ИСТИНА

Дифференцировка клеток является одним их ключевых процессов, определяющих развитие организма. Известно, что при дифференцировке меняется структура хроматина, что связано с изменением паттерна работающих генов в дифференцирующейся клетке. Мультибелковый комплекс SWI/SNF, ремоделирующий хроматин, играет важную роль в контроле транскрипции генов эукариот. Взаимодействуя с другими транскрипционными факторами, он определяют активность генов, экспрессирующихся в данный момент на данной стадии развития. Основной целью нашего проекта является выявление роли замены изоформ белка PHF10 в комплексе SWI/SNF в процессе дифференцировки клеток. Транскрипционный фактор PHF10 и его гомолог у дрозофилы были открыты в нашем коллективе. Было показано, что белок играет важную роль в развитии организма эукариот. Также было показано, что он играет важную роль в привлечении комплекса SWI/SNF на хроматин. Показано, что в клетках млекопитающих PHF10 экспрессируется в виде четырех изоформ, отличающихся доменной структурой. Изоформы альтернативно включаются в комплекс SWI/SNF и имеют разные функции. Видимо, это обусловлено тем, что разные изоформы участвуют в привлечении SWI/SNF на различные гены. По предварительным данным различные изоформы PHF10 оказывают разное влияние на свойства клеток: на пролиферацию и подвижность и прикрепление клеток к субстрату.

Cellular differentiation of is one of the key processes of development. The structure of chromatin is changing during differentiation, which is determined by the alterations in the pattern of active genes. The multi-protein chromatin remodeling complex SWI/SNF plays an important role in the control of transcription of eukaryotic genes. It interacts with other transcription factors, and determines the activity of genes which are expressed at particular stage of development. The main goal of our project is to identify the functions of isoforms of PHF10 subunit of SWI/SNF and the role of their replacement in the complex in the process of cell differentiation. The transcription factor PHF10 as well as its Drosophila homologue was discovered and described in our laboratory and has been shown to play an important role in eukaryotic development. It has also been demonstrated that PHF10 is essential for recruitment of the SWI/SNF complex to chromatin. In mammalian cells, PHF10 is expressed as four isoforms differing by their domain structure. PHF10 isoforms are alternatively incorporated in the SWI/SNF complex. They have different functions in gene regulation apparently due to the fact that different isoforms are involved in attracting SWI/SNF to the distinct pools of genes. According to our preliminary data, PHF10 isoforms have different effect on such properties of cells as proliferation, mobility and attachment of cells to the substrate. In this project we plan to solve several tasks: (1) to reveal the effect of SWI/SNF complex containing different PHF10 isoforms on gene expression during differentiation; (2) to determine the role of the individual isoforms of PHF10 in the processes associated with cell differentiation: the proliferative status of the cell, its adhesive properties, mobility and cell death; (3) identify factors affecting the replacement of one isoform of PHF10 to another in the SWI/SNF complex.

В конце первого года мы изучим, как качественно и количественно меняется состав SWI/SNF комплекса и как это влияет на экспрессию специфических генов и генов клеточного цикла на двух моделях дифференцировки: 1. Мы выясним субъединичный состав комплексов SWI/SNF при нейродифференцировке, подтвердим или опровергнем взаимодействие комплексов SWI/SNF, содержащих короткие изоформы PHF10 с субъединицами TFIID комплекса. 2. Выясним, в каких отделах головного мозга взрослой мыши и в каких клетках короткие изоформы PHF10 имеют максимальную экспрессию 3. Выясним, на каких генах локализуются комплексы SWI/SNF, содержащих короткие изоформы PHF10, и привлекаются ли на промоторы этих генов TFIID общий фактор транскрипции и РНК полимераза II Таким образом, мы поймем, как субъединичный состав SWI/SNF комплексов влияет на экспрессию генов при нейродифференцировке 4. Мы выясним качественный и количественный состав SWI/SNF комплекса при миелоидной дифференцировке на модельной линии HL60 и сравним с конечно дифференцированными нейтрофилами здоровых доноров. 5. Определим, участвуют ли SWI/SNF комплексы, содержащие PHF10, в активации специфических для нейтрофилов генов, а также генов клеточного цикла – P21 и циклина Е1. Определим локализацию SWI/SNF комплексов на этих генах. Таким образом, мы поймем, меняется ли состав SWI/SNF комплексов при миелоидной дифференцировке, а также участвуют ли SWI/SNF комплексы, содержащие PHF10 в активации специфических генов нейтрофилов.

Для выполнения данной работы у нас имеется: 1. Ранее полученные и охарактеризованные нами антитела к субъединицам SWI/SNF комплекса BAF155, BRG1, BAF200, BAF180, BRD7, TAF5, PHF10. 2. Праймера для измерения экспрессии этих субъединиц, маркерных генов миелоидной дифференцировки CD66a/b/d, генов клеточного цикла P21, P27, Cyclin D1, Cyclin E1, 3. Плазмидные конструкции FLAG-PHF10i-pcDNA

Уровень транскрипции изоформ в клетке является основным фактором, обуславливающим их включение в ремоделирующий комплекс PBAF. 1. Факторы сигнального пути FGF влияют на многие клеточные процессы и являются мощными стимуляторами пролиферации. За 2018 и 2019 годы работы мы показали, что PHF10-P изоформы способствуют прогрессии клеточного цикла. При нокдауне изоформ PHF10 клетки накапливаются в G0/G1 стадии. Также мы наблюдали стимулирование транскрипции PHF10 при обработке клеток фактором роста фибробластов FGF. В ходе данной работы мы планируем выяснить роль FGF сигнального каскада на транскрипцию изоформ PHF10 и установить транскрипционные факторы сигнального каскада FGF, отвечающие за переключение транскрипции изоформ PHF10. После связывания FGF с соответствующим рецептором на поверхности клетки, происходит передача сигнала на внутреннюю часть рецептора и сигналинг может пойти по четырем направлениям: 1. Активация JAK киназы и, как следствие, транскрипционного фактора STAT; 2. Активация фосфолипазы С – PLC; 3. Активация фосфатидилинозитол-3 киназы PI3K и Akt киназ; 4. Активация MAPK/Erk. С помощью комбинации ингибиторов соответствующих ветвей каскада мы установим, какие факторы FGF сигналинга являются наиболее значимыми в регуляции транскрипции той или иной изоформы PHF10. Мы определим время, необходимое для увеличения транскрипции изоформ PHF10 не менее, чем в два раза. 2. Затем мы изучим влияние данных FGF факторов на экспрессию изоформ PHF10 более подробно: 2.1 Одним из предполагаемых факторов является сMYC. Мы клонируем cMYC и остальные факторы в плазмиду pSLIK с индуцируемой DOX экспрессией и далее вестерн-блоттингом и количественной ПЦР измерим непосредственное влияние этих факторов на транскрипцию PHF10. Мы определим время через которое происходит значимое увеличение транскрипции PHF10 (увеличение уровня мРНК изоформ более чем в два раза). Таким образом, мы определим динамику экспрессии тех или иных изоформ PHF10 под действием разных FGF факторов. 2.2 С помощью специфических ингибиторов определенных факторов (если таковые существуют), как например 10058-F4 для ингибирования cMYC, мы подтвердим влияние cMYC и других FGF-факторов в режиме loss of function. Транскрипция изоформ PHF10 должна падать в данном эксперименте. Таким образом, мы подтвердим и уточним, что именно эти факторы влияют на экспресcию изоформ PHF10. 3. Далее мы изучим динамику привлечения FGF-факторов и cMYC на промотор гена PHF10. 3.1 Мы определим консенсусы транскрипционных факторов в области промотора PHF10. 3.2 Выполним хроматиниммунопреципитацию с помощью антител к эндогенном факторам при активации FGF или с помощью антител к FLAG-эпитопу к рекомбинантным факторам при активации DOX на стабильно трансформированных фибробластах и линиях A375. Мы определим время и степень привлечения фактора на промотор PHF10. Сделаем выводы о важности того или иного фактора в активации PHF10. Полученные данные мы опубликуем в журнале Q1.