ИСТИНА

Целью проекта является изучение молекулярных механизмов работы каспазы-2 и ее белков-партнеров в клетках аденокарциномы шейки матки и аденокарциномы яичника в норме и при генотоксическом стрессе.

Caspase-2 is one of the most important enzymes for apoptosis initiation. This protein triggers programmed cell death in response to genotoxic stress, activation of death receptors, stress of the endoplasmic reticulum and heat shock. It is known that caspase-2 might fulfill the oncosuppressive functions. Thus, hepatocellular and invasive breast carcinomas, gastric carcinomas, glioblastomas and metastatic brain tumors are characterized by reduced level of caspase-2. Moreover, caspase-2 regulates cell ploidy and influences the genome stability. Despite extensive analysis of the enzyme functions, the mechanisms of its activation and the physiological role are not yet entirely clear. This project aims to search for new caspase-2 protein partners. The study of these protein partners and signaling of molecular pathways, in which they are involved, will be performed using mass spectrometry, proteomic and bioinformatics analysis. The level of detected proteins will be analyzed in caspase-2 knockout of ovarian and cervical adenocarcinoma cells, as well as in cells that overexpressed gene of this enzyme. Moreover, we will analyze the level of detected proteins in the tissues of caspase-2 knockout mice obtained in our laboratory. The possibility of direct interaction of caspase-2 with detected protein partners will be tested. The role of these interactions will be investigated in two experimental models, namely, the growing cells and different tissues from caspase-2 knockout mouse. The identification of caspase-2 physiological functions and partners will contribute to understanding of new mechanisms aimed at developing of promising approaches to target therapy, which is the main task of modern medicine.

1) Получить нокаутные по каспазе-2 клеточные линии аденокарциномы шейки матки HeLa с использованием технологии редактирования генома CRISPR/Cas9. Данная задача будет разбита на следующие этапы: А) Оптимизировать условия трансфекции плазмидами, кодирующими систему CRISPR/Cas9, клеток аденокарциномы шейки матки HeLa; Б) Получить устойчивые линии HeLa, нокаутные по гену каспазы-2 и контрольные к процедуре CRISPR/Cas9, из максимально возможного количества клонов, а также популяции тотального сортинга, содержащего не менее 2-5 тысяч клонов; В) Провести анализ специфичности редактирования генома методом CRISPR/Cas9 в отобранных клеточных линиях HeLa; Г) Провести анализ чистоты полученных клеточных линий HeLa на предмет контаминации микоплазмой методом ПЦР. 2) Проанализировать полученные нокаутные по гену каспазы-2 клетки HeLa на чувствительность к обработке ДНК-повреждающими агентами. Данная задача будет разбита на следующие этапы: А) Подбор параметров обработки нокаутных по каспазе-2 клеток HeLa - времени инкубации и концентрацией химиотерапевтических препаратов - с целью выявления условий, в которых запускается каспаза-2-зависимая гибель; Б) Анализ повреждений ДНК в клетках HeLa и Сaov-4 дикого типа и нокаутных по каспазе-2 при генотоксическом стрессе; В) Анализ уровня апоптотической гибели в клетках HeLa и Сaov-4 дикого типа и нокаутных по каспазе-2 методом проточной цитофлуориметрии; Г) Анализ и сравнение эффективности репарации в клетках Caov-4 и HeLa дикого типа и нокаутных по каспазе-2 по уровню накопления/снижения маркера повреждения ДНК - Н2АХ, фосфорилированного по серину 139. 3) Провести масс-спектрометрический анализ и детектировать белки, уровень которых изменялся в зависимости от наличия каспазы-2 в клетке. Данная задача будет разбита на следующие этапы: А) Провести подбор условий для экстракции и лиофилизации белков для масс-спектрометрического анализа; Б) Осуществить пробоподготовку образцов клеток HeLa и Сaov-4 дикого типа и нокаутных по каспазе-2 для проведения масс-спектрометрического анализа; В) Провести масс-спектрометрический анализ белков клеток HeLa и Сaov-4 дикого типа и нокаутных по каспазе-2 минимум в трех повторностях, а также линий, контрольных к процедуре CRISPR/Cas9. 4) Осуществить биоинформатический анализ в программе QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis для выявления молекулярных сигнальных путей, в которых потенциально могут быть задействованы выявленные в ходе масс-спектрометрического анализа и протеомного анализа белки и каспаза-2, а также функциональной связи с ними.