ИСТИНА

Поиск низкомолекулярных добавок, которые могут усиливать антибактериальные свойства лизоцима, в частности влиять на характер сорбции фермента на живых бактериях Использование тест-систем на основе живых клеток для изучения механизма действия внешних воздействий Изучение возможности получения сополимера анилина и 3-аминобензойной кислоты в глубоком эвтектическом растворителе с использованием фермента лакказы. Исследование и моделирование взаимодействия маннозных рецепторов макрофагов (CD 206) с углеводсодержащими лигандами для создания но вых классов антибактериальных препаратов с таргетной доставкой Изучение комплексообразования бактериолитического фермента лизоцима с блок-сополимерами полиглутаминовой кислоты и полиэтиленгликоля на поверхности раздела фаз (вода-воздух) и в объеме раствора; оценить влияние состава блок-сополимеров на физико-химические параметры взаимодействия. Синтез и характеристика конъюгатов на основе наночастиц магнетит-золото для тераностики онкологических заболеваний Целью исследования стало совершенствование дизайна конъюгата аторвастатина и N-ацетилгалактозамина для получения препарата с высокой растворимостью в воде, способного селективно проникать в гепатоциты и после гидролиза оказывать требуемый биологический эффект. Разработка управляемых с помощью внешнего низкочастотного магнитного поля биокаталитических систем на основе фенилацетонмонооксигеназы, иммобилизованной на магнитных наночастицах Изучение выхода β-лактамазы из перимплазматического пространства клеток E.coli под действием низкочастотного переменного магнитного поля в присутствии анизотропных магнитных наночастиц (МНЧ) на основе оксидов железа. В рамках комплексных исследований по теме «Изучение механизмов антибиотикорезистентности бактерий, обусловленной продукцией бета-лактамаз, и поиск подходов к ее преодолению» были сформулированы следующие цели: 1) изучение структурных особенностей бета-лактамаз разных молекулярных классов и анализ структур их комплексов с ингибиторами; 2) репозиционирование известных лекарственных препаратов для ингибирования бета-лактамаз; 3) разработка новых биохимических и молекулярно-генетических методов контроля экспрессирующихся бета-лактамаз и кодирующих их генов. Поиск подходов к повышению чувствительности латерального проточного иммуноанализа. Применение сухих образцов биологических жидкостей для решения задач в биологии, ветеринарии и медицине. Изучение возможности генерации ГКР сигналов под воздействием локального облучения лазером в системах, содержащих наночастицы металлов, ассоциированных с термочувствительными полимерами. Выявление новых особенностей поведения внеклеточных везикул. Разработка тандемной ГКР технологии для оценки степени посттрансляционной модификации белков. Использование тест-систем на основе живых клеток для изучения мКеханизма действия внешних воздействий Поиск н/м регуляторов активности системы гемостаза для биомедицинских целей. Повышение тромболитической эффективности и стабильности стрептокиназы (SK). Выяснение возможного механизма вовлечения системы плазминоген/плазмин в онкологический процесс. Анализ потенциальной диагностической способности циркулирующих IgG к плазминогену в крови мышей с раком молочной железы (РМЖ). Изучение кинетических параметров разложения нитроцеллюлозосодержащих осадков сточных вод в анаэробных условиях Определение возможностей кальций-фосфатных (СаР) частиц, покрытых хитозаном, а также хитозановых частиц как потенциальных транспортных средств для доставки лекарственных соединений в глаз, определение возможностей спектров гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) для идентификации форм ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), продуцируемого различными клетками организма, оценка связывания меченых флуоресцентной меткой ингибитора АПФ и лизоцима с АПФ. Исследование гибридных микрокристаллов ватерита с биополимерами и их модификациями, а также перспектив их использования для доставки биологически активных соединений. Получить новые микроорганизмы продуценты ферментных препаратов, обладающие повышенной осахаривающей способностью для чего клонировать и получить экспрессию двух форм ксилоглюканазы ксилоглюканазы из гриба Trichoderma reesei (TrXeg74A) в реципиентном штамме гриба Penicillium verruculosum B1-537, являющимся высокоэффективным продуцентом целлюлаз, а также изучены свойства рекомбинантных ксилогюканаз после их выделения и очистки. Определение возможностей кальций-фосфатных (СаР) частиц, покрытых хитозаном, и хитозановых частиц как потенциального транспортного средства для доставки лекарственных соединений в глаз, определение возможностей спектров гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) для идентификации форм ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), продуцируемого различными клетками организма, определение термодинамических констант взаимодействия АПФ с флуоресцентно меченными ингибитором АПФ и лизоцимом. Основными целями работы в 2022 г. стали: - Исследование возможностей формирования синтетических (искусственных) микробных консорциумов и их применения в иммобилизованном виде для решения актуальных фундаментальных и прикладных задач химической технологии, экологии и медицины. - Исследование возможностей метаногенной биотрансформации смешанных субстратов в виде отходов возобновляемого сырья и серосодержащих отходов нефтяной промышленности после проведения химической окислительной десульфуризации нефти и ее фракций. - Получение композиционных волокнистых материалов с антибактериальными свойствами.- Изучение возможностей оптимизации функционирования биокатализаторов, используемых при производстве коммерчески значимых полисахаридов.- Изучение подходов к детоксификации микотоксинов с применением биокатализаторов. - Обобщение информации относительно возможностей применения биолюминесцентного метода анализа концентраций аденозинтрифосфата (АТФ) для расширения спектров возможного применения метода при разработке новых процессов и подходов. - Предложение и изучение возможностей применения окислительно-восстановительных производных гуминовых кислот, персульфата калия, фермента гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы и бацитрацина в качестве супрессоров метаногенеза. - Разработка новых подходов к длительному хранению практически значимых фототрофных микроорганизмов (зеленых и красных микроводорослей, диатомей и цианобактерий). - Разработка иммобилизованного искусственного консорциума на основе микроорганизмов, принадлежащих к грамположительным и грамотрицательным бактериальным клеткам, способных совместно осуществлять быструю и эффективную деградацию различных фосфорорганических пестицидов.

Lysozyme is increasingly being considered as an alternative to antibiotics in the fight against resistant bacteria. New information has also emerged about the non-enzymatic role of lysozyme in regulating the functioning of the immune system. In addition, it has recently been found that the antibacterial activity of lysozyme against Gram-negative bacteria is significantly enhanced in the presence of glycine and charged amino acids,but the molecular reason for this effect remains unclear. In this study, we investigated the physicochemical parameters of sorption of lysozyme on living cells in the presence of glycine andcharged amino acids. The relationship between the increase in productive sorption and the increase in the bacteriolytic activity of the enzyme was revealed. All experiments were carried out at pH 8.5 and a temperature of 37°C. The substrate was a suspension of E. coli cells. The additives were Gly, Glu, Asp, Lys, His, and Arg. The increase in the rate of bacterial lysis in the presenceof additives ranged from 1.4 to 1.9 times. The desorption constant of lysozyme on bacterial cells in the presence of additives decreased by 1.4–1.7 times, which indicates a stronger binding.The greatest effects were observed for Gly and Arg. Understanding the molecular nature of the enhancement of the antibacterialaction of lysozyme in the presence of additives may help in the development of new highly-effective antibacterial drugs. DES betaine-glycerol (molar ratio 1:1) was used as a co-solvent for efficient laccase-catalyzed template copolymerization of aniline and 3-aminobenzoic acid. Enzymatic reactions conducted in DES/buffer mixtures met the requirements of sustainable chemistry. Sodium polystyrenesulfonate (PSS) was used as a template. The synthesized copolymer was characterized by UV-Vis and FTIR spectroscopy, atomic force microscopy, and cyclic voltammetry. It has been shown that the copolymer exhibits significantly higher antimicrobial activity against Escherichia coli and Staphylcocus aureus compared to homopolymers and can be used to create antimicrobial film coatings. As part of the study, it is planned to develop a method for measuring the local biomechanical properties of living cells under the influence of various effectors that affect the structural components of the cytoskeleton Macrophages play a central role in the immune response in a number of diseases, including cancer, autoimmune, infectious, fibrotic, and a number of others. Accordingly, targeting macrophages could open up new possibilities for influencing the biochemical processes of which they are the driver or direct participant. On the surface of activated macrophages (as well as dendritic cells, liver endothelial cells, and some skin cells), a large number of mannose receptors (CD206) are expressed, mediating endocytosis by a clathrin-dependent mechanism. One of the main functions of mannose receptors is to recognize patterns-the terminal residues of mannose, N-acetylglucosamine, and fucose are present on the glycan chains of the surface proteins of certain pathogenic microorganisms, such as C. albicans, Pneumocystis carinii, and Leishmania donovani. In addition, mannose receptors are involved in the presentation of antigens, resolution of the inflammatory response, and clearance of certain hormones. The extracellular part of the mannose receptor consists of 8 consecutive carbohydrate-recognizing type C (CRD) domains connected by proline-enriched linkers, a type II fibronectin domain, and a cysteine-enriched domain. The extracellular part of CD206 is assumed to exist in at least two spatial conformations – linear and U-shaped, which differ in selectivity to ligands. The transition from one conformation to another is presumably regulated by pH, which is consistent with the dissociation of the bound ligand in the acidified endosome microenvironment. The degree of homology between individual CRD domains is low, and is only about 30%. Each of the domains separately shows low affinity to mannose and other CD206 ligands – it is assumed that high affinity binding occurs only when several CRD domains are clustered. In general, the features of the interaction of the mannose receptor with its ligands are not fully understood. Based on the above, this paper plans to: To conduct computer simulation of ligand-receptor interactions of CD206 (and concanavalin A as a model lectin) with various mannose-containing ligands, including mannoses, dimannoses, trimannoside and its derivatives, as well as mannosylated cyclodextrins and chitosans, with varying molecular weight, degree of modification, presence and type of spacers. The methods of molecular dynamics will be used, and the neural network will be trained using the literature and experimental data. In our group, there is a groundwork for modeling lectin-carbohydrate interactions by the docking method. The use of an artificial neural network to predict the specificity of receptor-ligand interactions will significantly save time and computer power for such predictions. Given the complex structure of mannose receptors, their interaction with carbohydrate ligands will be studied by spectral methods and isothermal titration calorimetry, using the example of model concanavalin A. This will allow us to refine and correct the computer model of this interaction, provide additional data for training the neural network, and increase the accuracy of the predictions obtained. Further, the results obtained will be extrapolated to the interaction of CD206 with various carbohydrate ligands, with the hypothesis testing on macrophages expressing this receptor. To do this, macrophages obtained by directed differentiation of THP-1 cells (human promonocytes) will be incubated with synthesized carbohydrate samples. They will be used by flow cytometry and confocal microscopy. When moving from model systems to experiments on cells, we will be able to study the effect of conformational transitions and CD206 clustering during ligand interaction and endocytosis – which is still an insufficiently studied area. The results obtained will allow us to deepen the fundamental understanding of the process of binding and endocytosis of carbohydrate-containing ligands by macrophages. On the basis of the obtained data, a targeted search and study of CD206 ligands will be carried out, and on their basis, systems will be created for the delivery of substances of various nature to macrophages (primarily antibacterial agents of the latest generation) that can affect both the macrophages themselves and the biochemical processes in which they participate. In the future, potential applications of the results obtained in the Project may include, but are not limited to, the following: Delivery of antiviral or antibacterial drugs to the centers of latent infection for more effective treatment of infectious diseases such as tuberculosis, HIV, Ebola. Delivery of targeted drugs for repolarization of immunosuppressive tumor-associated macrophages (M2) to proinflammatory ones (M1) in the treatment of various oncological diseases. As part of the study, it is planned to develop a technique for creating oxygen-sensitive nanosensors to assess the degree of hypoxia inside 3D cellular structures and tissues of living organisms. This technique will allow to determine the level of hypoxia inside the spheroids, inside the tumor tissues, to establish the relationship between the size of the spheroid and the level of hypoxia, and also to find out how different tumors differ from each other in terms of oxygen content. By means of tensiometry it has been shown that lysozyme interacts with the polyethylene glycol-poly-L-glutamic acid block-copolymers at the water-air interface. The surface activity of the block-copolymers at the water-air interface depends on their composition. Interaction with lysozyme influences on the surface activity of the block-copolymers. Complexes of lysozyme with the block copolymers were also investigated in the bulk of the solution. By means of spectroscopic methods and turbidimetry it has been shown that lysozyme maintains its structure and activity. By means of tensiometry it has been shown that lysozyme interacts with the polyethylene glycol-poly-L-glutamic acid block-copolymers at the water-air interface. The surface activity of the block-copolymers at the water-air interface depends on their composition. Interaction with lysozyme influences on the surface activity of the block-copolymers. Complexes of lysozyme with the block copolymers were also investigated in the bulk of the solution. By means of spectroscopic methods and turbidimetry it has been shown that lysozyme maintains its structure and activity. The aim of this semester was the analysis and selection of a new FRET pair of chromophores, as well as the synthesis of nanoparticle stabilization and immobilization of a photosensitizing agent at different concentrations on the magnetic surface of magnetite-gold nanoparticles. As a result of the work, it was revealed that the photosensitizer is immobilized due to chemical conjugation with a stabilized magnetite surface (8-11 nm), where stabilization is achieved in several stages: the magnetite surface binds to DOPAC (3,4-dihydroxyphenylacetic acid) due to a covalent bond with further activation carbodiimide (EDC/NHS) method is further stabilized by PEG (polyethylene glycol with COOH group) due to the covalent bond, followed by activation of the carboxyl group by the carbodiimide (EDC/NHS) method and then with a photosensitizer. A derivative of the Cy5 fluorescent dye containing a disulfide bond is immobilized on the gold surface (3-5 nm) due to the thiol group, namely, using the NHS ester of the Cy5 fluorescent dye with cystamine dihydrochloride to form a disulfide bond and further “crosslinking” with the surface gold. The total size of magnetite-gold nanoparticles of the "dumbbell" type has a size of 12-15 nm, due to the size and shape of the latter; it is possible to level the energy transfer between FF and PS, as well as the possibility of joint use of detection and activation of singlet oxygen to further achieve a therapeutic effect. It was found that the maximum effective amount of the photosensitizing agent is 15 μl (on the basis that there is one PS molecule per one nm2) per magnetite surface in NPs (the size of the magnetic part is 10 nm). Because of PS immobilization on the magnetic surface of NPs, the study of the optical properties showed effective PS absorption in a similar range and wavelengths corresponding to PS absorption in solution. Statins are effective 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMG-R) inhibitors that are succesfully used for cardiovascular diseases treament. Statins’ adverse effects are generally attributed to poor bioavailability and hepatoselectivity which are closely related to their high lipophilicity. Targeted delivery of statins to the liver is concedered to be a way to reduce undesired side effects. Herein we report on synthesis and evaluation of atorvastatin conjugates targeting the galactose-specific hepatic acialoglycoprotein receptor (ASGPR). The prepared conjugates showed greater water solubility compared to unmodified atorvastatin. All of the synthesized compounds demonstrated potent binding to ASGPR with submicromolar dissociation constant values (KD). The conjugates with an amide bond connecting atorvastatin and the targeting moiety displayed the optimal stability under model conditions, as they underwent hydrolysis only when incubated with the intracellular protease. The hydrolysis products inhibited effectively HMG-R activity. The results suggest that the designed amide-based compounds have the potential to be further developed as orally administrated prodrugs of atorvastatin. A technique for the immobilization of the biotechnologically significant enzyme phenylacetone monooxygenase on the hybrid magnetic nanoparticles (MNPs) surface has been developed and optimized. A method was proposed for restoring the enzymatic activity of completely inactivated phenylacetone monooxygenase immobilized on the surface of hybrid MNPs using a magnetic field with a frequency of 50 Hz, with a twofold increase in activity compared to the native enzyme. In the course of the work, rod-shaped magnetic nanoparticles (MNPs) based on iron oxides were synthesized. The obtained MNPs were modified with dopamine and characterized by Mössbaer spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM) and nanoparticle tracking analysis (NTA). The resulting particles are rod-like MNPs, which include magnetite (20%) and akaganeite (80%). The particle size was 56±13 nm long and 13±3 nm wide. The hydrodynamic radius of the obtained particles was 78 ± 10 nm. The synthesized MNPs were used to destabilize the outer membrane of E.coli cells under the action of a low-frequency alternating magnetic field (LF MF) in order to enhance the output of the periplasmic protein β-lactamase. The β-lactamase leakage from the periplasm was evaluated spectrophotometrically by measuring its activity in the supernatant using CENTA chromogenic substrate. The application of LF MF (50 Hz, 68.5 mTs) for 20 minutes at room temperature to a suspension of E.coli cells in the presence of rod-like MNPs led to an increase in the protein leakage from the periplasm by more than 4 times relative to the control. The control was the same sample in the absence of LF MF. Within the framework of research on the topic "Studying the mechanisms of antibiotic resistance of bacteria due to the production of beta-lactamases, and the search for approaches overcoming it", the following goals were formulated: 1) study of the structural features of beta-lactamases of different molecular classes and analysis of the structures of their complexes with inhibitors; 2) repositioning of known drugs for inhibiting metallo-beta-lactamases; 3) development of new biochemical and molecular genetic methods for controlling expressing beta-lactamases. The search for new beta-lactamase inhibitors for their use in combination with beta-lactams and the development of new methods of biochemical and molecular genetic analysis of expressed beta-lactamases and their coding genes is highly relevant. The following objectives were investigated: study of the structures of serine beta-lactamase complexes with an inhibitor, repositioning of unithiol to inhibit metal-beta-lactamases: development of a method for simultaneous quantitative determination of specific mRNA beta-lactamases of different molecular classes on biochips: preparation of highly purified serine beta-lactamase of the CTX-M type, immunization of rabbits, preparation of polyclonal antibodies specific to beta-lactamase, characterization of antibodies from the point of view of further use in the biochemical analysis of expressing beta-lactamases. Search for approaches to increase the sensitivity of lateral flow immunoassay. The use of dry samples of biological fluids for solving problems in biology, veterinary and human medicine. Biological methods, in our opinion, look more attractive in comparison with the physicochemical methods of utilization of nitrocellulose-containing sewage sediments (NCCSS), both in terms of environmental safety and cost effectiveness. Nevertheless, in the case of highly concentrated wastes with an NC content of up to 70–80%, aerobic and microaerophilic microorganisms are not able to quickly and efficiently decompose cellulose nitrates in situ without preliminary destructive treatment of the sediments. To avoid the difficult step of waste treatment, we decided to check the possibility to decomposing highly concentrated NC sediment by cellulolytic active anaerobic microbial associations in bioreactors with optimal conditions for microorganisms, along with evaluation of kinetic parameters of degradation. Investigation of the perspectives of the use of calcium phosphate particles covered with chitosan/ as well as chitosan particles, as potential carriers of the drugs to the eye. The perspectives of the use of giant Raman scattering for identification of angiotensin-converting enzyme produced by different cell types; determination of the thermodynamic constants of the interaction of ACE with the fluorescently labeled inhibitor and lysozyme. The study of the possibilities of forming synthetic (artificial) microbial consortia and their use in an immobilized form to solve urgent fundamental and applied problems of chemical technology, ecology and medicine. Investigation of the possibilities of methanogenic biotransformation of mixed substrates in the form of waste of renewable raw materials and sulfur-containing waste of the oil industry after chemical oxidative desulfurization of oil and its fractions. Preparation of composite fibrous materials with antibacterial properties was also one of the tasks for this period of investigations. The study of possibilities of optimizing the functioning of biocatalysts used in the production of commercially significant polysaccharides was conducted. Study of approaches to detoxification of mycotoxins using biocatalysts was developed. Generalization of information on the possibilities of using the bioluminescent method of analysis of concentrations of adenosine triphosphate to extend the spectra of possible application of the method in the development of new processes and approaches was done. To propose and study the possibilities of using redox derivatives of humic acids, potassium persulfate, the enzyme hexahistidine-containing organophosphate hydrolase and bacitracin were combined and applied as suppressors of methanogenesis. Development of new approaches to long-term storage of practically significant phototrophic microorganisms (green and red microalgae, diatoms and cyanobacteria) was realized. Development of an immobilized artificial consortium based on microorganisms belonging to gram-positive and gram-negative bacterial cells capable of jointly carrying out rapid and effective degradation of various organophosphorus pesticides was undertaken.

Планировалось измерить физико-химические параметры адсорбции лизоцима на поверхности живых бактериальных клеток Escherichia coli, а именно нужно было уточнить время достижения сорбционного равновесия, получить равновесные константы десорбции фермента, максимальную сорбционную ёмкость по лизоциму на поверхности бактериальной клетки. Адсорбционные параметры необходимо было проверить в присутствии активирующих добавок, а именно свободных заряженных аминокислот и глицина. Сравнение эффективности и механизма действия биологически активных соединений, обладающих цитотоксичностью, в том числе их модифицированных форм и наночастиц на их основе, на живые клетки и органеллы. Проведение матричного синтеза сополимера анилина и 3-аминобензойной кислоты в глубоком эвтектическом растворителе (ГЭР) на основе бетаина и глицерина или в смеси буфер/ГЭР. Оптимизация реакционной смеси. Характеризация полученных продуктов с помощью УФ-видимой и ИК-Фурье спектроскопии, вольтамперометрии и атомно-силовой микроскопии. Сравнительное изучение антимикробных свойств. Планируется осуществить разработку наноразмерных сенсоров для определения концентрации кислорода, осуществить калибровку в растворах с различным содержанием кислорода. В рамках работы также планируется оценить чувствительность и селективность разработанных наносенсоров, проверить стабильность их работы в условиях in vitro и in vivo. Провести компьютерное моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий CD206 (и конканавалина А в качестве модельного лектина) с различными маннозосодержащими лигандами, включая маннозы, диманнозы, триманнозид и его производные, а также маннозилированные циклодекстрины и хитозаны, с варьированием молекулярной массы, степени модификации, наличием и типом спейсеров. Будут использоваться методы молекулярной динамики, а также, с использование литературных и экспериментальных данных будет произведено обучение нейросети. В нашей группе имеется задел по моделированию лектин-углеводных взаимодействий методом докинга. Применение искусственной нейросети для предсказания специфичности рецептор-лигандных взаимодействий позволит значительно сэкономить время и компьютерные мощности для таких предсказаний. Учитывая сложное строение маннозных рецепторов, их взаимодействие с углеводными лигандами будет исследовано спектральными методами и методом изотермической титрующей калориметрии, на примере модельного конканавалина А. Это позволит уточнить и скорректировать компьютерную модель данного взаимодействия, даст дополнительные данные для обучения нейросети и повысит точность получаемых предсказаний. Полученные результаты будут экстраполированы на взаимодействие CD206 с различными углеводными лигандами, с проверкой гипотез на макрофагах, экспрессирующих данный рецептор. Для этого макрофаги, полученные путем направленной дифференцировки клеток линии THP-1 (промоноциты человека), будут инкубироваться с синтезированными углеводными образцами. Будут использованы методами проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. При переходе от модельных систем к экспериментам на клетках мы получим возможность исследовать эффект конформационных переходов и кластеризацию CD206 при взаимодействии и эндоцитозе лигандов – что до сих пор является недостаточно изученной областью. Полученные результаты позволят углубить фундаментальное понимание процесса связывания и эндоцитоза углевод-содержащих лигандов макрофагами. На основе полученных данных будет выполнен направленный поиск и исследование лигандов CD206 и на их основе будут созданы системы доставки в макрофаги субстанций различной природы (в первую очередь антибактериальных агентов последнего поколения), способных влиять как на сами макрофаги, так и на биохимические процессы, в которых они участвуют. В перспективе потенциальные области применения полученных результатов могут включать в себя, но не ограничиваться, следующими: a. Доставка антивирусных или противобактериальных препаратов в очаги латентной инфекции для более эффективной терапии таких инфекционных заболеваний как, например, туберкулёз, ВИЧ, Эбола. b. Доставка таргетных препаратов для реполяризации иммуносупрессорных опухоль-ассоциированных макрофагов (М2) в провоспалительные (М1) при лечении онкологических заболеваний. Определение закономерностей связывания лигандов рецепторами и выявление высокоаффинных взаимодействий – ключевой шаг для создания нацеленного на маннозные рецепторы макрофагов носителя лекарств и соответственно, перспективная стратегия лечения заболеваний дыхательных путей, в том числе туберкулёза. Для решения поставленной цели нами используются компьютерные методы (молекулярная динамика и искусственная нейросеть), а также спектральные и флуоресцентные методы. Для получения результатов планируется выполнить следующие шаги: Отработка методик молекулярной динамики (Amber20) для получения релевантных значений энергий комплексообразования рецептор (маннозный рецептор CD206 и модельный лектин ConA) - лиганд и проведение моделирования серии маннозных лигандов и маннозилированных носителей на основе циклодекстрина и хитозана. Применение искусственной нейросети для предсказания специфичности рецептор-лигандных взаимодействий. В перспективе: обучение нейросети исследуемыми комплексами для улучшения точности расчётов. С помощью указанных компьютерных методов будут определены параметры связывания домена маннозного рецептора CD206, его модели конканавалина А с маннозосодержащими лигандами: моно- и олигосахаридами, а также маннозилированными носителями (циклодекстринами и хитозанами). Будет проведено сравнение закономерностей связывания углеводов CD206 и ConA. С помощью спектральных и флуоресцентных методов будет исследовано комплексообразование конканавалина А с маннозилированными циклодекстринами и хитозанами с варьируемыми параметрами. На основе моделирования и экспериментальных данных будет выполнен поиск и отбор высокоспецифичных к маннозным рецепторам макрофагов носителей лекарств. Отработка методик синтеза и проведение синтеза серии маннозилированных носителей различной молекулярной архитектуры (на основе мономерных и полимерных циклодекстринами и хитозанов). Характеризация полученных образцов физико-химическими методами. Получение серии комплексов включения антибактериальных препаратов (комбинации фторхинолона и его "усилителей") с носителями на основе маннозилированных производных циклодекстрина (мономерных и полимерных) и сополимеров ЦД-хитозан. Определение параметров связывания лекарственных субстанций с носителем. Изучение взаимодействия полученных маннозилированных образцов с целевыми клетками макрофагов несущих CD206 с помощью флуоресцентной проточной цитометрии и методом конфокальной микроскопии. Планируется осуществить разработку наноразмерных сенсоров для определения концентрации кислорода, осуществить калибровку в растворах с различным содержанием кислорода. В рамках работы также планируется оценить чувствительность и селективность разработанных наносенсоров, проверить стабильность их работы в условиях in vitro и in vivo. Получение данных о поверхностной активности, структуре и антимикробных свойствах комплексов лизоцима и блок-сополимеров полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты разного состава (PEG114PGLU10, PEG114PGLU50, PEG114PGLU100). Получение стабильных наночастиц магнетит-золото, на золотой поверхности которых иммобилизован флоурофор, на магнитной - фотосенсибилизатор. Размер наночастиц не должен превышать 50 нм. Гибридные наночастицы магнетит-золото должны быть стабилизированы биосовместимым полимером. Молекулы флуорофора должны быть иммобилизованы на поверхности золота (ковалентная "сшивка"), а молекулы фотосенсибилизатора на поверхности магнетита (физико-химическое взаимодействие), интервал загрузки 5-50%. Будут получены конъюгаты аторвастатина с увеличенной гидрофильностью и повышенной гепатоселективностью. Конъюгаты будут охарактеризованы, будет исследована их способность ингибировать ГМГ-КоА редуктазу. Оптимизация методики иммобилизации фенилацетонмонооксигеназы на поверхности гибридных магнитных наночастиц. Изменение активности фенилацетонмонооксигеназы, иммобилизованной на поверхности гибридных магнитных наночастиц (МНЧ), под действием низкочастотного магнитного поля. Синтез стержневидных МНЧ, модифицированных дофамином и их характеризация. Поиск оптимальных условий для дестабилизации внешней мембраны E.coli с помощью МНЧ и НЧ ПМП. Будет разработана методика одновременного количественного определения специфичных мРНК бета-лактамаз разных молекулярных классов на биочипах. В качестве объектов будут использованы бета-лактамазы четырех клинически значимых типов: NDM, OXA-48, CTX-M, ТЕМ. Будут определены аналитические характеристики метода определения. Методика будет применена для определения экспрессии генов бета-лактамаз у клинических штаммов бактерий, устойчивых к бета-лактамным антибиотикам. Будут наработаны препаративные количества бета-лактамазы СТХ-М типа, проведена иммунозация кроликов, получены и охарактеризованы поликлональные антитела, специфичные к данной бета-лактамазе. Повышение чувствительности латерального проточного иммуноанализа за счет использования агломератов наночастиц золота для единой концентрации метки на примере конкурентной и сэндвич схем анализа. Использование сухих образцов биологических жидкостей для проведения оценки состояния домашних животных в свободных условиях содержания. Сравнение эффективности и механизма действия биологически активных соединений, обладающих цитотоксичностью, в том числе их модифицированных форм и наночастиц на их основе, на живые клетки и органеллы. Планируются: Определить степень деградации, скорость разложения и период полураспада НЦ при помощи анаэробных микроорганизмов в периодических биореакторах с оптимальными условиями для их роста в различных температурных режимах. Исследование кинетики высвобождения фермента супероксиддисмутазы1 и ингибитора АПФ эналаприлата из покрытых 5 кДа хитозаном кальций-фосфатных частиц. Проведение экспериментов in vivo по изучению влияния частиц с включенными препаратами на внутриглазное давление (ВГД) здоровых кроликов. Изучение кинетики десорбции эналаприлата из частиц на основе низкомолекулярного хитозана со средней молекулярной массой 5 кДа и гликоль-хитозана с молекулярной массой 72 кДа. Определение влияния включения эналаприлата в хитозановые частицы на «время жизни» эналаприлата в составе слезной жидкости глаз кроликов. Изучение влияния дополнительно введенного АПФ из легких и АПФ из семенной жидкости на ГКР спектры АПФ-содержащей фракции плазмы крови. Анализ возможности проведения количественного анализа АПФ из разных источников в цитратной плазме крови путем построения калибровочной зависимости. Исследование кинетики гидролиза эфиров L-тирозина под действием карбоксилэстеразы методом изотермической титрующей калориметрии. Получение ковалентно иммобилизованных белков (лизоцим из разных источников, альбумин из разных источников, иммуноглобулинов) для определения термодинамических констант их взаимодействия с АПФ. Выявление видовых отличий, при взаимодействии белков и АПФ из разных источников. Изучить и описать различные подходы к формированию иммобилизованного в криогеле поливинилового спирта искусственного консорциума и его применение в анаэробном метаногенном биореакторе с целью биотрансформации органических сульфонов параллельно с накоплением биогаза. Исследовать возможности метаногенной биотрансформации серосодержащих отходов, полученных после химического окислительного обессеривания неочищенного вакуумного газойля, прямогонной бензиновой фракции (нафта), газового конденсата, прямогонной дизельной фракции в сочетании с различными отходами (гидролизаты куриного помета, биомасса Chlorella vulgaris и др.). Получить новые композиционные волокнистые материалы с антибактериальными свойствами. На примере клеток Escherichia coli и Bacillus subtilis отобрать композиты с наилучшей антибактерисльной активностью. Изучить и описать основные подходы, обеспечивающие оптимизацию функционирования биокатализаторов – продуцентов полисахаридов. Изучить процесс гидролиза ряда микотоксинов (патулина, дезоксиниваленола, зеараленона и стеригматоцистина) с применением фермента His6-OPH. Исследовать возможные комбинации His6-OPH с неорганическими сорбентами, обработанными низкотемпературной плазмой, ферментно-полиэлектролитные комплексы поли(глутаминовой кислоты) с His6-OPH и другим ферментативным деструктором микотоксинов (термолизин) с точки зрения возможного применения для модификации волокнистых материалов. Разработать новые решения для ферментативной деструкции микотоксинов с применением методов компьютерного моделирования и экспериментальной апробации в направлении детоксификации контаминированных микотоксинами кормов. Проанализировать и систематизировать основные направления применения биолюминесцентного метода анализа АТФ. Апробировать АТФ-метрию в новых направлениях исследований. Изучить возможности применения и эффективность действия супрессоров метаногенеза, таких как окислительно-восстановительные производные гуминовых кислот, персульфат калия фермент гексагистидинсодержащая огранофосфатгидролаза с высокой лактоназной активностью и полипептидный противомикробный препарат бацитрацин. Разработать и апробировать подходы, обеспечивающие одновременную криоиммобилизацию, криоконсервацию и длительное хранение клеток различных фототрофных микроорганизмов (зеленых и красных микроводорослей, диатомей и цианобактерий). Разработать новый иммобилизованный искусственный консорциум на основе микроорганизмов, принадлежащих к грамположительным и грамотрицательным бактериальным клеткам, способных совместно осуществлять быструю и эффективную деградацию различных фосфорорганических пестицидов: параоксон, паратион, метилпаратион, диазинон, хлорпирифос, малатион, диметоат и деметон-S-метил.

В 2021 году были продолжены фундаментальные исследования с целью повышения качества выпускаемой продукции и совершенствование процессов производства. Исследования направлены на использование ферментов в медицине, фармакологии. Ряд исследований выполнен впервые. Наиболее практически значимые - создание новых отечественных лекарственных средств, биосенсоров различной направленности, в промышленных – новых видов возобновляемого растит. сырья, характерного для РФ. Научный задел: разработаны новые подходы для измерения физ.-хим. параметров сорбции фермента лизоцима на живых бактериальных клетках; созданы биолюминесцентные тест-системы на основе живых клеток, продуцирующие люциферазу светляков, разработаны экспрессные методы определения АТФ внутри и вне клеток; разработан уникальный метод, позволяющий производить коррелятивное картирование топографии, локальных механических свойств и конфонкальной визуализации методом СИПМ, на использовании сил отталкивания между острием нанокапилляра и поверхностю мембраны живой клетки. Был разработан платинированный углеродный наноэлектрод для обнаружения препаратов платины в биол.моделях. Разработан подход к управлению структурой и свойствами биомакромолекул, иммобилизованных на поверхности магнитных наночастиц. Научный задел по изучению механизмов антибиотикорезистентности бактерий. Рассмотрены новые технические методы биоремедиации территорий без разрушения сложившейся экосистемы. Исследована метаногенная биотрансформация серосодержащих отходов, образующихся при окислительной сероочистке в нефтяной промышленности. Это служит переработке сложных смесей крупномасштабных отходов.путем разработки биокатализаторов. Впервые были получены ГКР-спектры АПФ легких, адсорбированного на серебряной подложке. Функционирование биокатализаторов–продуцентов полисахаридов, можно оптимизировать путем основных подходов синтетической биологии - сочетанием нано- и микробиокатализаторов и их иммобилизацией.

По направлению «Изучение механизмов антибиотикорезистентности бактерий, обусловленной продукцией бета-лактамаз, и поиск подходов к ее преодолению» научные исследования проводились по трем основным направлениям: 1) изучение структурных особенностей бета-лактамаз разных молекулярных классов и анализ структур их комплексов с ингибиторами; 2) репозиционирование известных лекарственных препаратов для ингибирования бета-лактамаз; 3) разработка новых биохимических и молекулярно-генетических методов контроля бета-лактамаз и кодирующих их генов. В рамках данных направлений получены следующие результаты: 1) Впервые получены и проанализированы новые кристаллические структуры нативной бета-лактамазы TEM-171 и двух ее комплексов с широко используемым ингибитором тазобактамом; различие в структурах двух комплексов состоит в конформации ингибитора в активном центре фермента; структуры комплексов соответствуют разным стадиям деацилирования ацил-ферментного комплекса; 2) установлена ингибирующая активность известного детоксицирующего антидота 2,3-димеркаптопропан-1-сульфоната (унитиола) против металло-β-лактамаз двух типов; показано, что унитиол действует как конкурентный ингибитор гидролиза меропенема рекомбинантной металло-β-лактамазой NDM-1; показано, что унитиол ингибирует природные металло-β-лактамазы NDM-1 и VIM-2, продуцируемые резистентными к карбапенемам штаммами К. pneumonia и E. сoli; 3) разработан метод количественного определения специфичных мРНК бета-лактамаз разных молекулярных классов на биочипах и определены его аналитические характеристики (пределы обнаружения специфичных мРНК бета-лактамаз составили от 5.0 до 7.0 пМ); диапазоны определяемых концентраций мРНК оказались близкими для всех типов исследованных генов БЛ, что важно для их одновременного определения; разработана системы выделения и очистки рекомбинантной сериновой бета-лактамазы СТХ-М-116 молекулярного класса А; получен высокоочищенный препарат рекомбинантного фермента для иммунизации кроликов; получены и охарактеризованы специфические к бета-лактамазе СТХ-М типа поликлональные антитела (титр 1:100000); показана возможность иммуноферментного определения бета-лактамазы СТХ-М типа в буферном растворе с использованием хромогенного субстрата CENTA. Выявлена связь между повышением продуктивной сорбции лизоцима на живыых бактериях Escherichia coli и повышением бактериолитической активности фермента против данных бактерий. Эксперименты проводились при рН 8,5 и температуре 37°С. Субстратом служила суспензия клеток E. coli. В качестве добавок использовали Gly, Glu, Asp, Lys, His и Arg. Увеличение скорости лизиса бактерий в присутствии добавок составило от 1,4 до 1,9 раза. Сорбционное равновесие устанавливается за время менее 2-3 минут. Константа десорбции лизоцима на бактериальных клетках в присутствии добавок снижалась в 1,4–1,7 раза, что свидетельствует о более прочном связывании. Наибольшие эффекты наблюдались для добавок свободных аминокислот Gly и Arg. Понимание молекулярной природы усиления антибактериального действия лизоцима в присутствии добавок может помочь в разработке новых высокоэффективных антибактериальных препаратов. Впервые биолюминесцетные клетки E.coli, продуцирующие рекомбинантную термостабильную люциферазу светляков, позволяющей проводить исследования при повышенных температурах, использованы в качестве тест-систем для изучения влияния внешних стимулов на живые клетки. Разработан метод селективного определения активности люциферазы и концентрации АТФ вне и внутри клеток. Показано, что люцифераза является чувствительным белковым маркером на действие мембран-активных агентов, а АТФ – основным показателем жизнеспособности клеток. Метод использован для изучения механизма действия антибиотиков разных классов и эффективности их действия на живые клетки E.coli. Показано, что мембрано-активный антибиотик колистин не только разрушает клеточные мембраны, как считалось ранее, но и подавляет синтез АТФ, что приводит к гибели клетки. Проведена матричная сополимеризация анилина и 3-аминобензойной кислоты в ГЭР-буферной смеси на основе бетаина и глицерина с помощью лакказы. Полученные интерполиэлектролитные комплексы имеют сферическую форму диаметром 60-180 нм, электрохимически активны, обладают электропроводностью, проявляют более высокую ингибирующую способность по отношению к Staphylococcus aureus и Escherichia coli, чем гомополимеры и могут быть использованы для создания антимикробных пленочных покрытий. Было определено изменение механической жесткости нейронов и уровня АФК под действием β-амилоидного пептида. β-амилоид (Aβ) представляет собой пептид длиной 36–43 аминокислот, который под действием различных патогенных факторов способен формировать токсичные агрегаты и амилоидные бляшки в головном мозге человека и запускать патогенный каскад болезни Альцгеймера (Holmes et al., 2008). Из всех изоформ наиболее изучен пептид Aβ длиной 42 а.о. (Aβ42), который также широко признан в качестве основной нейротоксической формы при болезни Альцгеймера (Arbor et al., 2016). Агрегированные формы Aβ42 влияет на различные компоненты клеточной структуры, включая плазматическую мембрану и субклеточные экземпляры (Calamai et al., 2016) (Mokhtar et al., 2013). Действие Aβ42 на нейрональные клетки характеризуется увеличением продукции АФК, снижением митохондриального потенциала и приводит к нарушению регуляции кальция. Ряд исследований так демонстрирует негативное влияние олигомерных и фибриллярных форм Aβ42 на цитоскелет нейронов. Цитоскелет представляет собой сеть, состоящую, в основном, из микротрубочек, микрофиламентов и промежуточных филаментов. Сообщается, что Aβ42 вызывает модификации цитоскелета, такие как разборка микротрубочек и полимеризация актина, что приводит к дегенерации синапсов в нейронах (Ungureanu et al., 2016) (Qi Gao et al., 2019). Эти эффекты приводят к изменениям механических свойств клеток, которые можно оценить с помощью техники СИПМ. Используя СИПМ, мы измерили модуль Юнга и концентрацию АФК после 4 и 24 часов инкубации с 10 мкМ Aβ42 в нейронах гиппокампа крысы. Предварительные данные показывают, что инкубация с Aβ42 приводит к резкому увеличению жесткости цитоскелета нейронов и уровня внутриклеточных АФК. Известно, что инкубация с олигомерами Aβ приводит к значительному увеличению количества фибриллярного актина (Mendoza-Naranjo et al., 2006), который может вносить вклад в жесткость клеток, измеренную с помощью СИПМ. Нарушение гомеостаза кальция, вызванное Aβ-42, приводит к активации Rho ГТФаз, которые являются ключевыми регуляторами полимеризации F-актина (Bishop and Hall, 2000). Наблюдаемое повышение уровня АФК совпадает с данными литературы о способности Aβ42 нарушать работу митохондрий и индуцировать окислительный стресс. Таким образом, с помощью техники СИПМ мы можем подтвердить индуцированные Aβ42 изменения жесткости и уровня АФК в нейронах гиппокампа и других клеточных культурах. Используя жесткость мембран как интегральную характеристику состояния цитоскелета в интактных клетках, мы можем определить, какие механизмы приводят к изменению динамики цитоскелета под действием Aβ42. Было разработана и успешно продемонстрирована возможность проведения локальных электрофизиологических измерений на примере живых клеток нейробластомы со сформированными агрегатами флуоресцентного Aβ-42. Так, разработанная технология позволяет точно определить наличие агрегата Aβ-42 путем коррелятивного картирования топографии и конфокальной визуализации. После коррелятивного сканирования производится формирование гигаОмного контакта с мембраной клетки и измерение мембранного потенциала всей клетки и сравнить с контрольными клетки, где клетки с агрегатами Aβ-42 продемонстрировали сниженный мембранный потенциал, что опять же связано с нарушением гомеостаза клетки. Разработанная методика совмещения электрофизиологических измерений и коррелятивного СИПМ позволит успешно выполнить поставленные задачи. Разработан и апробирован нанокапиллярный сенсор для определения концентрации кислорода внутри сфероидов и in vivo моделей опухоли. Данный сенсор позволяет неинвазивно и с высоким временным и пространственным разрешением осуществлять мониторинг содержания кислорода. В рамках апробации работы нанокапиллярного сенсора были проведены измерения внутри сфероидов MCF-7 (аденокарцинома молочной железы). Показано, что при приближении наноэлектрода к поверхности сфероида концентрация кислорода снижается, что связано с активным потреблением кислорода клетками в составе сфероида, причем было установлено, что при проникновении наноэлектродом внутрь сфероида наблюдается значительная гипоксия. Таким образом, было показано, что использование данной методики позволяет проводить измерения внутри сфероидов с высокой точностью. Следующим этапом было проведение измерений внутри in vivo моделей. Нами были выбраны 2 модели: мозг крысы и опухоль, импл антированная внутрь мозга крысы (глиабластома). Были измерены профили внутри мозга и опухоли крысы. Показано, что внутри глиабластомы наблюдается существенная гипоксия по сравнению с мозгом, который является активным потребителем кислорода. Это исследование указывает на потенциальную ценность такого практического подхода и предполагает, что его можно применять для изучения механизма действия и для мониторинга эффективности противоопухолевых препаратов. Получены данные о поверхностной активности, структуре и антимикробных свойствах комплексов лизоцима и блок-сополимеров полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислот ы разного состава (PEG114PGLU10, PEG114PGLU50, PEG114PGLU100). С целью разработки систем для тераностики онкологических заболеваний синтезированы наночастицы магнетит-золото вида "гантель", содержащие фотосенсибилизатор (ФС) (ряда бактериофеофорбида), иммобилизованный на поверхности магнетита. Разработанная методика включает в себя стабилизацию магнитной части НЧ (DOPAC и PEG) (DOPAC - 3,4-дигидроксифенилуксусная кислота; PEG - полиэтиленгликоль) с дальнейшим ковалентным сшиванием с ФС. Исследованы физико-химические свойства полученных наночастиц. Гидродинамический диаметр составил 26 нм, ζ –потенциал -17,4 мВ. Осуществлен расчет параметров системы. Квантовый выход генерации синглетного кислорода фотосенсибилизатора составил 0,79. Минимальный радиус Ферстера 51,02 Å. Разработан метод загрузки фотосенсибилизатора на поверхность магнетита путем химической конъюгации. В методике использовали три блок сополимер (PEG) и DOPAC для стабилизации системы в водной среде. Конъюгаты аторвастатина с увеличенной гидрофильностью и повышенной гепатоселективностью были синтезированы и охарактеризованы. Исследована аффинность к асиалогликопротеиновому рецептору (ASGPR) ряда лигандов – конъюгатов аторвастатина и фрагментов N-ацетилгалактозамина со сложноэфирной и амидной связями. Получены равновесные константы диссоциации (KD) лиганд-рецепторных комплексов методом спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса. Определены кинетические параметры реакции восстановления 3-гидрокси-3-метилглутарил кофермента А, катализируемой ферментом ГМГ-КоА редуктазой в присутствии конкурентного ингибитора ‒ аторвастатина. Изучен процесс высвобождения активного ингибитора из конъюгатов под воздействием кислой среды (pH 3). Было показано, что в случае коньюгатов со сложноэфирной связью реакция образования промежуточного соединения – лактона имеет псевдопервый порядок, а реакция гидролиза лактона ‒ псевдонулевой. Продемонстрировано, что коньюгаты с амидной связью являются стабильными как в кислой среде, так и в присутствии эстеразы из свиной печени. Изучена способность коньюгатов аторвастатина снижать каталитическую активность ГМГ-КоА редуктазы. Показано, что не гидролизованные коньюгаты не способны ингибировать фермент. Разработана и оптимизирована методика иммобилизации фенилацетонмонооксигензы на поверхности гибридных магнитных наночастиц (МНЧ). Метод заключается в специфическом связывании N-триацетильного мотива на поверхности наночастицы с полигистидиновым участком фермента и остатком гистидина-187, являющимся важным для каталитической активности фермента. Получение иммобилизованного белка на МНЧ было подтверждено с помощью анализа траектории наночастиц (NTA) и ИК-спектроскопии. В результате иммобилизации фермент связывается в неактивной форме. Установлено двукратное увеличение активности иммобилизованного фермента в результате воздействия магнитного поля частотой 50 Гц. Синтезированы стержневидные магнитные наночастицы (МНЧ) на основе оксидов железа. Полученные МНЧ были модифицированы дофамином и охарактеризованы Мессбаэровской спектроскопией, методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и анализом траектории наночастиц (АТН). Полученные частицы представляют собой стержневидные МНЧ, в состав которых входит магнетит (20%) и акагенит (80%). Размер частиц составил в длину 56±13 нм и в ширину 13±3 нм. Гидродинамический радиус полученных частиц составил 78±10 нм. Синтезированные МНЧ использовали для дестабилизации внешней мембраны клеток E.coli под действием низкочастотного переменного магнитного поля (НЧ ПМП) с целью усиления выхода перепилазматического белка β-лактамазы. Выход периплазматического белка оценивали спектрофотометрически, измеряя его активность в супернатанте с применением хромогенного субстрата CENTA. Установлено, что воздействие НЧ ПМП (50 Гц, 68,5 мТс) в течение 20 минут при комнатной температуре к суспензии клеток E.coli в присутствии стержневидных МНЧ приводит к усилению выхода периплазматического белка более чем в 4 раза относительно контроля. Разработан метод количественного определения специфичных мРНК бета-лактамаз разных молекулярных классов на биочипах и определены его аналитические характеристики; Разработана системы выделения и очистки рекомбинантной сериновой бета-лактамазы СТХ-М-116 молекулярного класса А; получен высокоочищенный препарат рекомбинантного фермента для иммунизации кроликов; Получены и охарактеризованы специфические к бета-лактамазе СТХ-М типа поликлональные антитела (титр 1:100000); показана возможность иммуноферментного определения бета-лактамазы СТХ-М типа в буферном растворе с использованием хромогенного субстрата CENTA; Впервые получены и проанализированы новые кристаллические структуры нативной бета-лактамазы TEM-171 и двух ее комплексов с широко используемым ингибитором тазобактамом; Установлена ингибирующая активность известного детоксицирующего антидота 2,3- димеркаптопропан-1-сульфоната (унитиола) против металло-β-лактамаз двух типов; показано, что унитиол действует как конкурентный ингибитор гидролиза меропенема рекомбинантной металло-β-лактамазой NDM-1; показано, что унитиол ингибирует природные металло-β-лактамазы NDM-1 и VIM-2, продуцируемые резистентными к карбапенемам штаммами К. pneumonia и E. сoli. Продолжается работа по использованию сухих образцов биологических жидкостей для биологических исследований. Проведен отбор образцов крови, плазмы, молока и волос домашних коз для проведения мониторинга стрессовых состояний (определение гормона кортизола). Проведен сравнительный анализ определения кортизола в жидкой плазме и сухой крови с использованием метода иммуноферментного анализа. Данный подход может быть использован для отбора образцов в полевых условиях с последующим определением искомого вещества в лаборатории. На модельной системе проведено изучение образования агломератов конъюгатов биотинилированных антител с наночастицами золота различных размеров и стрептавидина в зависимости от концентраций компонентов. Подход может быть использован для увеличения чувствительности латерального проточного иммуноанализа при сохранении концентрации коллоидных наночастиц в качестве метки. Синтезирован и охарактеризован метало-полимерный гибридный наноматериал на основе наночастиц серебра, ассоциированных со стимулчувствительным диблок-сополимером поли(1,2-бутадиен)-блок-поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилатом). Продемонстрировано усиление сигнала гигантского комбинационного рассеяния (ГКР сигнала) 4-меркаптофенилбороновой кислоты в присутствии металлополимерного гибридного наноматериала под действием локального лазерного облучения. Предложены механизмы, объясняющие усиление ГКР сигнала в данной системе. Продолжены работы по исследованию препаратов внеклеточных везикул методом анализа траекторий наночастиц. Методика успешно опробована для измерения везикул бактериального происхождения. По результатам опубликованы 1 статья в зарубежном журнале. Исследованы возможности методов машинного обучения для оценки степени посттрансляционной модификации белков на основе новой тандемной ГКР технологии, объединяющей высокочувствительную ГКР спектроскопию и ферментативный гидролиз белковых молекул на примере фибриногена с различной степенью окислительной модификации с использованием различных типов подложек на основе непрерывных пленок серебра. Впервые биолюминесцетные клетки E.coli, продуцирующие рекомбинантную термостабильную люциферазу светляков, позволяющей проводить исследования при повышенных температурах, использованы в качестве тест-систем для изучения влияния внешних стимулов на живые клетки. Разработан метод селективного определения активности люциферазы и концентрации АТФ вне и внутри клеток. Показано, что люцифераза является чувствительным белковым маркером на действие мембран-активных агентов, а АТФ – основным показателем жизнеспособности клеток. Метод использован для изучения механизма действия антибиотиков разных классов и эффективности их действия на живые клетки E.coli. Показано, что мембрано-активный антибиотик колистин не только разрушает клеточные мембраны, как считалось ранее, но и подавляет синтез АТФ, что приводит к гибели клетки. Показано, что p-сульфонато-каликс[n]аренов (СnS), отличающиеся структурой гидрофобного ядра и числом зарядов, способны связываться и изменять свойства разных ключевых компонентов плазмы. Например, C4S обладает коагулянтной, а C6S –антикоагулянтной активностью. Выявлено, что конъюгаты стрептокиназа-полиамидоаминные дендримеры SK-G3.5 состава (1:1) и (1:5) обладают максимальной тромболитической активностью, более стабильны в плазме и вызывают меньший фибриногенолиз, чем нативная SK. Показано, что, в отличие от интактного IgG, IgG*, обработанный плазмином, способен связывать плазминоген и ключевую роль в этом процессе играет доступный С-концевой лизин в IgG*. Это является одним из механизмов вовлечения системы плазминоген/плазмин в онкогенез Найдены значительно более высокие уровни циркулирующих IgG, связанных к плазминогену, в группе мышей с раком молочной железы (РМЖ) по сравнению с группой здоровых мышей (p<0.05). Циркулирующие IgG к плазминогену в крови пациентов могут быть перспективным биомаркером для ранней диагностики РМЖ. Согласно рассчитанным кинетическим параметрам процесса деградации НЦ в анаэробных условиях, можно с уверенностью сказать, что нитроцеллюлоза накопленная в шламонакопителях не претерпевает никаких изменений и остаётся взрывоопасной даже по прошествии десятков лет. Стимуляция дополнительным источником биогенных элементов и развитие аборигенной микрофлоры позволило снизить концентрацию нитроцеллюлозы на 44 % за 100 суток процесса. Применение мезофильного консорциума микроорганизмов (биокатализатора) с объемной загрузкой 30 % и температурой анаэробного процесса 35 °C позволило снизить концентрацию нитроцеллюлозы на 39 %. Несколько меньшая степень эффективности по сравнению с аборигенной микрофлорой связана со специфичностью биокатализатора к новому для него субстрат, а именно нитроцеллюлозе. Ведь сам биокатализатор был адаптирован к более легким максимально биодоступным углеводным субстратам, таким как барда спиртового производства. Применение термофильного биокатализатора с объемной загрузкой 30 % и температурой анаэробного процесса 55 °C позволила полностью разложить НЦ за 100 дней. Подобраны условия для эффективного внедрения фермента супероксиддисмутазы1 (СОД1) в CaP-частицы покрытые 5 кДа хитозаном, процент включения составил 64%. Полученные частицы были охарактеризованы метом динамического светорассеяния (ДСР) и имели средний гидродинамический диаметр 150-190 нм и ζ-потенциал +22 мВ. Исследование частиц с помощью методом растровой электронной микроскопии (РЭМ) показало, что покрытые 5 кДа хитозаном частицы имели форму шарообразную форму диаметром около 150 нм. Получены покрытые 5 кДа хитозаном CaP-частицы одновременно содержащие СОД1 и ингибитор АПФ эналаприлат. Подтверждено отсутствие взаимного влияния внедряемых препаратов. Эффективность включения СОД1 и эналаприлата составила 30% и 56%, соответственно. Размер полученных частиц определенный методом ДСР составил 120-160 нм, а ζ-потенциал +20 мВ. Подобраны условия синтеза частиц на основе двух видов хитозана – 5 кДа хитозана и 72 кДа гликоль-хитозана. Гидродинамический диаметр полученных сферических частиц, измеренный методом ДСР, составил 90-130 нм и 240-260 нм, соответственно. Внедрение эналаприлата в частицы на основе 5 кДа хитозана (процент включения 25%) не привело к существенному изменению их характеристик. Включение эналаприлата в частицы на основе 72 кДа гликоль-хитозана было более эффективным (процент включения 41%) и приводило к увеличению их среднего гидродинамического диаметра до 440-480 нм. Полученные препараты являются перспективными для использования в офтальмологии. Произведены выделение и очистка АПФ из набора тканей сердца четырех доноров. Впервые получены ГКР-спектры АПФ из тканей сердца, адсорбированного на серебряной подложке. Выделены интервалы в спектрах и обозначены характеристические полосы, где сконцентрированы максимальные вклады в разделение спектров. Для АПФ из семенной жидкости такими характеристическими полосами являются 833 и 1605 см-1, для АПФ из легких 1169 и 1473 см-1 и для АПФ из сердца 1241 и 1605 см-1. Таким образом, впервые обнаружены различия в ГКР-спектрах молекул АПФ, отличающихся гликозилированием при одинаковой белковой глобуле. Подтвержден конкурентный характер ингибирования карбоксилэстеразы тремя селективными ингибиторами фермента (алкил-2-арилгидразинилиден-3-оксо-3-полифторалкилпропионаты ESh-409, 410, 445). Для всех трех соединений определены константы ингибирования. Новая работа, не входившая в план на 2022: Исследование взаимодействия АПФ быка с различными эффекторами проводили методом поляризации флуоресценции. В ходе работы были получены флуоресцентно меченные конъюгаты: низкомолекулярного лизиноприла-ФИТЦ и белка лизоцима-ФИТЦ. В случае лизиноприла-ФИТЦ методика была улучшена подбором смеси для выделения более чистого конъюгата из реакционной смеси, константа диссоциации комплекса с АПФ составила Kd = 2,6±0,2 нМ. Впервые определена константа диссоциации комплекса АПФ быка с лизоцимом человека Kd = 3,3±0,5 нМ. Разработка системы доставки лекарственного препарата в глаз на основе неорганических кальций-фосфатных частиц, покрытых органическим полимером хитозаном, а также хитозановых частиц. Разработка аналитической платформы на основе ГКР-спектров для идентификации гликоформ ангиотензин-превращающего фермента, продуцируемого разными типами клеток. Характеристика взаимодействия АПФ с белками различной природы. В течение 2022 г. проводились работы по конструированию планшетных хемилюминесцентных методов анализа с применением захватывающих полимерных конъюгатов аналитов вместо использования дорогостоящих специфических антител. Получены гидрофобированные препараты декстрана, способные удерживаться на поверхности полистирола. Полученные конъюгаты гидрофобированного декстрана с флуоресцеином (модельным аналитом, используемым для определения оптимальных условий синтеза) показали перспективность такого подхода иммобилизации аналита в лунках планшета для иммуноферментного анализа. Полученные результаты являются основой (на следующем этапе работы) для развития гетерогенных методов определения нуклеиновых кислот. Проведены клонирование и экспрессия полноразмерной эндо-процессивной ксилоглюканазы из гриба T.reesei (TrXeg74A), а также каталитического домена фермента (TrXeg74A-CD) в реципиентном штамме P.verruculosum B1-537, являющимся высокоэффективным продуцентом целлюлаз. Уровень секреции белка после культивирования полученных рекомбинантных штаммов в лабораторном ферментере составил 35,4 и 31,4 г/л, при этом секреция TrXeg74A составила не менее 30% от общего количества белка, тогда как TrXeg74A-CD экспрессировался в гораздо меньшей степени. Обе формы рекомбинантного фермента были выделены и изучены их свойства. TrXeg74A и TrXeg74A-CD характеризовались сходной степенью процессивности при действии на ксилоглюкан из тамаринда, близкими по значению константами Михаэлиса (0,35–0,38 г/л), сходными с таковой для нативного фермента (0,30 г/л), в то же время каталитическая константа для TrXeg74A-CD была примерно в полтора раза выше соответствующего параметра для полноразмерной ксилоглюканазы. Полученные новые рекомбинантные штаммы P. verruculosum могут быть полезными при создании композиционных ферментных препаратов для эффективного гидролиза возобновляемой растительной биомассы. Исследованы концентрационные эффекты p-сульфонато-каликс[n]аренов (СnS) на ключевые показатели системы гемостаза. Выявлено, что С4S и С6S благодаря различиям в структуре и гибкости их гидрофобного ядра и числу зарядов способны распознавать разные белки плазмы: C4S изменяет конформацию фибриногена и стимулирует его свертывание, напротив, C6S подавляет свертывание фибриногена за счет ингибирования активности тромбина и каскада свертывающих факторов. Таким образом, C4S обладает коагулянтной, а C6S –антикоагулянтной активностью. Исследовано влияние генерации полиамидоаминных (PAMAM) дендримеров (G1.5, G2.5 и G3.5) и соотношения SK:полимер (1:1 - 1:10 М/М) на тромболитическую эффективность конъюгатов SK-дендример. Найдено, что конъюгаты SK-G3.5 (1:1) и (1:5) обладают максимальной тромболитической активностью, более стабильны в плазме и вызывают меньший фибриногенолиз, чем нативная SK. Ранее нами обнаружено наличие у онкобольных IgG, способного связываться с плазминогеном (Pg). Изучение влияния селективного протеолиза лизиновых связей IgG плазмином на связывание и активацию Pg показало, что в отличие от интактного IgG, обработанный плазмином IgG (IgG*), связывается с Pg сильнее и повышает скорость его активации урокиназой. Удаление С-концевого лизина карбоксипептидазой В или добавление L-лизина ингибирует связывание IgG* с Pg. Резюме: IgG*, в отличие от интактного IgG, способен связываться с крингл-доменами плазмин(огена). и ключевая роль в этом процессе принадлежит доступному С-концевому лизину в IgG*. Мы наблюдали значительно более высокие уровни циркулирующих IgG к плазминогену в группе мышей с РМЖ по сравнению с группой здоровых мышей (p<0.05). При анализе ROC-кривой чувствительность классификации РМЖ по здоровому контролю составила 72%, специфичность — 95%, а площадь под кривой — 0.93. Результаы требуют дальнейшего подтверждения на пациентках с РМЖ. Показано, что формирование искусственных микробных консорциумов и применение биокатализаторов в иммобилизованном виде лежит в основе успешной реализации гибридного химико-биокаталитического процесса обессеривания модельных сред и реального углеводородородного сырья. Описаны различные подходы к формированию иммобилизованного в криогеле поливинилового спирта искусственного консорциума в анаэробном метаногенном биореакторе с целью биотрансформации органических сульфонов в сульфид параллельно с накоплением биогаза. Показано, что искусственный анаэробный консорциум способен к биоконверсии смеси 0,15 мМ дибензотиофенсульфона и 0,15 мМ бензотиофенсульфона с выходом сульфида 98% и уровнем эффективности метаногенеза 97% за 8 сут. Гидролизат пшеничной соломы и этанол (экстракт сульфонов из процесса окислительной десульфурации бензо- и дибензотиофенов) были успешно введены в среду для метаногенеза в качестве дополнительного субстрата процесса. Продемонстрирована успешная метаногенная биотрансформация серосодержащих отходов, полученных после химического окислительного обессеривания неочищенного вакуумного газойля, прямогонной бензиновой фракции (нафта), газового конденсата, прямогонной дизельной фракции. Отходы с высоким содержанием азота (гидролизаты куриного помета) и биомасса фототрофных микроорганизмов (Chlorella vulgaris) впервые успешно применены в качестве ко-субстратов в ходе метаногенной биотрансформации серосодержащих экстрактов, полученных после химического обессеривания углеводородного сырья. Достигнута 100%-ная конверсия серы, содержащейся в экстрактах, в неорганический сульфид с одновременным получением биогаза с высоким содержанием метана (>70%). Очистку стоков из метантенка осуществляли методом DEAMOX (DEnitrifying AMmonia Oxidation). Высокая эффективность процесса достигалась с использованием оригинальных иммобилизованных искусственных консорциумов. Получены новые композиционные волокнистые материалы с антибактериальными свойствами. Показано, что введение в матрицу бактериальной целлюлозы полилактида или обычных волокон, дополнительных полимеров приводит к снижению их структурной пористости. На примере Escherichia coli и Bacillus subtilis показано, что наилучшую антибактерисльную активность проявляли композиты, в состав которых входили полигидроксибутират и наночастицы Та. На основе анализа известных данных, установлено, что функционирование биокатализаторов – продуцентов полисахаридов, можно оптимизировать с помощью следующих основных подходов синтетической биологии: использование рекомбинантных биокатализаторов, создание искусственных консорциумов, сочетание нано- и микробиокатализаторов, их иммобилизация. Новые биокатализаторы способствуют расширению спектра полезных свойств полисахаридов и направлений их применения. Изучен процесс гидролиза ряда микотоксинов (патулина, дезоксиниваленола, зеараленона и стеригматоцистина) с применением фермента His6-OPH. Наилучшие константа Михаэлиса и каталитическая константа были оценены в случае стеригматоцистина и патулина, соответственно. Исследована возможная комбинация His6-OPH с неорганическими сорбентами, обработанными низкотемпературной плазмой. Ферментно-полиэлектролитные комплексы поли(глутаминовой кислоты) с His6-OPH и другим ферментативным деструктором микотоксинов (термолизин) были успешно использованы для модификации волокнистых материалов. В ходе разработки подходов к деструкции микотоксинов оценены каталитические характеристики 7 выбранных ферментов в потенциальных реакциях с различными микотоксинами (афлатоксин В1, цитринин, дезоксиниваленол, эрготамин, фумонизин В1, глиотоксин, охратоксин А, патулин, стеригматоцистин, токсин Т-2, зеараленон) при различных значениях рН. Для стабилизации ферментов, гидролизующих микотоксины, с помощью компьютерного моделирования были подобраны специальные биополимеры. Выявлено, что полиглутаминовая кислота является универсальным партнером полиэлектролитных комплексов с выбранными ферментами. С привлечением модельных животных объектов в виде крыс Sprague-Dawley проведены эксперименты по их кормлению in vivo кормом, загрязненным смесью микотоксинов в дозах, на порядки превышающих максимально допустимые пределы. Обработка контаминированных кормов новыми комбинированными ферментными нанокомплексами значительно снижала негативное влияние смеси микотоксинов на биохимические показатели крови. Без обработки кормов у животных биохимические показатели крови свидетельствовали о значительном поражении печени и почек за счет интоксикации. Проанализированы основные направления применения биолюминесцентного метода анализа АТФ: санитарный контроль, контроль качества очищенной воды, микробный анализ в пищевой промышленности, оценка качества лекарств, а также мониторинг метаболического состояния биокатализаторов, используемых в различных биотехнологических процессах. АТФ-метрия успешно апробирована в новых направлениях: создание синтетических микробных консорциумов, их внедрение в качестве новых биокатализаторов процессов биодеградации пестицидов, подавление накопления метана на модельных городских полях, контроль опасного развития биокоррозионных процессов, разработка химико-биокаталитических гибридных процессов, создание эффективных антимикробных перевязочных и защитных тканевых материалов и др. Изучены возможности применения супрессоров метаногенеза, таких как окислительно-восстановительные производные гуминовых кислот, персульфат калия, обладающий окисляющими и электроноакцепторными свойствами, фермент гексагистидинсодержащая фосфорорганическая гидролаза с высокой лактоназной активностью и полипептидный противомикробный препарат бацитрацин. Действие этих веществ было направлено на различных участников природного метаногенного консорциума, а также на осуществляемые ими биохимические процессы. Использование персульфата калия совместно с бацитрацином обеспечивало максимальное и практически полное подавление продукции метана. Измеренная концентрация внутриклеточного аденозинтрифосфата показало, что жизнеспособность клеток в консорциуме практически не меняется, тогда как их метаболическая активность снизилась. Различные комбинации перечисленных выше супрессоров обеспечивали разную степень подавления метаногенеза, но ключевую роль во всех исследованных случаях играли окислительно-восстановительные агенты. Установлено, что иммобилизация клеток в криогель поливинилового спирта может успешно применяться для одновременной криоиммобилизации, криоконсервации и длительного хранения клеток различных фототрофных микроорганизмов (зеленых и красных микроводорослей, диатомей и цианобактерий). Впервые на 12 различных иммобилизованных клетках микроводорослей показано, что они могут храниться в замороженном виде не менее 18 месяцев с сохранением 90%-ного уровня жизнеспособности, а в дальнейшем могут быть использованы в качестве для накопления биомассы в жидкой среде. Применение криоиммобилизованных клеток Chlorella vulgaris в качестве инокулята позволило загрузить в среду высокую концентрацию клеток микроводорослей для накопления свободной биомассы, что увеличило скорость процесса. Показано, что не менее 5 циклов повторного использования одних и тех же иммобилизованных клеток в качестве инокулята для накопления клеток может быть реализовано при использовании различных реальных сточных вод в качестве сред для одновременного культивирования микроводорослей и очистки воды. Разработан иммобилизованный искусственный консорциум на основе микроорганизмов, принадлежащих к грамположительным и грамотрицательным бактериальным клеткам, способных совместно осуществлять быструю и эффективную деградацию различных фосфорорганических пестицидов: параоксон, паратион, метилпаратион, диазинон, хлорпирифос, малатион, диметоат и деметон-S-метил. В качестве носителя для иммобилизации консорциума использовали криогель поливинилового спирта. После отбора между несколькими кандидатами из родов Rhodococcus и Pseudomonas была найдена необходимая комбинация из двух культур (P. esterophilus и R. ruber). Дальнейшее изменение соотношения между биомассой клеток внутри гранул иммобилизованного консорциума, увеличение плотности упаковки клеток внутри тех же гранул и уменьшение размеров гранул обеспечило улучшение активности по отношению к токсиканту на 225%. Увеличение скорости и степени деградации пестицида было в 4,5 и 16 раз выше, чем у индивидуальных клеток P. esterophilus и R. ruber, соответственно. Продемонстрировано многократное использование полученного иммобилизованного консорциума. Совместное включение природных штаммов в носитель во время иммобилизации усиливало активность консорциума без генетической модификации клеток. Проведена аннотация генома дрожжей Ogataea parapolymorpha на предмет идентификации генов оксидазы D-аминокислот.. Впервые в мире в одном геноме найдены гены пяти оксидаз D-аминокислот и одной D-аспарат оксидазы. Все гены клонированы в клетках E.coli. Проведены эксперименты по введению пяти аминокислотных замен в мутантную формиатдегидрогеназу.Каждая точечная заменаранее давала стабилизацию ФДГ дикого типа. Показано, что эти же замены дают стабилизацию и мутантной ФДГ, причем одна замена имела кооперативный положительный эффект. Сконструированы новые биоинженерные форматы рекомбинантных иммуноглобулинов для профилактики и терапии коронавирусной инфекции. Разработана система экспрессии рекомбинантных моноклональных иммуноглобулинов IgA-класса для интраназальной профилактики и лечения коронавирусной инфекции. Получены образцы рекомбинантных антител, обладающих противовирусной активностью в отношении актуальных штаммов SARS-CoV-2. Оптимизированы способы получения рекомбинантных антител IgA-класса из среды культивирования клеток млекопитающих.