ИСТИНА

До недавнего времени белки/ферменты рассматривались в упрощенном виде их статических (кристаллографических) структур. Это в значительной мере затрудняло моделирование функциональных свойств, а также создание эффективных методов компьютерного дизайна новых лекарств и разработку препаратов ферментов с улучшенными свойствами. На данном этапе развития энзимологии становится общепринятым, что белок в растворе представляет не жесткую структуру, а ансамбль структурных конформеров, существующих в динамическом равновесии, и, вероятно, обладающих разными свойствами. Представления о динамической структуре ферментов требуют дальнейшего развития, согласования с огромным массивом существующей экспериментальной информации о функциональных свойствах и, в конечном счете, разработки методов, позволяющих установить четкую взаимосвязь между структурой и функцией, а также предсказывать функциональные свойства мутантных форм и экспериментально еще не изученных белков. Конформационная пластичность участков связывания в структуре ферментов является одним из ключевых факторов, влияющих на ассоциацию/диссоциацию субстратов/лигандов/продуктов и функционирование белка. Семейство методов молекулярной динамики, в принципе, позволяет с высокой точностью моделировать конформационные изменения в структурах белков и изучать их влияние на функцию, однако использование этих подходов ограничено высокой трудоемкостью и вычислительной сложностью таких задач, а также отсутствием адекватных вычислительных ресурсов. В марте 2018 года началась эксплуатация нового раздела Уникальной научной установки суперкомпьютера «Ломоносов-2» МГУ, который базируется на графических ускорителях NVidia Pascal P100. Появление, впервые в России, столь мощной вычислительной архитектуры делает возможным применение более точных и эффективных подходов компьютерной биологии, что, наряду с накоплением в мировой литературе возрастающего объема экспериментальной информации о конформационной подвижности белков и роли структурных перестроек в функции и эволюции, позволяет выйти на качественно новый уровень понимания роли динамической структуры ферментов в проявлении их функциональных свойств, открыть и изучить ранее неизвестные участки связывания. В предлагаемом проекте будет разработан и применен комплексный подход, основанный на интеграции различных компьютерных методов для изучения динамики участков связывания субстратов/ингибиторов/эффекторов/продуктов в ферментах трех разных классов — бактериальных нейраминидазах и L,D-транспептидазах, а также митоген-активируемых протеин киназах, которые представляют важные белки-мишени для медицины. Информация о конформационной пластичности и особенностях структурной организации функционально важных участков связывания в данных ферментах и в соответствующих семействах ферментов позволит в дальнейшем провести поиск их селективных ингибиторов – прототипов лекарственных средств. Методы молекулярного моделирования, в том числе классическая/направленная/ускоренная/метадинамика и квантово-химические вычисления будут использованы для построения конформационных ансамблей структур белков, выявления функционально значимых конформаций, подвижных элементов и сети взаимодействий, анализа их роли в распознавании субстратов/ингибиторов/эффекторов/продуктов пластичными центрами связывания. Методы биоинформатического анализа данных геномной и структурной информации по соответствующим семействам с применением ранее разработанных нами подходов Mustguseal и parMATT будут использованы для сравнительного анализа конформеров ферментов, поиска общих и отличительных особенностей подвижности структуры в родственных белках человека, животных и патогенных бактерий. Выполнение проекта позволит выйти на качественно новый уровень знаний о механизмах действия бактериальных нейраминидаз, L,D-транспептидаз и митоген-активируемых протеин киназ. Разработанные универсальные компьютерные программы и предсказательные алгоритмы позволят отказаться от «статических» структур белков при изучении взаимосвязи структуры и функции, а также механизмов субстратной специфичности самых разных ферментов и поиске их селективных ингибиторов.

Until recently, proteins/enzymes were considered in a simplified form of their static (crystallographic) structures. This fact significantly obstructed the modeling of functional properties, as well as the creation of effective methods for the computer-aided drug design and the development of enzymes with improved properties. At this stage in the development of enzymology, it is generally accepted that the protein in solution is not a rigid structure, but an ensemble of structural conformers that exist in dynamic equilibrium, and probably possess different properties. Understanding the dynamic structure of enzymes requires further development and agreement with a huge array of existing experimental data on the functional properties and, ultimately, development of the methods that allow us to establish a clear relationship between structure and function, as well as predict the functional properties of mutant proteins and experimentally unexplored proteins. The conformational plasticity of binding sites in the structure of enzymes is one of the key factors affecting the association / dissociation of substrates / ligands / products and the functioning of the protein. The family of methods of molecular dynamics allows, in general, to simulate with high accuracy the conformational changes in protein structures and to study their effect on the function, but the use of these approaches is limited by the high laboriousness and computational complexity of these problems, and by the lack of the adequate computing resources. In March 2018, a new section of the unique scientific installation of the Lomonosov-2 supercomputer at Moscow State University began to operate, which is based on the NVidia Pascal P100 graphics accelerators. The emergence of such a powerful computing architecture, for the first time in Russia, makes it possible to apply more accurate and effective approaches of computer biology, that, along with the accumulation of an increasing volume of experimental data on conformational mobility of proteins and the role of structural rearrangements in function and evolution in the world literature, leads to a new level of understanding the role of the dynamical structure of enzymes in the displaying of their functional properties, allows to discover and study previously unknown binding sites. In the proposed project, a comprehensive approach, based on the integration of various computer methods to study the dynamics of substrates / inhibitors / effectors / products binding sites in the enzymes of the three different classes - bacterial neuraminidases, L, D-transpeptidases, and mitogen-activated protein kinases, which are the important target proteins in medicine, will be developed and applied. Information on the conformational plasticity and features of the structural organization of functionally important binding sites in these enzymes and in the corresponding enzyme families will allow to further search for their selective inhibitors - prototypes of drugs. The molecular modeling methods, including classical / steered / accelerated / metadynamic and quantum chemical calculations, will be used to construct conformational ensembles of the protein structures, to identify functionally significant conformations, flexible elements and a network of interactions, to analyze their role in the recognition of substrates / inhibitors / effectors / products by the flexible binding sites. Methods of bioinformatic analysis of genomic and structural data on the relevant protein families using the approaches of Mustguseal and parMATT previously developed by our group, will be used for comparative analysis of enzyme conformers, for the search of common and distinctive features of structure mobility in related human, animal and pathogenic bacteria proteins. The project will allow to reach a qualitatively new level of knowing the action mechanisms of bacterial neuraminidases, L, D-transpeptidases and mitogen-activated protein kinases. The developed universal computer programs and predictive algorithms will allow to refuse the "static" protein structures when studying the relationship between structure and function, and also the mechanisms of substrate specificity of various enzymes and the search for their selective inhibitors.

В результате выполнения проекта будет разработана универсальная комплексная методология для изучения конформационной пластичности участков связывания в структурах белков/ферментов, механизмов динамического распознавания субстратов/ингибиторов/эффекторов и их эволюции в родственных белках. Применение нового комплексного подхода с учетом принципиально новых возможностей суперкомпьютерного комплекса МГУ, позволяющих моделировать структурные изменения в белках в течение длинных траекторий молекулярной динамики, позволит провести анализ конформационной пластичности и эволюции механизмов конформационной вариабельности участков связывания лигандов в бактериальных нейраминидазах, МАР-киназах человека, L,D-транспептидазах на принципиально новом уровне. Разработанный универсальный комплексный подход позволит перейти от «статических» стратегий при изучении свойств белков/ферментов, ориентированных на использование единственной структуры или ограниченного набора конформационных вариантов белка, к более глубокому пониманию специфической конформационной адаптации целевых сайтов в белковых структурах к лиганду в повседневной лабораторной практике. Будет разработано оригинальное программное обеспечение (комплекс надпрограмм) для автоматизированного управления существующими методами молекулярного моделирования и биоинформатического анализа, позволяющее объединить оригинальное и стороннее программное обеспечение в единую комплексную стратегию, состоящую из последовательных этапов, исполняемых с использованием высокопроизводительных вычислительных средств. Будет изучена конформационная пластичности участков связывания лигандов в бактериальных нейраминидазах, МАР-киназах человека, L,D-транспептидазах, дана оценка конформационной вариабельности активных и известных аллостерических сайтов в структурах этих ферментов с учетом принципиально новых возможностей суперкомпьютерного комплекса МГУ, позволяющих моделировать структурные изменения в течение длинных траекторий молекулярной динамики. Будут описаны механизмы динамического распознавания субстратов/ингибиторов/эффекторов с учетом конформационной пластичности участков связывания в структурах бактериальных нейраминидаз, МАР-киназ человека, L,D-транспептидаз с использованием методов молекулярного моделирования. Будут описаны пути аллостерической коммуникации между активными и известными аллостерическими/регуляторными сайтами в структурах бактериальных нейраминидаз, МАР-киназ человека, L,D-транспептидаз с использованием подходов молекулярного моделирования к изучению скорреллированного движения групп/цепочек аминокислот («Pocket crosstalk analysis») и методов биоинформатического анализа коррелирующих/ко-эволюционирующих позиций в больших выравниваниях структур и последовательностей белков соответствующих суперсемейств. Будут изучена вариабельность центров связывания с точки зрения эволюции в суперсемействах бактериальных нейраминидаз, МАР-киназ человека, L,D-транспептидаз – будет проведен сравнительный анализ конформационной пластичности, механизмов динамического распознавания субстратов/ингибиторов/эффекторов и путей коммуникации между разными участками связывания в структурах гомологов, дана оценка консервативности/вариабельности алфавита аминокислотных остатков, формирующих соответствующие участки связывания в эквивалентных позициях белков суперсемейства. Будет разработано улучшенное оригинальное программное обеспечение для сравнительного анализа конформационной пластичности участков связывания в родственных белках/ферментах на основе систематического анализа структурных вариантов белков, полученных из молекулярной динамики, а также структур родственных белков, собранных в результате биоинформатического анализа структурного сходства в банке данных PDB, с учетом недостатков и незадокументированных/неявных ограничений существующих методов анализа сторонних разработчиков (таких как POVME 3.0; Biki Software Suite и др.), выявленных в результате выполнения проекта. Будет разработан веб-ресурс для представления открытого доступа к оригинальным программам и алгоритмам, а также надпрограммам, разработанным в рамках этого проекта и реализующим универсальный комплексный подход. Созданные в результате проекта оригинальные программы и алгоритмы, реализующие универсальный комплексный подход, будут распространятся через сайт лаборатории (примеры ранее разработанных нами веб-продуктов см. в комментариях в главе «Публикации участников коллектива»). Предоставление свободного доступа к нашему программному обеспечению мы считаем принципиально важным шагом решения проблемы поиска взаимосвязи между структурой и функцией белков, поскольку это позволяет объединить усилия разных ученых и коллективов, работающих над этой важной и чрезвычайно сложной проблемой, и разносторонне оценить предлагаемые подходы.

Проект основан на опыте и результатах нашей работы за более чем 10 лет в области фундаментальной и прикладной энзимологии: изучения структурно-функциональных взаимосвязей в белках, разработке методов дизайна препаратов ферментов с улучшенными свойствами и прототипов лекарственных препаратов с использованием методов молекулярного моделирования, биоинформатики, статистики, теоретической химии, кинетических исследований, экспериментального получения и характеристики ферментных препаратов. Проведенные исследования убедили нас в том, что «статический» подход к представлению белка на основе единственной структуры является ключевой проблемой, снижающей эффективность применения современных методов компьютерной биологии при решении широкого спектра научных задач. Для изучения свойств белков и решения прикладных задач необходим новый комплексный подход, которые позволит отказаться от «статических» стратегий в пользу более глубокого понимания и учета динамических свойств белка. Коллектив имеет существенный задел по предлагаемому проекту: в результате многолетних исследований разработан комплекс оригинальных алгоритмов и программ для анализа структуры, функции и регуляции суперсемейств белков/ферментов; накоплен опыт в области молекулярного моделирования и использования методов теоретической химии для изучения механизмов действия ферментов и дизайна ферментов с улучшенными свойствами; разработан комплексный подход ко-дизайна аппаратно-программных средств при использовании суперкомпьютера для решения вычислительно сложных задач биологии и биоинформатики. Развитие общедоступных программ и веб-серверов, которые позволяют объединить усилия ученых и способствуют быстрой оценке эффективности разных методов, мы считаем принципиально важным шагом решения проблемы поиска взаимосвязи между структурой и функцией белков, и накопили значительный опыт в разработке свободно доступных, в том числе веб-ориентированных, имплементаций оригинальных компьютерных подходов.