ИСТИНА

Настоящий проект нацелен на развитие фундаментальных знаний в области прямого биоэлектрокатализа и его применение для нужд здравоохранения. В настоящее время наиболее востребованный и массовый медицинский тест – определение содержания глюкозы в крови. Этот параметр является главным показателем при заболевании сахарным диабетом, встречающимся у полумиллиарда людей по всему миру. На долю Российской Федерации приходится не менее 4.5 миллионов человек. Основную опасность для больных диабетом представляют его осложнения, приводящие к почечной недостаточности, слепоте, летальным исходам. Для предупреждения этих осложнений диабетики вынуждены несколько раз в день контролировать уровень глюкозы в крови при помощи персональных электрохимических глюкометров. Производимые для них тест-полоски используют медиаторы для генерации тока, пропорционального концентрации глюкозы в крови. Однако другие редокс-активные вещества, присутствующие в крови (парацетамол, аскорбат и пр.), также способны генерировать сигнал, приводя к неверным показаниям. В данном проекте предложено устранить эту проблему при помощи прямого биоэлектрокатализа, при котором электроны туннелируют напрямую от фермента к электроду без вспомогательных переносчиков, нивелируя вклад в величину сигнала других компонентов крови кроме глюкозы. Проведение сравнительного анализа глюкозных биосенсоров, использующих прямой и медиаторный биоэлектрокатализ, позволит создать рекомендации к производству тест-полосок нового поколения для персональных глюкометров. В ходе выполнения исследования будет реализованы рекомендации к технологии массового производства тест-полосок и проведена валидизация метода измерения глюкозы в крови с использованием последних в соответствии с действующими стандартами точности, предъявляемыми к глюкометрам.

Current research is focused on extension of fundamental knowledge in the field direct bioelectrocatalysis and its application for occupational and public health. Nowadays blood glucose test is of great demand and one of the most frequent procedures. Raised blood glucose level is a key indicator of diabetes that about half a billion peoples are suffered from. There are not less 4.5 million of diabetics Russian Federation. The main danger for these people is different complications of diabetes such as kidney failure, blindness, and death. As a precaution, they have to strictly control blood glucose level by personal electrochemical glucometers. The latter use test-strips based on mediators generating current that is proportional to concentration of glucose. However, the other redox active substances in blood (such as ascorbate, paracetamol etc.) are also able to produce signal thus corrupting the measurements. This projected is aimed at avoiding this problem by introducing direct bioelectrocatalysis that eliminates the interference from other redox species in blood sample since electron is shuttled directly from enzyme to electrode. Hence, the resulting signal will depend only on glucose. Comparative investigation of biosensors based on direct and mediated bioelectrocatalysis will result in list of requirements for mass-production of novel glucose test-strips. During the investigations these requirements will be met and the accuracy of elaborated test-strips will be checked in accordance with ISO criteria.

В ходе выполнения плана на 1 год проекта: 1. Разработаны электрохимические платформы на основе электродов, модифицированных углеродными наноматериалами, а также электроактивными и проводящими полимерами. Данные платформы, характеризующиеся улучшенной электрохимической кинетикой, необходимы для создания биосенсоров третьего поколения. 2. Исследован ряд азиновых красителей (фенотиазин, феназин, метиленовый зелёный, метиленовый голубой, азур, толуидиновый синий), а также новые производные на их основе в качестве медиаторов электронного переноса для PQQ- и FAD-глюкозодегидрогеназ. Определены наиболее эффективные медиаторы, обладающие лучшими электрокаталитическими свойствами, пригодные для создания биосенсоров второго поколения. 3. Проведена успешная иммобилизация ферментов на поверхностях электродов с различными модификаторами (углеродные материалы, электроактивные полимеры, проводящие полимеры), в результате которой созданы глюкозные биосенсоры второго поколения и впервые разработан биосенсор третьего поколения на основе глюкозодегидрогеназы. 4. Проведено сравнительное исследование прямого и медиаторного биоэлектрокатализа с участием PQQ- и FAD-глюкозодегидрогеназ, в результате которого выявлен способ создания высокоэффективного глюкозного биосенсора. 5. Сформулированы рекомендации и методики изготовления тест-полосок для персональных глюкометров на основе разработанных биосенсоров. В ходе выполнения плана на 2 год проекта: 1. Разработаны различные дизайны электродных структур для тест-полосок, изготавливаемых методом трафаретной печати, пригодных для функционирования в режиме генерации мощности (топливный элемент) и для применения кулонометрической детекции. 2. Достигнуты необходимые показатели аналитических характеристик тест-полосок (линейный диапазон определяемых концентраций, срок хранения, операционная стабильность). 3. Создан протокол измерения сигнала тест-полосок в режиме генерации мощности при помощи амперметра (без использования потенциостата). 4. Проведена кулонометрическая детекция глюкозы в модельных растворах при помощи разработанных тест-полосок. 5. Проведена апробация разработанных тест-полосок в ходе измерений образцов крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом. Валидизация тест-полосок на предмет соответствия критериям точности измерений для персональных глюкометров по стандартам ISO

Команда заявителей принимает участие в развитии направления (био)сенсорных систем, проводимых в лаборатории электрохимических методов химического факультета МГУ под руководством профессора Карякина А.А., более 10 лет. Исследования, проводимые коллективом заявителей, относятся к приоритетным фундаментальным направлениям развития сенсорики и освещают принципиально новые подходы к разработке электроаналитических систем, в том числе для «умных» носимых устройств и задач медицинской диагностики. Для реализации нового протокола определения аналитов командой заявителей предложен способ работы (био)сенсоров в режиме генерации мощности, позволяющий проводить анализ с помощью простейшего амперметра (без специального электрохимического оборудования). Возможно и дальнейшее упрощение регистрации, при котором световая индикация будет указывать превышение порогового значения концентрации (продемонстрировано как пероксида водорода, так и глюкозы) Помимо упрощения системы регистрации сигнала такой подход обеспечивает более точное и правильное определение концентрации аналита даже в условиях турбулентного перемешивания за счет увеличения соотношения сигнал/шум на порядок. Для имитации пероксидазной активности был осуществлен каталитический синтез наночастиц берлинской лазури (нанозимов «искусственная пероксидаза»), обладающих каталитической константой в реакции восстановления Н2О2, вплоть до 200 раз превосходящей таковую для природного фермента. По сравнению с известными неорганическими нанозимами, наночастицы берлинской лазури могут быть использованы в нейтральных рН и не обладают оксидазной активностью. В рамках создания сенсоров участниками проекта разработаны методы нанесения электрокаталитических покрытий на основе берлинской лазури, их стабилизации, в том числе для создания ультрамикросенсоров, предложен экспрессный недеструктивный подход оценки сплошности покрытий методом спектроскопии импеданса.

1. Проведено исследование биоэлектрокатализа пирролохинолинхинон-зависимой глюкозодегидрогеназы, иммобилизованной на полимеризованных азинах, представлены результаты про прямому переносу электрона от активного центра фермента на электрод. Результаты опубликованы в международном научном журнале верхнего квартиля Analytical Chemistry. 2. Разработаны различные дизайны электродных структур для создания тест-полосок для определения глюкозы 3. Разработаны полимерные материалы для иммобилизации ферментов с целью создания тест полосок - на основе полиазинов, композитные на основе сажи и Нафион. 4. Созданы тест-полоски на основе разработанных электродных структур и модификаторов электродов (полиазины, медиаторы, сажа). 5. Проведено определение глюкозы в образцах цельной крови, а также в образцах пота