ИСТИНА

Изучить роль митохондрий, а именно митохондриальных АФК, митохондриального мембранного потенциала, митохондриального STAT3 и динамики митохондрий в процессах активации тучных клеток.

Mast cells (MCs) play a key role in the regulation of innate and adaptive immunity and involved in pathogenesis of many inflammatory and allergic diseases. Thus investigation of mechanism of MCs activation is an important scientific and medical problem. Increasing evidence indicates that dynamics of mitochondria is involved in MCs degranulation. Based on our previous and literature data we suggest that reactive oxygen species, mitochondrial membrane potential and STAT3 localized in the mitochondria can regulate MCs degranulation by controlling mitodynamics. To test this suggestion we will investigate the effects of recently developed mitochondria-targeted compounds functioning as antioxidants, uncouplers of oxidative phosphorylation and inhibitors of STAT3 on mitochondrial fragmentation and translocation during MCs activation. Also we will study the anti-allergic properties of the most effective mitochondria-targeted compound in mice models of passive systemic anaphylaxis and atopic dermatitis. The project results will expand the fundamental understanding of the role of mitochondria in the activation of MCs. It will also contribute to the rationale for development of mitochondrial-targeted drugs in the treatment of allergic diseases

Мы ожидаем, что в ходе выполнения проекта мы подтвердим нашу гипотезу о том, что митохондриальные АФК, трансмембранный потенциал и STAT3 могут регулировать активацию тучных клеток путем влияния на фрагментацию и транслокацию митохондрий. Мы изучим молекулярные механизмы митохондрий-зависимой активации тучных клеток. Кроме того мы протестируем противоаллергические свойства наиболее эффективных митохондриально-направленных соединений. Полученные данные расширят фундаментальные представления о роли митохондрий в активации тучных клеток, а также внесут вклад в обоснование потенциального применения исследуемых нами митохондриально-направленных соединений в терапии аллергических заболеваний, в частности атопического дерматита.

Наша лаборатория ведет исследования в области изучения роли митохондрий в провоспалительной активации клеток.Длительный прием митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1 приводил к уменьшению воспалительной активации эндотелия в аортах старых мышей.В модели системного воспалительного ответа у мышей, индуцированного внутривенным введением TNF, SkQ1, а также разобщители окислительного фосфорилирования динитрофенол и C12TPP предотвращали гибель животных.В то же время на модели каррагинан-индуцированного воспаления в «воздушном мешке» у мышей был продемонстрирован противовоспалительный эффект SkQ1, но не C12TPP.При этом противовоспалительный эффект заключался, главным образом, в снижении лейкоцитарной инфильтрации.На культивируемых эндотелиальных клетках было показано, что SkQ1, наряду с классическими антиоксидантами и разобщителями окислительного фосфорилирования снижали вызванную TNF секрецию провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8 и экспрессию молекул адгезии, что приводило к уменьшению адгезии нейтрофилов к монослою эндотелия. При этом по-видимому, основной молекулярный механизм подавления провоспалительной активации связан с тем, что С12ТРР, и SkQ1 подавляют фосфорилирование ингибирующей субъединицы NFkB, IkBa, и ее протеолиз. В отличие от SkQ1 С12ТРР не предотвращал апоптоз эндотелиальных клеток под действием TNF. Как в модели in vitro, так и в модели in vivo нами было обнаружено снижение активации тучных клеток под действием митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1. Однако данных по возможному влиянию С12TPP на активацию тучных клеток на данный момент нет. Механизм ингибирующего влияния SkQ1 на дегрануляцию тучных клеток неизвестен. Имеются данные о том, что SkQ1 и C12TPP в низких концентрациях, при которых наблюдаются эффекты «мягкого разобщения», предотвращают фрагментацию митохондрий, что предположительно связано с уменьшением митохондриальных АФК.

В ходе первого года реализации проекта мы показали, что антиген-зависимая активация тучных клеток (ТК) линии RBL-2H3 сопровождается изменением митохондриального мембранного потенциала (ΔΨm), фрагментацией митохондрий и их транслокацией к плазматической мембране. Через 15 минут после стимуляции клеток антигеном наблюдалось снижение ΔΨm (на 20%), после чего начиналось его плавное увеличение. Через 30 минут после стимуляции клеток прирост ΔΨm составил 20% по сравнению с контролем. Было показано увеличение относительного содержания митохондриальной ДНК через час после стимуляции клеток антигеном. Полученные данные в целом указывают на то, что FcεRI-зависимая активация ТК сопровождается биогенезом митохондрий. Митохондриально-направленные соединения, проявляющие свойства антиоксидата (SkQ1) и разобщителя окислительного фосфорилирования (C12TPP), снижают антиген-зависимую дегрануляцию ТК, однако стимулируют выработку ими цитокинов. Однако эти соединения не влияли на ΔΨm и уровень митохондриальных активных форм кислорода в контрольных и стимулированных антигеном клетках RBL-2H3. Это может свидетельствовать о том, что действие исследуемых соединений в нашей модели не связано напрямую с их антиоксидантыми или разобщающими свойствами. Нами было показано, что SkQ1 и C12TPP, наряду с митохондриально-направленным антиоксидантом MitoTempo, предотвращают фрагментацию митохондрий в стимулированных клетках RBL-2H3, в то время как разобщитель FCCP индуцировал фрагментацию митохондрий еще до стимуляции клеток. Также мы обнаружили, что SkQ1 и C12TPP предотвращают активацию mTORC1-сигнального пути и увеличение содержания митохондриальной ДНК в стимулированных антигеном клетках RBL-2H3. Результаты наших экспериментов позволяют предположить, что SkQ1 и С12TPP могут ингибировать mTORC1-сигнальный путь при антиген-зависимой активации ТК. На основе литературных данных о роли mTORC1 в функционировании клетки, можно предположить что ингибирование mTORC1-сигналинга способно снижать дегрануляцию ТК путем ингибирования фрагментации митохондрий и их биогенеза, и в то же время усиливать продукцию цитокинов. Для исследования роли митохондриального STAT3 в антиген-зависимой активации ТК мы использовали митохондриально-направленные ингибиторы STAT3 – Mitocur-1 и Mitocur-3. Предобработка клеток RBL-2H3 с Mitocur-1 или Mitocur-3 снижала их антиген-индуцированную дегрануляцию. С помощью различных методов мы показали, что данные соединения вызывают фрагментацию митохондрий и митофагию. Все вместе эти данные указывают на то, что в основе ингибирующего эффекта Mitocur-1 и Mitocur-3 на антиген-зависимую дегрануляцию ТК может лежать процесс митофагии, в результате которого происходит уменьшение числа митохондрий.