ИСТИНА

Цель: изучение роли мембранных рецепторов прогестерона (мПР) в процессах пролиферации и апоптоза опухолевых клеток, в иммунных процессах, регулирующих сохранение беременности и развитие аутоиммунных заболеваний. Задачи 1. Изучение сигнальных путей – посредников действия активированных прогестероном или селективными лигандами мембранных рецепторов (мПР) на процессы пролиферации опухолевых клеток ВхРС3 аденокарциномы поджелудочной железы человека с высокими уровнями экспрессии мПР субтипов α и γ и отсутствием экспрессии ядерных рецепторов прогестерона (яПР). 2. Изучение эффектов и механизмов действия селективных лигандов мПР и прогестерона при активации мПР на апоптоз опухолевых клеток ВхРС3. 3. Изучение сигнальных путей и эффектов прогестерона и его аналогов, селективных в отношении мПР, на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток HepG2 гепатоцеллюлярной карциномы человека с высоким уровнем экспрессии мПР субтипа β и отсутствием экспрессии яПР. 4. Изучение экспрессии разных субтипов мПР в различных тканях и органах самок и самцов крыс. 5. Выявление роли мПР в процессах, регулирующих сохранение беременности. 6. Изучение эффектов селективных лигандов мПР и прогестерона в модели аутоиммунного заболевания на примере экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс. 7. Исследование влияния селективных лигандов мПР в сравнении с действием прогестерона на развитие опухоли в крысиной модели рака толстой кишки. Актуальность работы по изучению экспрессии мПР, регуляции их уровня, механизмов действия и эффектов селективных лигандов этих рецепторов связана с важной ролью мПР в опосредовании эффектов прогестинов на такие процессы в клетках, как изменение сократительной активности миометрия, регуляция пролиферации и апоптоза опухолевых клеток и их эпителиально-мезенхимального перехода, влияние на нервные клетки, регулирующие репродуктивное поведение. Также мПР являются главными посредниками в действии прогестерона на иммунную систему и, возможно, выполняют ключевую роль в регуляции этим стероидом процессов овуляции, имплантации эмбриона в эндометрий, сохранении беременности, поскольку все эти процессы связаны с локальным воспалением или подавлением воспаления. Действуя через мПР иммунных клеток, прогестерон влияет на выраженность симптомов аутоиммунных заболеваний. Следовательно, селективные лиганды мПР могут рассматриваться в качестве агентов для гормональной терапии опухолей, аутоиммунных заболеваний, для предотвращения преждевременных родов при нарушении нормального протекания беременности.

In 2003, a new class of receptor was first described – progesterone membrane receptor (mPR) of the adiponectin receptor family, of which 5 subtypes have now been identified. Classical nuclear progesterone receptors (nPRs), which are ligand-dependent transcription factors, were by this time well studied. It turned out that the effect of progestins (progesterone and its analogs) through different types of receptors is not only very different, but can be the opposite, as for example, the effect on the contractile activity of the myometrium. It is also suggested that progestins may exhibit the opposite effect on cell proliferation and apoptosis through different receptors. Therefore the search for selective ligands of a certain type of receptors is of great importance. To the best of our knowledge, there was only one study on the specificity of binding of different mPR ligands, which resulted in two selective ligands being found. We have studied the structure of the ligand binding pocket of mPR and identified two other selective ligands of these receptors, which practically do not interact with nPR. Their effects in immune cells were studied, which turned out to be similar to the effects of progesterone. The antiproliferative effect of progesterone and one of these selective ligands on human pancreatic adenocarcinoma BxPC3 cells was found. Another selective ligand demonstrated proapoptotic activity in these cells. The mediators of progestin action through mPR, as well as specific targets of this action were found. It was found that the p38 MAPK inhibitor significantly increases the suppression of viability of adenocarcinoma cells by the studied steroids and can be used simultaneously with them for tumor growth inhibition. It is important to note that progesterone did not affect the viability of healthy primary cortical neurons and human fibroblasts even in extremely high concentrations. This project will continue the study of the progesterone and selective mPR ligands effects in vitro on the proliferation and apoptosis of tumor cells with different ratios of mPR subtypes, the identification of targets of this action and signaling cascades activated through mPR. For the first time, the project includes study of the mPR functional role in vivo in rats by treating by selective mPR ligands and comparing their effect with progesterone interacting with different types of receptors. In world science there are few works on the study of mPR at the level of the whole organism. Firstly, we plan to study the expression of receptors in different tissues of female and male rats (intact, gonadectomized, without/with the introduction of sex steroids) to determine the regulation of expression levels of mPR. Then we are going to study the effect of selective mPR ligands in the classical pregnancy maintenance test on ovariectomized female rats, in the regulation of immune processes in the rat model of experimental allergic encephalomyelitis (human multiple sclerosis model), since in our experiments on different types of immune cells, these compounds showed activity similar to progesterone activity. Therefore, they can regulate the immune processes associated with reproductive function and autoimmune reactions in a specific way as progesterone, if its effect is mediated by mPR. Finally, it is planned to study the effect of the selective mPR ligands in comparison with progesterone on tumor development in the rat model of colon cancer induced by dimethylhydrazine. As a result of the project, we expect to obtain data on new targets for anticancer therapy, the fight against autoimmune diseases and the pathological course of pregnancy.

В первых год реализации проекта предполагается завершить эксперименты, проводимые in vitro. Планируется изучить влияние селективных лигандов мПР и прогестерона на активность JNK и MAPK p38 методом иммуноблоттинга, чтобы доказать правильность результатов, полученных с использованием ингибиторов этих киназ на жизнеспособность клеток ВхРС3 в xtt-тесте; изучить эффекты селективных лигандов мПР и прогестерона при активации мПР на апоптоз опухолевых клеток ВхРС3 в отсутствии и на фоне ингибиторов JNK и MAPK p38 по связыванию с меченым аннексином V и по изменению экспрессии генов факторов апоптоза, определяемых методом ОТ-ПЦР в реальном времени; изучить эффекты прогестерона и его аналогов, селективных в отношении мПР, на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток HepG2 с высоким уровнем мРНК мПР β и на уровень активации киназ JNK и MAPK p38 в этих клетках под действием изучаемых стероидов с использованием иммуноблоттинга. Во второй год реализации проекта будет проведено изучение экспрессии мПР в различных тканях и органах крыс разного пола. Будет проводиться тест на сохранение беременности у овариэктомированных крыс после введения изучаемых соединений. Начнется введение диметилгидразина крысам для индукции рака толстой кишки и обработка их после гоннадэктомии прогестероном. В третий год реализации проекта будет вызван экспериментальный аллергический энцефаломиелит у крыс, после чего будут вводиться подкожно в масле прогестерон, либо селективные лиганды мПР в концентрации 10 мг/кг. По окончании эксперимента через 30 дней, после декапитации крыс, мозг животных будет либо фиксирован в 4% параформальдегиде, либо лизирован в TRIzol-реагенте, либо гомогенизирован для определения концентрации белков IL-1β, IL-6, IL-10 и TNF-α в гомогенатах мозга с помощью метода ELISA. Образцы тканей мозга животных с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом, а также обработанные соответствующим образом опухоли толстой кишки, которые заранее были подготовлены на второй год проекта, предполагается исследовать методами иммуногистохимии, иммуноблоттинга, ОТ-ПЦР в реальном времени и других анализах.

Данный проект является продолжением работы коллектива по изучению действия прогестинов через мПР, которое мало исследовано, поскольку эти рецепторы идентифицированы только в 2003 году. Главной заслугой коллектива является выявление специфических особенностей лигандсвязывающего кармана мПР, позволившее И.С. Левиной синтезировать новые аналоги прогестерона в ИОХ им. Н.Д.Зелинского, среди которых были выявлены селективные лиганды мПР, не взаимодействующие с яПР. Подходящие объекты для исследования связывающих свойств, эффектов и механизмов действия мПР, активированных этими лигандами или прогестероном, также были обнаружены нашим коллективом среди более чем 16 клеточных линий, в которых была изучена экспрессия различных типов рецепторов прогестерона. В результате проведенной работы было обнаружено антипролиферативное действие прогестерона на клетки аденокарциномы ВхРС3 поджелудочной железы человека, где не экспрессируются яПР. После обнаружения селективных лигандов мПР нами было проведено исследование их влияния на те же процессы пролиферации, а также на апоптоз. Обнаружен антипролиферативный эффект соединения I как в xtt-тесте, так и в действии на экспрессию конкретных факторов, связанных с пролиферацией. Было изучено участие двух киназ в действии прогестинов через мПР на пролиферацию. Также обнаружено очень слабое действие соединения II на факторы апоптоза (повышение уровня мРНК DAPK и HRK) через 72 часа после начала воздействия. Было изучено действие селективных лигандов и прогестерона на разные типы иммунных клеток. Показано, что они действуют однонаправлено, их эффекты опосредованы мПР и зависят от фенотипа иммунной клетки. Активность проявляли оба соединения. По этой работе была опубликована статья. Члены коллектива владеют всеми методами, которые предполагается использовать в данной работе: ведение культур, выделение РНК, ОТ-ПЦР в реальном времени, иммуноблоттинг, ELISA, xtt-тест, цитофлуориметрия и другие методы изучения апоптотических клеток.

В результате реализации проекта ожидается выяснить роль мПР, активированных специфическими лигандами, в сохранении беременности, в воздействии на аутоиммунные процессы, а также изучить возможность использования их в качестве мишени для противоопухолевой терапии. Научная значимость работы заключается в познании неизученных до настоящего времени механизмов осуществления эффектов прогестерона и его аналогов через активацию разных субтипов мПР, индукцию новых сигнальных каскадов; в выявлении новых мишеней действия прогестинов в разных типах клеток; в обнаружении новых функций, выполняемых этими стероидами в иммунных и опухолевых клетках. Так, будет уточняться роль р38 МАРК и JNK в опосредовании эффектов прогестинов, осуществляемых через мПР, на процессы пролиферации и апоптоза клеток аденокарциномы поджелудочной железы человека. При подтверждении результатов аддитивного подавления жизнеспособности опухолевых клеток ингибитором р38 МАРК совместно с изучаемыми стероидами можно будет использовать сочетанную терапию двумя агентами для усиления антипролиферативного действия прогестинов, что может иметь важное прикладное значение. Использование клеточных линий со значительными различиями в экспрессии разных субтипов мПР позволит оценить разницу в путях проведения сигнала и в функциональной активности этих белков. Результаты исследования экспрессии мПР в разных тканях крыс и при разном гормональном статусе позволят получить новые данные о регуляции уровня мПР половыми гормонами, а следовательно, о возможности индукции синтеза этих белков в клетках или его подавления. Выявление роли мПР в процессах, регулирующих сохранение беременности, может иметь важное прикладное значение в виде новой мишени воздействия для лечения патологий, связанных с выкидышами и преждевременными родами. Эффекты селективных лигандов мПР в крысиных моделях разных заболеваний, если они окажутся соответствующими нашим ожиданиям, также могут быть использованы для гормональной терапии как аутоиммунного энцефаломиелита, так и рака кишечника.