Простагландин-H-синтаза: исследование нового механизма ингибирования димерного фермента и целенаправленный поиск необратимых ингибиторов нового типаНИР

Prostaglandin-H-synthase: research of the new mechanism of dimeric enzyme's inhibition and direct search of the new type of irreversible inhibitors

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 11 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Простагландин-H-синтаза: исследование нового механизма ингибирования димерного фермента и поиск новых ингибиторов
Результаты этапа: Осуществлено исследование кинетики мембранного фермента PGHS в водно-мицеллярной среде. Учтено распределение субстратов между водной и мицеллярной фазами, получены истинные значения констант Михаэлиса для арахидоновой кислоты и для растворенного кислорода как для мицеллярной, так и водной фаз, оценены значения коэффициента распределения арахидоновой кислоты между гидрофобной фазой и активным центром PGHS и коэффициента распределения арахидоновой кислоты между мицеллярной и водной фазами. Показано, что изменение содержания мицеллярной фазы влияет и на скорость связывания ингибитора с ферментом, и на эффективность ингибирования в равновесных условиях. Проведено углубленное исследование кинетических механизмов взаимодействия ингибиторов (индометацина, ибупрофена, диклофенака, кеторолака) с PGHS с учетом влияния ингибиторов на кинетику инактивации фермента в процессе реакции. Определяли начальную скорость циклооксигеназной реакции, константу скорости инактивации в процессе реакции и предельный выход продукта реакции, степень обратимости действия ингибиторов. Определены равновесные и кинетические константы. Показано, что, замедляя начальную скорость реакции, различные ингибиторы по-разному влияют на константу скорости инактивации и предельный выход продукта реакции. Диклофенак симбатно снижает начальную скорость и предельный выход продукта реакции, кеторолак и индометацин снижают начальную скорость реакции, но почти не изменяют предельный выход продукта реакции, а ибупрофен и напроксен в низкой концентрации снижают начальную скорость реакции, но повышают предельный выход продукта реакции. Построены теоретические модели ферментативного катализа для простагландин-H-синтазы с учётом кооперативности, многосубстратности, инактивации и бифункциональности фермента. Разработан и апробирован метод определения непрерывной зависимости константы скорости инактивации и числа оборотов фермента от концентрации субстрата путем анализа интегральных кинетических кривых накопления продукта ферментативной реакции, позволяющий разделить процессы инактивации фермента и расходования субстрата. Отработана методика поиска потенциальных ингибиторов PGHS методом докинга. Проведено сравнение результатов докинга при использовании программ AutoDock и SOL, и показано, что программа SOL более эффективно отделяет ингибиторы от неингибиторов. Проведён докинг веществ из базы данных ACB Blocks (6150 соединений) с помощью программы SOL. 9 соединений, показавших потенциально наибольшее сродство с PGHS, проверены экспериментально с PGHS-1 из везикулярных желез барана. Для 3 из них ингибирующее действие подтверждено. Все они оказались «быстрыми» и обратимыми ингибиторами.
2 11 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Простагландин-H-синтаза: исследование нового механизма ингибирования димерного фермента и поиск новых ингибиторов
Результаты этапа: Проведено подробное исследование кинетических механизмов взаимодействия фермента PGHS с такими ингибиторами, как флурбипрофен, кетопрофен, фенопрофен и толметин. Определены равновесные и кинетические константы. Проанализировано влияние вышеперечисленных ингибиторов, а также таких ингибиторов, как напроксен, ибупрофен, индометацин, диклофенак, кеторолак, и новых ингибиторов, найденных ранее по итогам скрининга базы данных ACB Blocks и проверки in vitro, на инактивацию фермента в процессе циклооксигеназной реакции. Исследован обнаруженный нами парадоксальный эффект повышения предельного выход продукта циклооксигеназной реакции на фоне уменьшения начальной скорости в присутствии напроксена, ибупрофена, нового ингибитора DHT-5027, фенопрофена, толметина. Для других исследованных ингибиторов такой эффект не наблюдается. Продемонстрировано влияние присутствия ингибитора циклооксигеназной реакции на интегральную кинетику катализируемой PGHS-1 пероксидазной реакции (повышение предельного выхода продукта реакции на фоне отсутствия влияния на начальную скорость). В рамках анализа конвергенции кооперативной и гетерогенной моделей взаимодействия фермента с ингибиторами получены в общем виде численные соотношения между кинетическими константами, при соблюдении которых обе эти модели одинаковым образом описывают экспериментальные данные. Разработана и апробирована в случае индометацина и диклофенака методика титрования ингибиторами для определения концентрации центров связывания в препарате PGHS. По результатам докинга осуществлена кластеризация выборки из 31 ингибитора на основании взаимодействий с активным центром фермента. Показано, что данная кластеризация потенциально обладает предсказательной силой, поскольку ее результаты коррелируют со строением исследуемых ингибиторов и с их кинетическими свойствами. Автоматизирована процедура поиска новых ингибиторов in silico. Определены важные для проведения докинга наиболее подвижные аминокислотные остатки в активном центре фермента. Создана и размещена в свободном доступе в интернете программа PDBParser для упрощения подготовки структур к докингу и для анализа результатов докинга. Произведён докинг выборки размером 136 000 веществ из базы ZINC, в результате чего были отобраны 300 новых потенциальных ингибиторов.
3 11 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Простагландин-H-синтаза: исследование ингибирования в ходе реакций, роли гема в ингибировании, проявлений кооперативности
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".