Изучение генетической организации генома растенийНИР

The study of the genetic organization of the plant genome

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Изучение генетической организации генома растений
Результаты этапа: Исследования 2021 г были направлены на изучение функции генов Arabidopsis thaliana, которые играют важную роль в стабильном поддержании направления детерминации клеток при развитии листа. Осуществлен анализ транскрипции ряда генов, вовлеченных в эпигенетические модификации в растениях дикого типа и мутанта tae, анализ транскрипции основных генов стволовости (ген WUS и гены KNOX-семейства класса I – KN1/BP, KN2, KN6, STM) в листьях мутанта и дикого типа (ДТ) на разных стадиях онтогенеза. Охарактеризованы особенности пролиферации клеток листа с использованием мутантной линии, содержащей трансген CycB1;1:GUS. Проведена оценка способности к каллусогенезу и регенерации листовых эксплантов in vitro и проанализирована транскрипция генов стволовости в каллусах (на среде каллусогенеза и среде регенерации) и картирование геновУстановлено, что в регуляции эпигенетического репрограммирования генома и плюрипотентности клеток важную роль играет организменный контроль и клеточные взаимодействия. Эволюция цветка и соцветия у Бобовых, как и у других цветковых растений, связана с изменениями генотипа (мутации в конкретных генах, контролирующих морфогенез) и содержания ДНК в ядре. Изменения в размере генома, вероятно, влияют на длительность жизненного цикла и опосредованно канализируют преобразования в строении репродуктивных структур. Исследования модельного объекта, гороха посевного, показывают, что количественные признаки цветка имеют сравнительно высокую наследуемость. Признаки строения нектарников у Бобовых высоко консервативны в эволюционном плане.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Изучение генетической организации генома растений
Результаты этапа: Объектом исследований служили экотипы арабидопсис Col и Bla, уникальный мутант из коллекции кафедры генетики МГУ, который характеризуется конститутивной активацией ФЭК, а также инбредные линии (7 и 8-ое возвратное скрещивание) и линии полученные путем ауткроссинга. Для выделения РНК использовали молодые листья растений мутанта и дикого типа (ДТ), выращенных при температуре 22°–24°С. Эксперимент проводили в 4-х повторностях. Секвенирование библиотек РНК осуществляли в ЦКП Сколково.Анализ дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) выявил у мутанта более 3400 генов с повышенной экспрессией по сравнению с ДТ и более 2000 генов – со сниженной. Среди дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) с повышением экспрессии у мутанта более чем в 2 раза (log2FoldChang >1) выявлено обогащение генами, ответа на биотические и абиотические стрессовые воздействия, поранения, воздействие бактериальных и грибных патогенов, засоление, окислительный стресс, а также генов, связанных с действием «стрессовых» гормонов (жасмоновая кислота, салициловая кислота) и пр. В том числе, выявлено 76 активированных генов иммунного ответа (прежде всего - гены TIR-NBS-LRR, TIR-NBS, CC-NBS-LRR-классов), PR -гены (включая гены PR1, PR4, PR5 и 7 генов дефензинов, гены хитиназ и ингибиторов трипсина и др.). Наблюдается и повышение транскрипции генов метакаспаз MC2 и MC8, а также EDS1 и PAD4, которые действуют вместе в контроле защитного ответа и запуска программы клеточной смерти. Выявлено изменение уровня транскрипции многих генов - эпигенетических регуляторов. Среди них гены гистоновых деацетилаз (HDA10, HDA17, HDT4), ДНК-гликозилаз (ROS1, DML3), гистоновых H3K9–метилтрансфераз SUVR2 и SUVH5, ген ATXR6/ SDG34 H3K27me1–метилтрансферазу, ген гистоновой ацетилазы HAF2, РНК-зависимой РНК-полимеразы RDR1, ген AGO3, 4 локуса tasiRNA TAS1a, TAS1b, TAS2, TAS3) и др. Выявленные изменения транскрипции генов, контролирующих эпигенетические модификации ДНК и гистонов, подтвердили наличие процессов эпигенетического перепрограммирования генома, которые лежат в основе ФЭК и, судя по изменению транскриптома, являются следствием аутоиммунитета. С использованием толуидинового голубого красителя подтверждено наличие гибели клеток в листьях мутанта с конститутивным проявлением ФЭК. Листья арабидопсиса кипятили в растворе для окрашивания трипановым синим (0,02 г трипанового синего, 8% фенола, 8% глицерина, 8% молочной кислоты, 8% воды, 95% этанола) и затем обесцвечивали в хлоралгидрате (2,5 г хлоралгидрата растворяли в 1 мл дистиллированной воды) в течение ночи. Исследования выявили запуск программы клеточной смерти в листьях мутанта, что соответствует данным о проявлении в листьях мутанта конститутивного иммунного ответа. Важным результатом явилось обнаружение колокализации на листьях участков гибели клеток и клеток, проявляющих плюрипотентность. Эти данные подтверждают наличие причинно-следственной связи между гибелью клеток, которая является проявлением аутоиммунитета, и активацией регенерационных процессов у мутанта in vivo. Созданы библиотеки ДНК для секвенирования 5 геномов арабидопсис, полученных на основе пулов ДНК растений, имеющих разный фенотип. Для создания пулов использовали растения из специально созданных нами гибридных популяций, полученных в результате инбридинга и ауткроссинга. В ЦПК Сколково осуществлено секвенирование геномов, что необходимо для дальнейшего поиска генов, контролирующих факультативную эпигенетическую регуляцию развития растений на последующих этапах исследований. Материалом для исследования на бобовых растениях были мутанты различных видов Бобовых. Изучены цветки мутантов гороха посевного (Pisum sativum) с нарушениями дифференцировки тычинок (stamina pistilloida-1, superpetaloidum, двойные мутанты stp-1 sup), лепестков (сорт Анвенд с аномально симметричными лепестками-крыльями, мутант keeled wings), комплексными нарушениями (bivexillum, cochleata, unifoliata-tendrilled acacia). В исследование включены мутанты каяна (Cajanus cajan) с нарушениями дифференцировки лепестков (partial cleistogamy, lanceolate). Также проанализирована структура нектарников у «махровых» садовых форм клитории (Clitoria ternatea var. pleniflora) и глицинии (Wisteria floribunda f. violaceoplena). Во всех случаях контролем служили нормальные цветки тех же видов. Использована сканирующая электронная микроскопия. Локализация нектарников в цветках Крестоцветных и Бобовых различна. У резуховидки нектарники расположены кнаружи от тычинок, у Бобовых – на цветоложе или гипантии между тычинками и плодолистиком, причем зачастую только с абаксиальной стороны. Показано, что нектарники отсутствуют в цветках мутантов coch гороха. Это хорошо согласуется с тем, что ген COCH гороха ортологичен генам BLADE-ON-PETIOLE1/2 A. thaliana, которые участвуют в регуляции развития цветковых нектарников. У «махровой» формы клитории происходит перенос программы развития с адаксиального лепестка (флага) на все остальные. В результате наблюдается не только развитие пяти одинаковых лепестков, но и несращение тычинок; цветок становится актиноморфным. Также исчезает гребневидный вырост цветоложа, который в цветках клитории дикого типа обычно интерпретируют как нектарник. У прочих исследованных нами мутантов цветковые нектарники (секреторные устьица на цветоложе и/или гипантии) есть, хотя их размер может быть уменьшен. Эти результаты являются первыми данными относительно генетической регуляции развития цветковых нектарников у Бобовых. Подтверждение находит идея о том, что значительные эволюционные преобразования структуры околоцветника и андроцея (сращение, редукция, изменение симметрии, полимеризация и пр.) не влияют на наличие нектарников в цветке. Исчезновение предполагаемых нектарников при адаксиализации околоцветника в цветке клитории демонстрирует, что перенос программы развития (гомеозис) обладает ограниченным потенциалом в эволюции симметрии цветка. Связь между симметрией цветка и морфологией нектарников существует не только в эволюционных масштабах (как результат отбора), но и на регуляторном уровне: некоторые изменения происходят синхронно. Можно предположить консервативность основных путей генетической регуляции развития цветковых нектарников у покрытосеменных (по крайней мере, в кладе rosids, к которой принадлежат и Крестоцветные, и Бобовые). Однако у Бобовых контроль развития нектарников тесно связан с симметрией цветка, предположительно контролируемой ортологами гена CYCLOIDEA, первоначально описанного у львиного зева (Antirrhinum majus).
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Изучение генетической организации генома растений
Результаты этапа: С целью поиска новых генов, вовлеченных в факультативную эпигенетическую регуляцию развития растений, осуществлено секвенирование и биоинформатический анализ 5 геномов специально созданных гибридных популяций арабидопсис. Эти популяции отличались по проявлению способности к репрограммировани. эпигенома и изменению клеточной идентичности. Для каждого образца генома было получено от 68,7 млн до 78,5 млн уникально картированных высококачественных чтений, а общий объем секвенированнных данных составил около 360н чтений. В течение ряда лет исследована урожайность семян гороха (Pisum sativum L.). Основное внимание уделено числу семяпочек и размеру цветка. Дефицит воды и тепловой стресс снижают урожайность семян гороха как из-за абортирования семян, так и из-за развития меньшего количества семяпочек.
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Изучение генетической организации генома растений
Результаты этапа: Исследования 2024 г были направлены на изучение функции генов PARG1 и EXA1 модельного растения Arabidopsis thaliana (L.) Heynh в контроле иммунного ответа. Объектом исследования были растения двойного мутанта арабидопсис parg1 exa1 из коллекции кафедры генетики, характеризующегося уникальным фенотипом. С одной стороны, растения демонстрировали признаки аутоиммунитета (смерть клеток по краю листовой пластинки), а с другой – характеризовались приобретением клетками зрелого листа плюрипотентности и способность к регенерации нового края листа, что никогда не наблюдалось у аутоиммунных форм растений. В связи с необычным фенотипом в данной работе проведен углубленный анализ транскриптома молодых листьев мутанта и дикого типа. У мутанта обнаружено повышение уровня экспрессии всех основных компонентов иммунного ответа, включая гены Са2+ проводящих каналов, НАДФН-оксидаз, генов синтеза салициловой кислоты, жасмоновой кислоты и многие другие. Полученные данные свидетельствуют о том, что гены PARG1 и EXA1, контролирующие уровень поли(АДФ-рибозилирования) и процесс нонсенс-опосредованной деградации РНК, соответственно, являются новыми важными регуляторами иммунного ответа. Их функция необходима для предотвращения чрезмерной активации защитных систем в растениях.
5 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Изучение генетической организации генома растений
Результаты этапа: NИсследования 2025 г были направлены на изучение влияния процессов поли(АДФ-рибозилирования) и нонсенс-опосредованной деградации РНК на плюрипотентность клеток растений. Эта связь обнаружена на животных моделях и клетках человека (см. последний обзор Karpova et al., 2025). Однако у растений изучение этих вопросов не проводилось. Объектом нашего исследования были растения модельного вида Arabidopsis thaliana (L.) Heyn из коллекции мутантов, созданных на кафедре генетики МГУ. Линия содержала мутации в генах PARG1 и EXA1, контролирующие уровень поли(АДФ-рибозилирования) и процесс нонсенс-опосредованной деградации РНК, соответственно (Kupriyanova et al., 2023). Листья двойного мутанта демонстрировали возврат части клеток листа к плюрипотентному состоянию, которое выражалось в способность к регенерации нового края листа, возобновлению делений и экспрессии генов плюрипотентности (Kupriyanova et al., 2023; Куприянова и др., 2021). Такой необычный фенотип указывает на то, что двойной мутант из нашей коллекции является уникальный моделью для анализа влияния процессов поли(АДФ-рибозилирования) и нонсенс-опосредованной деградации РНК на свойство плюрипотентности растительных клеток и регенерационные способности. Для изучения механизмов, инициирующих перепрограммирование клеток под влиянием мутаций parg1 exa1, исследовали транскриптом молодых листьев растений дикого типа и мутанта на стадии, когда проявления плюрипотентности на морфологическом уровне у мутанта еще не были видны, но были заметны признаки клеточной смерти (КС). Поскольку КС может вызываться разными причинами и иметь разные последствия (включая КС, активирующую регенерационные процессы), проведен анализ типа КС у мутанта по маркерам разных типов КС. В связи с тем, что у растений основными регуляторами экспрессии генов плюрипотентности считаются гормоны, исследовали также изменения экспрессии генов синтеза, транспорта гормонов и генов гормональных сигнальных путей в транскриптоме мутанта по сравнению с диким типом. Установлено, что КС в листьях мутанта связана как с процессами развития, так и с активацией защитного ответа. Исследования выявили значительные изменения гормонального гомеостаза у двойного мутанта, которые были наиболее выражены для ауксина. Изменение ауксинового гомеостазы, выявленные в транскриптоме, подтверждены результатами изучения экспрессии трансгена DR5-GUS в листьях растений дикого типа и двойного мутанта, показавшего температуро-зависимое накопление ауксина в листьях мутанта. Полученные результаты свидетельствуют о том, что активация регенерационных процессов и возврат к плюрипотентному состоянию клеток мутанта являются результатом изменения гормонального гомеостаза. ne

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".