ИСТИНА

Выяснение роли каспазы-2 и ее пост-трансляционных модификаций в регуляции гибели раковых клеток, индуцируемой химиотерапевтическими препаратами

Каспаза-2 выполняет в организме различные функции, отвечая за запуск апоптоза в ответ на ряд стимулов, элиминацию анеуплоидных и полиплоидных клеток или клеток в состоянии митотического стресса, а также обладает онкосупрессорными свойствами. Более того, этот белок отвечает за сохранение геномной стабильности, активируясь при его повреждении. Несмотря на важность этого фермента механизм регуляции его работы остается до сих пор плохо изученным. Так, практически нет сведений о том, как регулируется данный фермент за счет-пострансляционных модификаций, таких как фосфорилирование и убиквитинилирование. На предыдущих этапах исследований мы выявили ряд потенциальных сайтов фосфорилирования каспазы-2 и проанализировали их. Оказалось, что только замена S384A в последовательности каспазы-2 вела к ингибированию автокаталитического процессинга профермента, что практически полностью подавляло его ферментативную активность и снижало уровень гибели клеток при индукции апоптоза генотоксическим стрессом. Все эти данные указывали на то, что остаток S384 является ключевым для работы каспазы-2. Однако, предыдущие попытки доказать, что данный остаток подвергается фосфорилированию, не имели успеха. Поэтому мы применили в текущем году некоторые другие подходы (масс-спектрометрический, биоинформатический анализ и молекулярное моделирование) для исследования механизмов, каким образом S384 регулирует работу каспазы-2. В первую очередь был применен метод масс-спектрометрического анализа для непосредственного анализа возможности фосфорилирования каспазы-2. Для проведения данного анализа каспазу-2 (мутантную и дикого типа) выделяли из клеток линии СAOV-4 и линии HEK293T при индукции в них генотоксического стресса. Далее препараты были проанализированы с помощью масс-спектрометрического и протеомного анализов. Фосфорилирование остатка S384 не было подтверждено этим методом. Для изучения механизма воздействия замены серина в положении 384 на аланин в молекуле каспазы-2 было исследовано пространственное расположение остатка S384 относительно активного центра в 3D структуре данного фермента. Проведенный анализ показал, что остаток S384 находится на дне небольшой полости вблизи активного центра. Важно отметить, что тетраэдрическая фосфатная группа слишком объемная, чтобы поместиться в эту полость и ковалентно связаться с боковой цепью серина, поэтому мы сделали вывод, что данный остаток не может быть фосфорилирован. Оказалось, что боковая цепь изучаемого остатка серина вовлечена в формирование поверхности данной полости вместе с боковыми цепями остатков Arg-219 и Arg-378. Карбоксильная группа аспартата субстрата связывается в этом кармане, что имеет первоочередное значение для субстратного распознавания. Arg-219 и Arg-378 образуют водородные связи с аспартатом, в то время как остаток серина в положении 384 напрямую не взаимодействует с субстратом. Вместо этого данный остаток образует водородные связи с боковой цепью аспартата в позиции 225 каспазы-2. При мутации серина в позиции 384 водородная связь с аспартатом 225 не образуется, зато формируется гидрофобный контакт с изолейцином 387. Конформация аргинина в положении 378, одного из ключевых остатков, участвующих в связывании субстрата, при этом сильно изменяется: гуанидиновая группа поворачивается таким образом, что атом Nε больше не способен образовывать важную водородную связь с аспартатом субстрата. Замена S384A в структуре каспазы-2 не влияет на каталитическую пару His-227 - Cys-320, но ведет к нарушению связывания субстрата с остатком аргинина в позиции 378. Таким образом, данные результаты говорят о том, что остаток S384 играет ключевую роль в связывании субстрата, что необходимо для процессинга каспазы-2, ее каталитической активности и запуска процесса клеточной гибели. Вывод о важности остатка S384 в структуре каспазы-2 подтвердился множественным выравниванием последовательностей инициаторных и эффекторных каспаз, которое показало высокую степень консервативности остатка серина в положении 384 среди представителей семейства каспаз и среди различных видов. Для валидации важности S384 на уровне организма был проведен анализ базы данных TCGA на наличие missense и stop-gain мутации в каспазах-2, -3 и -6 при консервативном положении аргинина, которое соответствует Arg-378 в каспазе-2. Выяснилось, что мутации Arg-378Trp в каспазе-2, Arg-207Stop в каспазе-3 и Arg-220Trp в каспазе-6 были обнаружены в карциномах тела матки. Также было выявлено, что позиция серина, которая соответствует остатку S384 в каспазе-2, подвергаются миссенс-мутагенезу в каспазе-5 и -6 при развитии плоскоклеточного рака легкого и аденокарциноме легкого. Полученные данные свидетельствуют о значимости таких замен в нарушениях апоптотической гибели опухолевых клеток и канцерогенезе. Таким образом, полученные результаты демонстрируют решающую роль остатков Ser-384 и Arg-378 в связывании субстрата, процессинге каспазы-2 и формировании ее ферментативной активности. Однако, наши данные свидетельствуют, что остаток Ser-384 не подвергается фосфорилировнию, а участвует в формировании и поддержании стабильности активного центра каспазы-2. Более того, описанный механизм консервативен и, вероятно, является общим для других членов семейства каспаз. Исследования другой формы пост-трансляционной модификации каспазы-2 – убиквитинирования также были продолжены. На предыдущих этапах нами было детектировано взаимодействие каспазы-2 и р62, убиквитинилирование каспазы-2, а также её деградация при оверэкспрессии р62. В связи с этим возник вопрос: опосредует ли р62 деградацию каспазы-2 через протеасомы или через аутофагический путь, или у их взаимодействия другая функция? Для выяснения этих вопросов были выполнены следующие исследования. На предыдущих этапах работы нами было показано, что блокирование протеосомной деградации с помощью MG-132 приводит к аккумуляции активной формы каспазы-2 и усилению гибели опухолевых клеток. Однако, это не исключало, что убиквитинилированная каспаза-2 подвергается протеолизу по аутофагическому пути. Для выяснения этого вопроса в клетках линии HEK293T индуцировали апоптоз генотоксическим стрессом, а затем блокировали протеасомную или аутофагическую деградацию с помощью ингибиторов. Было продемонстрировано, что при комбинаторной обработке доксорубицином и MG-132 наблюдалась значительное расщепление полноразмерного PARP и аккумуляция ферментативно-активных фрагментов каспазы-2 и -3. Таким образом, можно сделать вывод о том, что блокирование протеасом приводило к аккумуляции расщепленной формы каспазы-2. В противовес этому, оказалось, что при блокировании аутофагии не происходило накопление проформы или ферментативно-активных форм каспазы-2 ни в нормальных условиях, ни в условиях генотоксического стресса, из чего можно сделать вывод о том, что каспаза-2 подвергается протеасомной, но не аутофагосомной деградации. Для проверки данного вывода мы проанализировали накопление ферментативно-активных форм каспазы-2 в клетках аденокарциномы легкого U1810 дикого дипа (U1810 wt – wild type) и нокаутных по гену аутофагии ATG13, и потому неспособных к аутофагии (U1810 ATG13KO). Клетки обрабатывали ингибитором протеасом, а также ингибитором трансляции циклогексимидом и ингибитором каспаз QVD в течение 24 часов для того, чтобы исключить процессы синтеза или апоптотической деградации каспазы-2. Было показано, что при обработке клеток циклогексимидом наблюдалось уменьшение уровня проформы каспазы-2 без накопления ферментативно-активных фрагментов каспазы-2. Снижение уровня проформы возможно было по трем причинам: 1) деградация каспазы-2 по пути аутофагии, 2) аутопротеолиз в процессе инициации апоптоза, 3) деградация в протеасоме. Поскольку разница в уровне каспазы-2 в клетках дикого типа и нокаутных по аутофагическому гену отсутствовала, следовательно, убиквитинилированная каспаза-2 не подвергалась аутофагосомной деградации. Для проверки варианта апоптотической гибели данный тип гибели был заблокирован обработкой клеток каспазным ингибитором QVD совместно с циклогексимидом. Однако и в этом случае мы наблюдали падение уровня проформы каспазы-2. Когда же была заблокирована протеасомная деградация ингибитором MG-132, то наблюдалось полное восстановление уровня проформы каспазы-2 сравнимое с контролем. Таким образом, можно сделать вывод о том, что каспаза-2 подвергается протеасомной, но не аутофагической деградации. Для того, чтобы дополнительно проверить гипотезу о том, что деградация каспазы-2 происходит не за счет аутофагии, нами был поставлен эксперимент в условиях стимуляции аутофагии за счет ограничения питательных веществ. Было показано, что в условиях ограничения питания убиквитинилирование каспазы-2 приводит к ее протеосомной, но не аутофагической деградации. Однако роль белка р62 оставалась неясной в данном процессе. Необходимо было изучить, опосредует ли р62 деградацию каспазы-2 или выполняет какую-то другую функцию. Для исследования данного вопроса мы провели оверэкспрессию плазмиды р62 в клетках линии U1810 wt и U1810 ATG13KO. При оверэкспрессии р62 наблюдалось падение уровня проформы каспазы-2 и существенное накопление расщепленного фрагмента каспазы-2 р19. При этом обработка клеток QVD не приводила к полному восстановлению проформы каспазы-2. При комбинаторной обработке QVD и MG-132 уровень проформы каспазы-2 практически полностью восстанавливался. Таким образом, можно заключить, что оверэкспрессия р62 приводила к активации каспазы-2. Для того, чтобы убедиться в том, что при оверэкспрессии каспазы-2 происходит активация каспазы-2 нами был поставлен эксперимент по измерению активности каспазы-2 в клетках, трансфицированных плазмидой р62. Данный анализ показал, что оверэкспрессия р62 приводит к увеличению активности каспазы-2. Исходя из полученных нами результатов мы предполагаем, что каспаза-2 подвергается убиквитинилированию, уровень которого повышается в условиях генотоксического стресса, а также при ингибировании протеасомной деградации. Можно предположить, что р62 связывается с каспазой-2 именно посредством моно- или полиубиквитина и направляет её на протеасомную деградацию. Однако при этом в случае большой представленности р62 в клетке или усиленном убиквитинилировании каспазы-2 происходит интенсивное взаимодействие р62 и каспазы-2 через убиквитин, что приводит к олигомеризации каспазы-2 и её последующей активации. Другим аспектом роли исследования роли каспазы-2 в гибели опухолевых клеток при действии химиотерапевтических препаратов стало изучение роли данного фермента в детекции повреждений ДНК. В сайтах повреждения ДНК накапливаются белки, ингибирующие экспрессию генов путем связывания с факторами транскрипции, и факторы ремоделирования хроматина, привлекающие комплекс MRN к месту разрыва цепи ДНК. Комплекс MRN играет важную роль в первоначальной детекции двухцепочечных разрывов в ДНК перед репарацией. MRN комплекс, в свою очередь, привлекает к месту разрыва киназы АТМ, АТR и DNA-PK, что ведет к фосфорилированию по остатку Ser139 гистона H2AX, что является одним из главных маркеров повреждения ДНК. Поскольку ранее нами было показано, что уровень каспазы-2 коррелирует с уровнем фосфорилирования гистона H2AX, то мы исследовали потенциальное влияние каспазы-2 на работу комплекса MRN. В эксперименте была проанализирована активность ключевого компонента MRN комплекса - белка Nbs1. При индукции генотоксического стресса различие в уровне фосфорилирования Nbs1 между клетками дикого типа и нокаутными по каспазе-2 не было детектировано, что говорило об отсутствии влияния каспазы-2 на работу этого комплекса. Таким образом, по-видимому, каспаза-2 не участвует в процессе обнаружения разрывов ДНК комплексом белков MRN. Поскольку было показано, что каспаза-2 не влияет на активацию комплекса MRN, ответственного за детекцию разрывов ДНК, было выдвинуто предположение, что каспаза-2 может непосредственно взаимодействовать с Н2АХ и влиять на фосфорилирование данного гистона. С помощью метода аффинной хроматографии была выделена каспаза-2 из клеток, ее анализ показал, что данной белок не взаимодействует с гистоном Н2АХ. Таким образом, каспаза-2 влияет на фосфорилирование гистона Н2АХ не через непосредственное белок-белковое взаимодействие. Для того, чтобы определить является ли важной каталитическая функция каспазы-2 для фосфорилирования Н2АХ в клетках HEK293T были оверэкспрессированы конструкции, кодирующие каспазу-2 дикого типа или мутантную с заменами, блокирующими работу активного центра. Было показано, что уровень накопления фосфорилированной формы Н2АХ не отличается в клетках, экспрессирующих каспазу-2 дикого типа или мутантную. Таким образом, мы заключили, что влияние каспазы-2 на фосфорилирование Н2АХ не связано с каталитической функцией данного белка. На основании проведенных исследований был сделан вывод, что каспаза-2 не влияет на активацию комплекса MRN и не взаимодействует напрямую с Н2АХ. Однако наши эксперименты снова подтвердили зависимость уровня фосфорилирования Н2АХ от каспазы-2.