Выяснение механизмов замены остатков тирозина на остатки цистеина в естественно-развернутых белкахНИР

Elucidation of the mechanisms of replacement of tyrosine residues with cysteine ​​residues in intrinsically disordered proteins.

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 9 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Выяснение механизмов замены остатков тирозина на остатки цистеина в естественно-развернутых белках
Результаты этапа: С целью выяснения механизмов возникновения мутантных форм естественно-развернутых белков, содержащих замены остатков тирозина на остатки цистеина, а также роли этого процесса в развитии нейродегенеративных заболеваний, был начат поиск возможных белков-кандидатов с помощью биоинформатических подходов. При поиске таких белков было использовано 3 подхода. Первый подход был основан на поиске подходящих кандидатов среди всех генов, имеющих TAC кодон, который потенциально может быть мишенью для аденозиндезаминаз. На основе выбранных критериев было отобрано 1013 потенциальных генов-мишеней для аденозиндезаминаз среди 18291 гена, содержащего искомый тирозиновый кодон. Среди отобранных кандидатов было найдено 19 белков, содержащих неструктурированные участки, причем два из них были связаны с нейрогенезом: белок P49757 («Protein numb homolog») и P26367 («Paired box protein Pax-6»). Второй подход, основанный на поиске белков-кандидатов с помощью анализа установленных ранее сайтов редактирования РНК, выявил естественно-развернутый белок O43236 («septin 4 – септин 4»), участвующий в нейрогенезе. Третий подход сводился к поиску белков-кандидатов среди клинически значимых однонуклеотидных полиморфизмов нейродегенеративных заболеваний, и позволил найти 4 белка, удовлетворяющих критериям отбора: Q04656 (“Copper-transporting ATPase 1»), Q92793 («CREB binding protein»), P09651 («heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1(HNRNPA1)») и P53041 («Serine/threonine-protein phosphatase 5»). Таким образом, по результатам поиска естественно-развернутых белков, вовлеченных в возникновение и развитие нейродегенеративных заболеваний, для которых возможна замена остатков тирозина на остатки цистеина, было обнаружено 7 белков. На данном этапе реализации проекта была начата подготовка к экспериментальной проверке возможности продукции белка септина 4 с заменой тирозинового остатка на цистеиновый в бактериальной системе. В экспериментальной части проекта была проверена возможность продукции альфа-синуклеина с заменой остатка тирозина, кодируемого триплетом ТАС, на остаток цистеина, в эукариотических системах, а именно в клетках нейробластомы и дрожжевых клетках, а также начато изучение возможных механизмов этого явления. Были получены клетки линии SH-SY5Y, стабильно экспрессирующие под сильным конститутивным промотором CMV альфа-синуклеин дикого типа, а также мутантную форму A53T. По данным вестерн-блот анализа в лизатах клеток нейробластомы, а также в обогащенных альфа-синуклеином фракциях лизата независимо от присутствия бета-меркаптоэтанола в пробе был обнаружен только мономер альфа-синуклеина, что указывает на отсутствие димерных или олигомерных форм альфа-сиунклеина. Второй эукариотической моделью, использованной в нашей работе, были пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, продуцирующие альфа-синуклеин дикого типа, слитый с зеленым флуоресцирующим белком (GFP) на C-конце. В лизатах дрожжевых клеток присутствовали только полипептидные цепи с молекулярной массой около 44 кДа, что соответствует рекомбинантному альфа-синуклеину, слитому с GFP. Таким образом, по крайней мере в использованных в опытах условиях, не было обнаружено продукции мутантных форм альфа-синуклеина с заменой Tyr136Cys в двух типах эукариотических клеток. На следующем этапе реализации проекта будет продолжен поиск мутантых форм альфа-синуклеина с заменой Tyr136Cys в эукариотических клетках. Будут изменены как условиях их культивирования, так и методы детекции мутантных форм. Прежде всего, будет проверена роль окислительно-восстановительного статуса клеток в образовании димеров мутантных форм альфа-синуклеина с заменой Tyr136Cys, а также влияние рН среды инкубации. Для проверки предположения о редактировании мРНК гена альфа-синуклеина аденозиндезаминазами были начаты эксперименты в бактериальной системе. Таким образом, в результате проведенной в 2019 году работы, все запланированные эксперименты были проведены и полученные результаты позволили получить важную информацию об особенностях замены в белках остатка тирозина, кодируемого триплетом ТАС, на остаток цистеина, в разных типах клеток и наметить дальнейшие пути реализации проекта. На основании полученных результатов подготовлена одна статья для публикации в международном журнале и опубликованы тезисы докладов на международной конференции.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Выяснение механизмов замены остатков тирозина на остатки цистеина в естественно-развернутых белках
Результаты этапа: 1. Продолжено выяснение механизмов замены в бактериальных системах 136 остатка тирозина альфа-синуклеина на остаток цистеина, с учетом проведенных в 2019 году экспериментов, в которых не удалось выявить в выделенной мРНК, кодирующей этот белок, явных замен в триплете ТАС за счет действия дезаминаз. Проведенные эксперименты были повторены с использованием других методов детекции редактированной формы РНК, а также при варьировании параметров полимеразной цепной реакции. Обнаружить отредактированных форм мРНК не обнаружено. 2. Продолжено выяснение возможности замены остатков тирозина, кодируемых триплетом ТАС, на остатки цистеина при экспрессии альфа-синуклеина в клетках эукариот, учитывая возможную роль редактирования мРНК дезаминазами. Для решения этой задачи из клеток нейробластомы SH-SY5Y, стабильно экспрессирующих альфа-синуклеин дикого типа и мутантный альфа-синуклеин A53T, а также нетрансформированных клеток в качестве контроля была выделена тотальная фракция РНК. После проведения реакции обратной транскрипции и амплификации 3' фрагмента альфа-синуклеина, с полученной кДНК было проведено секвенирование, однако замен в триплете ТАС не было найдено. 3. Продолжено изучение замены остатка тирозина на остаток цистеина в септине 4, который с помощью биоинформатических методов был выбран в качестве белка, для которого такая замена представляется весьма вероятной. Была изолирована кДНК септина 4 из клеток меланомы линии MalMe 3M и наработан рекомбинантный белок в бактериях. Были обнаружены его мутантные формы с заменами тирозиновых остатков на цистеиновые
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Выяснение механизмов замены остатков тирозина на остатки цистеина в естественно-развернутых белках
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".