| 1 |
29 апреля 2019 г.-31 декабря 2019 г. |
Идентификация мРНК, зависимых от фактора трансляции DAP-5, и создание композитной бесклеточной системы трансляции |
| Результаты этапа: Идентифицирована целая серия мРНК, уровень трансляции которых зависит от наличия eIF4G2 (DAP5) в клетках млекопитающих HEK.Эти мРНК обладают достаточно длинными (>300 нуклеотидных остатков) 5’ нетранслируемыми последовательностями (НТО), хотя очевидно, что длина 5’ НТО является не единственной и вероятно не главной особенностью DAP5-зависимых мРНК. Все такие мРНК оказываются зависимыми и от канонического фактора eIF4G1.
Создана высоко чувствительная композитная бесклеточная система трансляции на основе клеточного экстракта из клеток HEK 293. Система необходима для того, чтобы воспроизвести феномен зависимости от DAP5 in vitro и, если это получится, использовать ее для выяснения как работает фактор DAP5 (eIF4G2) и какие у него взаимоотношения с партнерами, сходства и отличия от канонического фактора eIF4G1.
По второй теме проекта, проведено геномное редактирование клеточной линии Hek293F с введением HiBiT тэга на С-конец фактора eIF4G1. Полученный пул редактированных клеток стабильно экспрессирует эндогенный eIF4G1-HiBiT, что, вероятно, говорит о
полной функциональной активности измененного фактора инициации.Аналог eIF4G1, способный к флуоресценции, окажется на следующем этапе работы чрезвычайно удобным инструментом для исследования взаимоотношений этого фактора инициации трансляции с глицил-тРНК синтетазой (GARS)
|
| 2 |
9 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. |
Исследование функции фактора трансляции DAP-5 в композитной бесклеточной системе |
| Результаты этапа: После тщательного анализа экспериментальных подходов, использованных в 2019 году, мы решили изменить план работ, чтобы решить главную задачу проекта - выяснить функцию белкового фактора eIF4G2(DAP5) в инициации трансляции в клетках животных. И новый экспериментальный подход оказался очень продуктивным. Мы отобрали из данных литературы и своих собственных прошлых результатов те 5'нетранслируемые области мРНК (5'UTR), работа которых вроде бы зависела от наличия в клетках указанного фактора. Отобранные кандидатные 5'UTRs после соединения с репортерной флуоресцентной кодирующей последовательностью были дополнительно проверены (валидированы)на зависимость от DAP5 путем их трансфекции в клетки, истощенные (деплетированные)по этому фактору путем РНК-интерференции. Таким образом было отобрано порядка 10 разных 5'UTRs, работа которых сильно зависели от наличия DAP5 в клетках человека HEK 293. Наше внимание привлек тот факт, что ряд 5'UTRs имел довольно длинные так наз. upstream reading frames (uORFs ),которые, как известно, являются серьезным препятствием для сканирующих 40S рибосом для того, чтобы они могли достичь своих основных стартовых AUG кодонов. Установлено, что удаление AUG кодонов этих uORFs приводит к полному исчезновению зависимости от DAP5 (eIF4G2). Важно отметить, что все выбранные DAP5-зависимые мРНК были одновременно полностью зависимы от наличия кеп-структуры на их 5' концах. Это говорит о том, что DAP5 в этих мРНК включается в игру не с самого начала сканирования 5'UTRs, а позже, вероятнее всего при прохождении сканирующими комплексами uORFs. Предложен новый молекулярный механизм, объясняющий потребность в дополнительном факторе, т.е. в eIF4G2 (DAP5), для ряда мРНК, имеющих длинные uORFs, который мы назвали "механизмом смены лошадей". Согласно этому механизму, при прохождении uORFs сканирующие 40S рибосомы сталкиваются с 80S рибосомами, которые начали транслировать данную uORF. Это приводит к потере сканирующими комплексами исходного фактора eIF4G1, приобретенного ими на 5' конце молекулы мРНК, и замене его на фактор eIF4G2 (DAP5). Таким путем eIF4G2 спасает сканирующие 40S комплексы и позволяет им достичь основного стартового AUG кодона соответствующей мРНК. Это совершенно новый, никем и никогда неописанный механизм и поэтому соответствующая публикация готовится для публикации в высоко рейтинговом журнале. |
| 3 |
1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. |
Исследование функции фактора трансляции DAP-5 в композитной бесклеточной системе |
| Результаты этапа: |
| 4 |
19 мая 2022 г.-31 декабря 2022 г. |
Исследование функции фактора трансляции DAP-5 в композитной бесклеточной системе |
| Результаты этапа: |
| 5 |
1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. |
Исследование роли фактора инициации трансляции DAP5 в трансляции мРНК POLG |
| Результаты этапа: |
