Жаберные щели - загадка вторичноротыхНИР

Gill slits: a mystery of Deuterostomia

Соисполнители НИР

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Координатор

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2020 г.-26 декабря 2020 г. Жаберные щели - загадка вторичноротых
Результаты этапа:
2 1 января 2021 г.-28 декабря 2021 г. Жаберные щели - загадка вторичноротых
Результаты этапа: Получены новые, детальные данные о строении жаберного аппарата глубоководного кишечнодышащего нового вида Torquaratoridae (Quatuoralisia malakhovi n. gen. n. sp.). Выяснено, что у этого вида кишечнодышащих отсутствует буккальная полость, и ротовое отверстие ведёт непосредственно в жаберную глотку. Впервые у представителя торквараторид найдены такие структуры как перикардиальный целом и воротниковые целомодукты. При этом последние открываются не в первую пару жаберных щелей, как это организовано у всех мелководных кишечнодышащих, а непосредственно во внешнюю среду. Подобное соотношение жаберных щелей и воротниковых целомодуктов отмечено впервые для кишечнодышащих. Таким образом, строение жаберного аппарата исследуемой нами торквараториды близко к строению жаберного аппарата представителей другого класса полухордовых - Graptolithoidea (бывшие Pterobranchia). Эти данные заставляют пересмотреть гипотезы происхождения жаберного аппарата вторичноротых животных. Впервые реконструирован стебельковый скелет представителя торквараторид и показано, что у исследуемого вида он состоит из двух симметричных пластинок, в то время как у всех ранее исследованных представителей Enteropneusta он представляет собой единую структуру. Впервые у торквараторид обнаружены парные печёночные кровеносные сосуды, сопровождающие печёночные отростки и выполняющие распределительную функцию. Изучен состав содержимого кишечника изучаемой торквараториды, показано, что в нём крайне мало минеральных частиц, а основной объём кишечного содержимого представлен остатками диатомовых водорослей, планктонных инфузорий, губок и фекальных пеллетов других животных. Впервые обсуждена роль медиальной воротниковой губы торквараторид в процессе избирательного сбора пищи. Проведено исследование жаберного аппарата, кровеносных и целомических структур асцидии Molgula griffithsii. Сделана компьютерная 3D реконструкция исследуемых органов. Изучено строение кровеносных капилляров и целомических трубочек в составе жаберного аппарата и туники изучаемой асцидии. Впервые достоверно показана природа этих каналов: часть из них целомические, часть - гемоцельные, т.е. кровеносные капилляры. На основании полученных данных проведён сравнительно-анатомический анализ организации жаберного аппарата Deuterostomia как структуры, важной для понимания происхождения вторичноротых животных от исходно метамерного предка. Впервые прослежена судьба жаберных щелей и гомологичных им структур в кладе Ambulacraria. На основании показанной для кишечнодышащих метамерии жаберных структур (жаберных щелей, жаберных мешков и жаберных пор) впервые высказано предположение о гомологичности метамерных туловищных целомов Hemichordata соматоцельным целомическим кольцам Echinodermata и показано, что целомическая метамерия, свойственная, таким образом, всем Ambulacraria, вероятно унаследована ими от общего метамерного предка не только вторичноротых животных, но и вообще всех Bilateria. В ходе экспедиционных исследований на Белом море на базе Беломорской биологической станции МГУ собран и зафиксирован следующий материал: 16 экземпляров Molgula griffithsii (Tunicata, Ascidiacea), 9 экземпляров туникат Oikopleura vanhoeffeni (Tunicata, Appendicularia). В ходе работ на Чёрном море собраны и зафиксированы для исследования под трансмиссионным электронным микроскопом экземпляры головохордового Branchiostoma lanceolatum. Применялись следующие методики фиксации: (1) формалиновая фиксация для микроанатомического и гистологического исследования (8%-ный формалин на морской воде либо жидкость Буэна); для лучшего проникновения фиксатора сквозь тунику асцидий фиксатор вводился под тунику с помощью шприца; перед фиксацией животные выдерживались в проточном аквариуме для очищения кишечника от содержимого; (2) глютар-осмиевая фиксация для электронной микроскопии (2,5%-ный глютаровый альдегид и 1%-ный тетраоксид осмия - на морской воде и натрий-какодилатном буфере); впервые для данных объектов обе ступени двухступенчатой фиксации проведены без дополнительных реагентов по регулировке осмомолярности (без сахарозы и хлоридов); морская вода и 0,2М буфер брались в соотношении 1:1; фиксируемые экземпляры асцидий и ланцетников были разрезаны поперечно на две части для лучшего проникновения фиксатора, фиксация происходила в три смены: 15 минут, 1 час и затем окончательная фиксация (зафиксированный материал транспортировался в Москву в третьей смене фиксатора), отмывка от фиксатора производилась тем же буферным раствором, который использовался для приготовления фиксатора; (3) для гистологического изучения нового вида торквараторид Quatuoralisia malakhovi n. gen. n. sp. применялось три методики окрашивания: окраска гематоксилином по Каррачи (результаты опубликованы), окраска азаном по Гейденгайну, окраска по Массону с анилиновым синим (для лучшего окрашивания соединительнотканных структур - результаты подготовлены для отдельной публикации по строению жаберного аппарата торквараториды Quatuoralisia malakhovi n. gen. n. sp.); перед окрашиванием материал был переведён в 70%-ный этиловый спирт, затем обезвожен с помощью 96%-ного этанола, двух смен чистого бутанола и переведён в чистый ксилол, из которого залит в парапластовые блоки. Блоки порезаны на срезы толщиной 7 и 10 мкм с помощью ротационного микротома Leica RM 2125RTS (Leica Biosystems, Германия). Окрашенные гистологические срезы были обезвожены по такому же протоколу и помещены в заливочную среду (канадский бальзам). Эти же методы применены для гистологического изучения асцидии Molgula griffithsii. Микрофотографии гистологических срезов для публикаций и для компьютерной реконструкции были сделаны с помощью микроскопа Micmed-6 (LOMO, Санкт-Петербург, Россия, 2018) с цифровой камерой MC-12. Для каждого объекта были изготовлены серии срезов в поперечном, фронтальном и сагиттальном направлении; (4) для филогенетического анализа экземпляры Quatuoralisia malakhovi n. gen. n. sp. были зафиксированы в 96%-ном этаноле и хранились при температуре -20ºC. Использовалась ДНК двух экземпляров (самки и самца), ДНК экстрагировалась из фрагментов по 50 мг с использованием готового набора "DNeasy Blood & Tissue Kits" по протоколу производителя (Qiagen Inc., Valencia, CA). ПЦР-амплификации проводили в объёме по 20 мкл, в который было включено: 4 мкл 5x Screen Mix-HS (готовая к использованию ПЦР-смесь, Evrogen Lab, Россия), 0,5 мкл каждого праймера, 1 мкл геномной ДНК и 14 мкл деионизированной дистиллированной воды; извлечённую ДНК использовали в качестве матрицы для амплификации митохондриальной 16S рРНК (16S), для амплификации и секвенирования использовались следующие 16S праймеры: 16sarl (5’-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3’) и 16SBRH (5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’), продукты ПЦР секвенировали с использованием тех же праймеров и набора BigDye Terminator v.3.1. Kit (Applied Biosystems) на генетическом анализаторе ABI3500 в лаборатории "Evrogen", Россия; филогенетический анализ проводился с использованием Geneious 8.0.5 (Biomatters, Окленд, Новая Зеландия). Исходные данные 16S и общедоступные последовательности для других видов Ambulacraria из GenBank были согласованы с алгоритмом MuSCLE в программе MEGA7. Окончательное выравнивание 16S составило 629 bp; филогенетическая реконструкция была проведена методом максимального правдоподобия (Maximum Likelihood method), реализованным в MEGA X с 1000 бутстрэп-псевдорепликациями. Байесовская оценка апостериорной вероятности была выполнена в MrBayes 3.2; для анализа было использовано 50 миллионов MCMC-шагов; генетические расстояния (p-distance) были рассчитаны в MEGA X. Филогенетическое дерево было получено в программе Fig Tree Drawing Tool 1.4.3; (5) компьютерная 3D-реконструкция стебельковых структур торквараториды Quatuoralisia malakhovi n. gen. n. sp. проведена по фронтальной серии гистологических срезов; фотографии срезов были выровнены в программе AMIRA, версия 3.6.5; в этой же программе осуществлена реконструкция полости жаберной глотки, буккального дивертикула и скелетных элементов изучаемой торквараториды. Для реконструкции использовался стек из 63 срезов; для исследования торквараториды Quatuoralisia malakhovi n. gen. n. sp. с помощью СЭМ и ТЭМ (сканирующая и трансмиссионная электронная микроскопия, соответственно) впервые был использован материал, зафиксированный в 8%-ном формалине на морской воде, т.е. для гистологического, а не электронно-микроскопического исследования. Материал для изучения под СЭМ был обезвожен, высушен в критической точке с использованием СО2 (HCP-2 Critical Point Dryer, Hitachi, 1980) и напылён смесью золото-палладий (EIKO IB-3 Ion Coater, 1980), а затем исследован под СЭМ JSM-6380LA (JEOL, 2005) и Camscan-S2 (Cambridge Instruments, 1990); материал для изучения под ТЭМ был обезвожен в этаноле, затем в ацетоне, залит в эпоксидную смолу Epon и разложен на ультратонкие срезы толщиной 70-80 нм; срезы контрастировались уранил-ацетатом аммония в течение 60 мин. и цитратом свинца в течение 20 мин. (т.е. на 10 мин. дольше, чем по стандартному протоколу); подготовленный материал исследовался под ТЭМ JEOL-1011. По результатам исследований 2021 г. опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в базу WoS.
3 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Жаберные щели - загадка вторичноротых
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".