут также проведены циклы теоретических исследований, направленных на описание кинетики электрон- и протон-транспортных процессов в хлоропластах и выяснение биофизических аспектов регуляции электронного транспорта в хлоропластах (методы квантовой химии и молекулярной динамики). В результате всего комплекса исследований, предусмотренных проектом, будут выяснены ключевые механизмы регуляции электронного транспорта в хлоропластах на стадиях, контролирующих скорость электронного транспорта между двумя фотосистемами и распределение электронных потоков по альтернативным путям переноса электронов (нециклический и циклический электронный транспорт). Будут изучены механизмы регуляции световых стадий фотосинтеза, обусловленные структурными перестройками тилакоидных мембран хлоропластов (перераспределение белковых комплексов и мембранных липидов между тилакоидами гран и стромы), определяющими оптимальное функционирование фотосинтетического аппарата. Будут изучены механизмы адаптации фотосинтетического аппарата растений к условиям произрастания и его устойчивость к световому и тепловому стрессу (на примере «контрастных» экотипов растений). Будет проведен теоретический анализ механизмов регуляции электронного транспорта в хлоропластах в рамках обобщенной кинетической модели фотосинтеза, а также исследования методами квантовой химии и молекулярной динамики, что необходимо для понимания регуляторных и защитных механизмов фотосинтеза на молекулярном уровне структурной организации фотосинтетического аппарата. Таким образом, комплексное решение задач проекта будет способствовать более глубокому пониманию структурно-функциональных механизмов регуляции фотосинтеза у растений и их адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды.

The project is directed to the elucidation of the mechanisms of electron transport regulation processes in chloroplasts – the energy-transducing organelles of the plant cell. The relevance and practical significance of the project is determined by the fact that the processes of photosynthesis regulation ensure optimal functioning of the photosynthetic apparatus of plants under variable conditions of the plant habitat. The structure and functional organization of the photosynthetic apparatus of plants are now well known. However, there are still unsolved problems related to the elucidation of structural and functional mechanisms of photosynthesis regulation. Structural changes at different levels of the photosynthetic apparatus are one of the most important factors in regulation of photosynthesis and plant adaptation to changing environmental conditions. The project focuses on studying the relationships between electron and proton transfer processes in chloroplasts, on the one hand, and structural changes in the photosynthetic apparatus of plants, on the other hand. Structural rearrangements of chloroplasts include, in particular, changes in the composition and properties of pigment-protein protein complexes and lipid domains of the thylakoid membranes of chloroplasts, and their distribution in the membranes. Elucidation of the mechanisms of structural and functional regulation of electronic transport in chloroplasts requires a comprehensive study of these processes, involving both traditional and new, modern methods of physical and chemical analysis of supramolecular cell structures, which include chloroplasts. In this regard, it becomes relevant to study the photosynthetic apparatus of chloroplasts using unique equipment and a world-class instrument base, which is available in the Infrastructure Object (IO) AHBS. Such equipment includes, in particular, installations for precision confocal fluorescence microscopy and mass-spectrometry. To solve the project tasks, it is planned to conduct a series of experimental studies on the structural and functional properties of chloroplasts at various levels of the organization of the photosynthetic apparatus of plants, from isolated chloroplasts to the leaves of higher plants. The objects of research will be plants of "contrasting" plant species belonging to different ecotypes (for example, shade-loving and light-resistant plants of genus Cucumis, Cucumis sativus and Melon) and grown under different conditions (light intensity, lighting mode, temperature, humidity). Along with the methods of confocal fluorescence microscopy and mass-spectrometry available at the IO, the methods of electron paramagnetic resonance (EPR), optical absorption spectroscopy, analysis of fluorescence and thermoluminescence of chloroplasts, enzyme immunoassay of proteins, and preparative methods will be used. There will also be performed the relevant cycles of theoretical research aimed at the description of the kinetics of electron transport processes in chloroplasts and the elucidation of biophysical aspects of regulation of electron transport processes in chloroplasts (quantum chemistry and molecular dynamics methods). As a result of the entire set of studies provided for by the project, the key mechanisms of electronic transport regulation in chloroplasts that control the rate of electronic transport between two photosystems and the distribution of electronic flows along alternative electron transport paths will be clarified. The mechanisms of regulation of the light stages of photosynthesis caused by structural rearrangements of the thylakoid membranes of chloroplasts (redistribution of protein complexes and membrane lipids between the granal and inter-granal thylakoids) that determine the optimal functioning of the photosynthetic apparatus will be studied. The mechanisms of adaptation of the photosynthetic apparatus of plants to changing growth conditions and its resistance to light stress will be studied (using the example of "contrasting" plant ecotypes). Theoretical analysis of the mechanisms of regulation of electron transport in chloroplasts within the framework of a generalized kinetic model of photosynthesis, as well as research using quantum chemistry and molecular dynamics methods, will contribute to a deeper understanding of the regulatory mechanisms at the molecular level of the structural organization of the photosynthetic apparatus. Thus, the integrated solution of the project tasks will contribute to a deeper understanding of the structural and functional mechanisms of photosynthesis regulation in plants and their adaptation to changing environmental conditions.

1 год 1) Двумя независимыми методами, c использованием спектроскопии ЭПР 3-см диапазона и оптической спектроскопии, позволяющими регистрировать редокс-превращения фотореакционного центра Р700 in situ (листья), будет изучена кинетика фотоиндуцированных превращений Р700 и генерация транс-мембранной разности рН (оцениваемая по скорости восстановления Р700+) в хлоропластах листьев контрастных видов растений. Растения будут выращиваться в климатической камере при различных интенсивностях освещения, а также при варьировании соотношения светового и темнового периодов. На основании этого цикла исследований, с учетом результатов кинетического анализа кинетики световых стадий фотосинтеза в рамках нашей математической модели оксигенного фотосинтеза, будет определено соотношение вкладов нециклического и циклического транспорта электронов в работу фотосинтетического аппарата в зависимости от условий произрастания растений – «долгосрочные» изменения фотосинтетического аппарата, и в результате его «краткосрочных» изменений функционального состояния (в зависимости от адаптации листьев к темноте или к свету). 2) Методом спиновых зондов будет изучено, как может меняться физическое состояние липидных областей тилакоидных мембран в хлоропластах, выделенных из указанных выше видов растений, зависеть от условий выращивания растений (высокая и низкая интенсивности света). Для общего анализа «микровязкости» липидного бислоя тилакоидных мембран на различной глубине будут использованы амфифильные зонды - спин-меченые производные стеариновой кислоты, у которых парамагнитный фрагмент удален на разное расстояние от карбоксильной группы. 3) Будут проведены исследования по разработке оптимальных способов подготовки препаратов хлоропластов, изолированных из проростков Vicia faba, для изучения их методом конфокальной флуоресцентной микроскопии. В ходе этих исследований будет отработана методика фиксации хлоропластов, проведены тестовые эксперименты с высушенными и замороженными препаратами хлоропластов, выработан адекватный протокол измерений латеральных профилей флуоресценции хлорофилла в хлоропластах, возбуждаемой непрерывным светом различных длин волн (405, 488, 561 и 630 нм). Будут проведены пробные измерения латерального профиля флуоресценции хлоропластов, выделенных из контрастных видов растений одного из родов растений (Tradescantia или Cucumis). 4) Методом флуоресцентной конфокальной микроскопии будет проведен анализ локализации растительных клеток, содержащих хлоропласты, в листьях контрастных видов растений (рода Tradescantia или Cucumis), выращенных при низкой и высокой интенсивностях света. 5) Будут проведены квантово-химические расчеты для системы, моделирующей реакцию окисления пластохинола цитохромным b6f-комплексом. Модельная системы будет включать в себя (FeS)2 кластер железосерного белка Риске и низкопотенциальный гем цитохрома b, окруженные ближайшими аминокислотными остатками, формирующими хинон-связывающий центр Qo. Будут рассчитаны энергетические профили реакции окисления пластохинола для различных сценариев протекания реакции в зависимости от локализации субстрата («бесхвостный» аналог молекулы пластохинола) относительно двух акцепторов электрона -(FeS)2 кластера и гема цитохрома b, а также в зависимости от последовательности одноэлектронных стадий «бифуркационной» реакции переноса электрона к железосерному белку Риске или к низкопотенциальному цитохрому b6 (Q-цикл Митчелла). 6) Будет построена модельная система, имитирующая липидный бислой тилакоидной мембраны (галактолипиды - 80%, фосфолипиды – 20%), окруженной раствором, содержащим физиологические концентрации MgCl2 и NaCl. Для этой системы методом молекулярной динамики будут рассчитаны трансмембранный профиль подвижности углеводородных цепей липидов и коэффициент латеральной подвижности липидов. Будут смоделированы структурные перестройки липидной мембраны за счет изменений концентрации ионов Mg2+. моделирующих эффект свето-индуцированного перераспределения ионов в хлоропластах. 7) Будет модифицирована разработанной нами ранее кинетической модели световых стадий фотосинтеза, предназначенная для описания кинетики фотоиндуцированных редокс-превращений Р700 и динамики выхода флуоресценции хлорофилла ФС2 в хлоропластах класса А с учетом латеральной гетерогенности тилакоидных мембран.

Для решения задач мембранной биоэнергетики, связанных с измерениями трансмембранной разности протонных потенциалов (Delta_pH) в фотосинтетических системах, были развиты три независимых метода количественного определения Delta_pH в хлоропластах. а) «Кинетический» метод, основанный на измерении скорости переноса электронов между ФС2 и ФС1 (Tikhonov et al. 2014). б) Метод, основанный на основанный на использовании рН-чувствительных спиновых меток, у которых спектры ЭПР зависят от рН среды (Tikhonov et al. 2008). в) Метод, основанный на эффекте концентрационного уширения спектра ЭПР спиновой метки Темпоамин (Trubitsin, Tikhonov, J. Magn. Res., 2003). Авторский коллектив имеет многолетний опыт в изучении индукционных явлений оксигенного фотосинтеза (хлоропластах высших растений, цианобактерии) методом ЭПР (Tikhonov et al., Biochim. Biophts. Acta, 1981; Trubitsin et al. BBA-bioenergetics, 2005; Kuvykin et al., BBA-bioenergetics, 2011). Разработана математическая модель фотосинтеза, в которой были рассмотрены ключевые стадии электронного и протонного транспорта в хлоропластах, сопряженные с реакциями синтеза АТР мембранно-связанной АТР синтазой и потреблением АТР и NADPH – продуктов световых стадий фотосинтеза – в реакциях цикла Кальвина-Бенсона (Vershoubskii et al. 2011; Tikhonov, Vershoubskii, 2014). Показано, что эта модель позволяет адекватно описать достаточно широкий круг регуляторных явлений фотосинтеза(Kuvykin et al., BBA-bioenergetics, v.1807 (2011) 336-347). Участники проекта имеют опыт применения современных методов квантовой химии для расчетов электронной структуры молекул и моделирования биоэнергетических процессов (Ikriannikova et al., 2004, 2010; Фролов и др., 2010). Накопленный нами опыт квантово-химических расчетов биохимических процессов будет использован в проекте для моделирования второй стадии окисления пластохинола (окисление пластосемихинона цитохромом b6f-комплексом; Ustynyuk, Tikhonov, 2018).

1-ый год (2021) 1) Цикл исследований функциональных характеристик хлоропластов в ЛИСТЬЯХ контрастных видов высших растений (T.fluminensis – тенелюбивый вид, и T.sillamontana - светолюбивый вид, род Tradescantia; Melon и Cucumis sativus, род Cucumis). Методами ЭПР-спектроскопии и оптической спектроскопии будут изучены кинетика редокс-превращений фотореакционного центра Р700 и генерация транс-мембранной разности рН (Дельта_рН), определяемая кинетическим методом (см. выше), в ЛИСТЬЯХ растений, выращенных при низкой (порядка 50-100 мкмоль квантов м-2 с-1) и высокой (800-1000 мкмоль квантов м-2 с-1) интенсивностях света. 2) Сравнительное исследование с помощью липидорастворимых спиновых зондов физического состояния мембран изолированных хлоропластов, выделенных из указанных выше видов растений, выращенных при высокой и низкой интенсивностях света. Для анализа «микровязкости» липидного бислоя тилакоидных мембран на различной глубине будут использованы амфифильные зонды - спин-меченые производные стеариновой кислоты, у которых парамагнитный фрагмент удален на разное расстояние от карбоксильной группы. 3) Подготовка препаратов хлоропластов, изолированных из проростков Vicia faba, отработка методики фиксации хлоропластов (высушенные и замороженные препараты хлоропластов) для проведения тестовых экспериментов по конфокальной флуоресцентной микроскопии. Измерения латерального профиля флуоресценции хлорофилла, возбуждаемой непрерывным светом различных длин волн в хлоропластах; оптимизация условий измерений для различных способов фиксации хлоропластов. Сравнительные измерения латерального профиля флуоресценции хлоропластов, выделенных из контрастных видов растений одного рода (Tradescantia, Cucumis). 4) Сравнительный анализ (методом флуоресцентной конфокальной микроскопии) локализации хлоропластов в листьях контрастных видов растений (Tradescantia, Cucumis), выращенных при низкой и высокой интенсивностях света. 5) Проведение квантово-химических расчетов для моделирования реакции окисления пластохинола в Qo-центре цитохромного b6f-комплекса в модели, предполагающей функционирование Q-цикла Митчелла. Анализ различных сценариев протекания этой реакции в зависимости от локализации пластохинола и последовательности двух одноэлектронных стадий «бифуркационной» реакции окисления пластохинола: переноса электрона от пластохинола к железосерному центру Риске (стадия 1) или к низкопотенциальному цитохрому b6 (стадия 2). 6) Построение молекулярно-динамической системы, моделирующей липидный бислой тилакоидной мембраны (галактолипиды - 80%, фосфолипиды – 20%), окруженной раствором, содержащим MgCl2 и NaCl. Анализ трансмембранного профиля подвижности углеводородных цепей липидов, латеральной подвижности липидов, динамики структурных перестроек в зависимости от концентрации ионов Mg2+, моделирующих эффект светоиндуцированного перераспределения ионов в хлоропластах. 7) Модификация разработанной ранее кинетической модели световых стадий фотосинтеза, описывающей электрон- и протон-транспортных процессов в хлоропластах класса А, предназначенной для количественного анализа кинетики фотоиндуцированных редокс-превращений Р700 и динамики выхода флуоресценции хлорофилла ФС2 с учетом латеральной гетерогенности тилакоидных мембран. 2-ой год (2022) 1) В продолжение исследований, выполненных в 2021 году на ЛИСТЬЯХ, методами ЭПР-спектроскопии и оптической абсорбционной спектроскопии будет проведено сравнительное исследование кинетики электронного транспорта между ФС2 и ФС1 в ИЗОЛИРОВАННЫХ ХЛОРОПЛАСТАХ контрастных видов, выращенных при различных температурах (в интервале от 12 до 35оС) и интенсивностях света. Для этих же препаратов хлоропластов методом спиновых зондов будет проведено сравнительное исследование физического состояния мембран хлоропластов растений, выращенных при различных температурах и интенсивностях света. 2) Используя отработанную в 2021 году методику измерений структурных характеристик свойств изолированных хлоропластов, методом конфокальной микроскопии, на основании измерений спектров флуоресценции, будут проведены измерения стационарных латеральных профилей распределения пигмент-белковых комплексов ФС1 и ФС2, выделенных из контрастных видов растений, выращенных при различных условиях (температура и интенсивность света). 3) Будут проведены ТЕСТОВЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ, направленные на отработку методики измерений методом масс-спектрометрии (ToF-SIMS) латеральных профилей распределения липидов в изолированных хлоропластах Vicia faba при различных способах фиксации изолированных хлоропластов. На основании этих опытов будут получены данные, свидетельствующие о перспективах и возможностях применениях этого метода для изучения вариаций латерального профиля распределения липидов вдоль тилакоидных мембран в зависимости от условий произрастания растений. 4) В продолжение начатых в 2021 году теоретических исследований функционировании Q-цикла Митчелла в цитохромном b6f комплексе (окисление пластохинола в Qo-центре), в 2022 году будут выполнены квантово-химические расчеты для моделирования реакции двухэлектронного восстановления пластохинона во втором хинон-связывающем сайте связывания пластохинона (Qi-центр) цитохромного b6f-комплекса. Будет проведен анализ энергетического профиля реакции переноса электрона (через низкопотенциальный и высокопотенциальный гемы цитохрома b6) от пластосемихинона, образующегося в центре Qо, к гему Х, локализованному вблизи центра Qi. Расчеты будут проведены с использованием пакетов программ «Orca» и «Природа». 5) На основании молекулярно-динамической модели тилакоидной мембраны, построенной в 2021 году, в 2022 году будет проведено моделирование диффузионной подвижности пластохинона внутри липидного бислоя модельной мембраны, сформированной липидами (электро-нейтральные галактолипиды и фосфолипиды), различающимися степенью насыщенности углеводородных цепей липидов. 6) Будет выполнен кинетический анализ процессов электронного и протонного транспорта и синтеза АТФ в ХЛОРОПЛАСТАХ КЛАССА А (с учетом активации цикла Кальвина-Бенсона ) и латеральной гетерогенности тилакоидных мембран, предполагающей неоднородное распределение ФС1, ФС2 и АТФ-синтазных комплексов вдоль тилакоидных мембран. В качестве варьируемых параметров модели будут фигурировать линейные размеры тилакоидов и стехиометрическое соотношение между ФС1 и ФС2 (параметры хлоропластов, определенные на основании данных по конфокальной флуоресцентной микроскопии). 3-ой год (2023) 1) В продолжение кинетических исследований на листьях растений, в контексте задачи об альтернативных путях оттока электронов от ФС1 (нециклический и циклический транспорт электронов), в 2023 году будет проведено сравнительное исследование (методами ЭПР-спектроскопии и оптической абсорбционной спектроскопии) кинетики электронного транспорта между ФС2 и ФС1 в листьях и изолированных хлоропластах класса А (интактные хлоропласты). Предполагается, что хлоропласты класса А будут выделены из листьев «контрастных» видов растений рода Tradescantia и Cucumis, выращенных при различных температурах (в интервале от 12 до 35оС) и интенсивностях света (в диапазоне от 50 до 1000 мкмоль квантов м-2 с-1). Предпосылкой для такой постановки задачи служат результаты наших предыдущих исследований, в которых было показано, что интенсивность света при выращивании растений (Tradescantia) влияет на соотношение нециклического и циклического потоков электронов (Kalmatskaya et al. 2020). 2) Методом конфокальной флуоресцентной микроскопии будет изучено ВЛИЯНИЕ ОСВЕЩЕНИЯ НА СТРУКТУРНУЮ ОРГАНИЗАЦИЮ ХЛОРОПЛАСТОВ. Будут проведены измерения латерального профиля распределения пигмент-белковых комплексов ФС1 и ФС2 по спектрам флуоресценции мембран тилакоидов в изолированных хлоропластах Vicia faba, адаптированных к темноте или освещенных светом. Цель этих исследований - определить возможность перераспределение пигмент-белковых и лабильных светособирающих комплексов в латеральном направлении тилакоидной мембраны, индуцированного действием актиничного света различной длительности (в интервале времен экспозиции 0-30 минут). 3) На основании методики, отработанной и верифицированной в предыдущий год выполнения проекта, в 2023 году методом масс-спектрометрии (ToF-SIMS) будут определены латеральные профили распределения липидов в изолированных хлоропластах, полученных из листьев Vicia faba, выращенных при различных условиях (освещение, температура). В основу этих исследований будут положены результаты исследований об оптимальных способах фиксации хлоропластов и методики анализа данных, получаемых методом ToF-SIMS, которые будут разработаны в предыдущий год выполнения проекта. 4) Будут продолжены квантово-химические расчеты, моделирующие СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ внутри цитохромного b6f-комплекса (смещение железосерного кластера белка Риске), сопряженные с редокс-превращениями пластохинола внутри хинон-связывающего центра Qо. В 2023 году мы планируем провести методом КM/MM анализ возможных структурных перестроек в цитохромном b6f-комплексе, используя построенную и изученную в 2022 году расширенную модельную систему. Эта система будет содержать «квантово-химическую» часть (каталитический центр + хинол) и «механическую» часть (остальная часть белкового комплекса). Для проведения ресурсо-затратных структурных расчетов на уровне белковой глобулы предполагается использовать на первом этапе работы полуэмпирический метод («MOPAC2016») и/или КМ/ММ метод, включенный в пакет программ «Firefly». 5) Будет продолжено моделирование методом молекулярной динамики взаимодействия пластохинола, находящегося в центре липидного бислоя, с цитохромным b6f-комплексом (изучение проникновения пластохинола в гидрофобный «карман» сайта связывания хинона). 6) На основе базовой модели световых стадий оксигенного фотосинтеза, разработанной на предыдущих этапах выполнения проекта, будет проведен кинетический анализ процессов электронного и протонного транспорта и синтеза АТФ в хлоропластах класса А и их взаимодействие с дыхательной цепью митохондрий, опосредованного функционированием малатного цикла. Будут смоделированы различные режимы работы интактных хлоропластов, в которых будет проанализирован вклад двух метаболических систем - цикл Кальвина-Бенсона и работа дыхательной цепи - в процессы синтеза и потребления АТФ в растительной клетке. 4-ой год (2024) 1) В контексте задачи о ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ХЛОРОПЛАСТОВ С ДРУГИМИ МЕТАБОЛИЧЕСКИМИ СИСТЕМАМИ растительной клетки (митохондрии, малатный шунт), будет проведен ингибиторный анализ (действие ингибиторов, избирательно влияющих на функционирование митохондрий) и изучено исследование кинетики фотоиндуцированных превращений центра Р700 в листьях родственных, но «контрастных» видов растений (экотипы, различающиеся по ареалам обитания и условиям произрастания), выращенных при различных температурах (в интервале от 12 до 35оС) и различных условиях освещения (интенсивность света и режим освещения). 2) На основании предыдущих исследований по применению метода конфокальной микроскопии для изучения латерального профиля распределения ФС2 к ФС1, в 2024 году предполагается изучить ДИНАМИКУ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ от ФС2 к ФС1 путем импульсного возбуждения комплексов ФС2, расположенных в тилакоидах гран, с последующей регистрацией через определенные промежутки времени изменений редокс состояния ФС1. Таким способом, на основании измерений отклика ФС1 в ответ на вспышки света, возбуждающего ФС2, можно можно будет оценить скорость переноса электронов в латеральном направлении от ФС2 к ФС1. Предполагается, что этим методом будут изучены скорости латерального переноса электронов от Фс2 к ФС1 в хлоропластах, адаптированных к темноте или освещенных актиничным светом, и проведено сравнение с результатами структурных исследований о перераспределении белковых комплексов в латеральном направлении тилакоидных мембран. 3) Сравнительные исследования методом масс-спектрометрии (ToF-SIMS) латеральных профилей распределения липидов в изолированных хлоропластах растений, выращенных при различных условиях (освещение, температура) при способах фиксации хлоропластов, разработанных в предыдущий год выполнения проекта. Цель этого цикла исследования – установление связи между динамикой линейного переноса электронов от ФС2 к ФС1 (см. выше пункт 2) и структурным состоянием липидного бислоя, определяемым липидным составом тилакоидных мембран, их распределением в латеральном направлении и скоростью латерального транспорта электронов в направлении от ФС2 к ФС1. 4) Квантово-химические расчеты, моделирующие масштабные структурные перестройки внутри цитохромного b6f-комплекса (смещение железосерного кластера белка Риске), сопряженные с "бифуркационными" редокс-превращениями пластохинола внутри хинон-связывающего центра Qо (восстановление (FeS)2 кластера и низкопотенциального гема f). Для проведения ресурсо-затратных структурных расчетов на уровне белковой глобулы предполагается на первом этапе использовать полуэмпирический метод («MOPAC2016») и/или КМ/ММ метод, включенный в пакет программ «Firefly». Дальнейшие уточнения электронной структуры будут выполнены с использование ab initio методов («Orca», «Природа»). 5) Моделирование методом молекулярной динамики взаимодействия пластохинола с цитохромным b6f-комплексом после связывания пластохинола с каталитическими центрами Qo и Qi. Сравнительный анализ альтернативных путей проникновения пластохинола внутрь цитохромного комплекса и его связывания с каталитическими центрами. 6) Теоретическое исследование кинетики и энергетики процессов электронного транспорта и баланса процессов синтеза и гидролиза АТФ в растительной клетке с учетом активации цикла Кальвина-Бенсона и взаимодействия хлоропластов с дыхательной цепью митохондрий и фотодыханием и связанным с ним процессами (см. пункт 1 плана исследований в 2024 году).