ИСТИНА

Для исследования локализации каспазы-2 будут подобраны условия для выделения ядерной и цитоплазматической фракций клеток. Фракционирование клеток с последующим Вестерн-блот анализом продемонстрирует, в каком компартменте находится каспаза-2 до и после повреждения ДНК. Анализ кинетики изменения локализации позволит определить, в какой момент времени происходит изменение локализации каспазы-2, что опосредованно может подтвердить или опровергнуть участие каспазы-2 в процессах репарации ДНК и/или контроля запуска апоптоза на ранних стадиях. Использование гель-фильтрации с последующим Вестерн-блот анализом фракций позволит определить, ассоциирована ли ядерная каспаза-2 с другими белками в нормальных клетках и обработанных цисплатином клетках. Анализ данных белков позволит глубже понять функции каспазы-2, локализованной в ядре. Исследование изменения активности каспазы-2 в ядерной и цитоплазматической фракциях позволит сделать предварительный вывод о месте активации каспазы-2. Также планируется провести анализ локализации каспазы-2 в клетке с применением метода флуоресцентной конфокальной микроскопии. Предполагается использовать два подхода: 1) трансфицировать раковые клетки генетическим конструктом, содержащим гены каспазы-2 и зеленого флуоресцирующего белка, и проводить наблюдение как фиксированных раковых клеток линии Caov-4 или HeLa, так и в режиме реального времени, при обработке их цисплатином; 2) получить серию окрашенных флуоресцентными антителами препаратов клеток, обработанных цисплатином в течение разных временных интервалов. Данный подход позволит определить, изменяется ли локализация каспазы-2 в клетках при повреждении ДНК, и как это влияет на развитие процесса апоптоза.