ИСТИНА

Определение кинетического механизма аллостерических и кооперативных взаимодействий для фермента PGHS с учётом его димерной природы и бифункциональности. Применение полученных знаний для описания ферментативного ответа на выброс АА в клеточную среду, регуляции синтеза простагландинов и фармакологического действия нестероидных противовоспалительных препаратов.

The enzyme prostaglandin-H-synthase is a puzzle because of its features: it is a membrane heme-containing homodimer, catalyzing two successive influencing on each other cyclooxygenase and peroxidase reactions. The cyclooxygenase active site and the peroxidase active site are located on every subunit of the dimer, and these subunits interact to each other. The enzyme is characterized by irreversible inactivation during catalyzed reactions. In preliminary research, we discovered some interesting kinetic properties of the enzyme, including the existing of cooperative effects. PGHS is a key part of the system of the synthesis of prostaglandins. Prostaglandins regulate the development of inflammation and functioning of reproductive, circulatory and other organism systems. PGHS is a target for all known nonsteroidal anti-inflammatory drugs. The description of prostaglandins cascade regulation is restricted because of insufficient knowledge about PGHS kinetic properties. In this study, we plan to find out the kinetic properties of the enzyme: mechanism and parameters of integral kinetics (enzyme activity, inactivation rate in the course of the reaction, the yield of reaction product, the dissolved oxygen concentration), the mechanism and kinetic parameters of interaction with inhibitors, the synergy of cyclooxygenase and peroxidase reactions, the mechanism of allosteric and cooperative interactions; the design of theoretical schemes. The application of these results will be an important step in understanding of cell metabolism regulation by prostaglandins, and also in pharmacological investigations of PGHS inhibitors.

В данной работе планируется определение кинетического механизма аллостерических и кооперативных взаимодействий для фермента PGHS, с учётом его важнейших свойств (димерность, бифункциональность, многосубстратность, инактивация в ходе обеих реакций). Ожидается выявление возможных взаимодействий между мономерами по отношению к связыванию гема, субстратных и несубстратных жирных кислот, кислорода, а также различных ингибиторов. Планируется определение механизма аллостерической регуляции работы фермента путем исследования влияния присоединения гема на связывание ингибиторов, активации циклооксигеназной реакции с помощью субстратов пероксидазной реакции (перекись, донор электронов), а также аллостерического влияния на пероксидазную реакцию посредством ингибиторов циклооксигеназной реакции. Также планируется разработать теоретические схемы, описывающие интегральную кинетику фермента PGHS c учётом взаимного влияния циклооксигеназной и пероксидазной реакций и инактивации в ходе реакций, обратимости и скорости ингибирования, аллостерических и кооперативных взаимодействий. В конечном итоге, ожидается применение полученных результатов для описания функционирования фермента в клетке, а также ферментативного ответа после выброса арахидоновой кислоты в клеточную среду при учёте инактивации в ходе реакции и взаимодействия с различными типами ингибиторов.

В работах научного коллектива имеется теоретический и экспериментальный задел, позволяющие выполнить поставленные задачи: 1) Разработан метод исследования многосубстратных бифункциональных ферментов, подвергающихся инактивации в ходе реакции. 2) Налажены методики выделения и очистки фермента PGHS-1 из везикулярных желёз барана, определения ферментативной активности. 3) Продемонстрировано, что взаимодействие напроксена с PGHS описывается в рамках модели, учитывающей кооперативные взаимодействия субъединиц димерного фермента. 4) Показано, что взаимодействие ибупрофена и толметина с PGHS не описывается в рамках обычно используемых в литературе схем. 5) Обнаружено парадоксальное влияние некоторых циклооксигеназных ингибиторов (напроксен, ибупрофен, толметин) на характер инактивации фермента в процессе циклооксигеназной и пероксидазной реакций. 6) Обнаружено отклонение от кинетики Михаэлиса-Ментен при исследовании взаимодействия фермента с арахидоновой кислотой при высоких концентрациях субстрата. 7) Обнаружено влияние различных доноров электронов (являющихся субстратами пероксидазной реакции) на протекание циклооксигеназной реакции PGHS. 8) Обнаружено влияние присоединения гема на взаимодействие PGHS с обратимыми ингибиторами. аллостерическая регуляция взаимодействия PGHS с циклооксигеназными ингибиторами при связывании гема в пероксидазном сайте. 9) Разработан подход для определения истинных кинетических параметров фермента, не зависящих от перераспределения лигандов (кофактора гема, субстратов, ингибиторов) между водной и гидрофобной фазы в среде. 10) Разработан метод исследования интегральной кинетики при инактивации фермента на фоне его взаимодействия с ингибитором. 11) Разработан метод исследования произвольных многомаршрутных механизмов в стационарной ферментативной кинетике, получена оценка точности квазиравновесных приближений.

Разработана общая теоретическая схема, описывающая взаимодействие димерного фермента простагландин-H-синтаза (PGHS) с субстратом (жирной кислотой) и ингибитором, инактивацию фермента в процессе реакции и кооперативные взаимодействия между мономерами фермента. Исследован кооперативный характер взаимодействий PGHS-1 со своим субстратом – арахидоновой кислотой. Показано, что кинетическая кооперативность по арахидоновой кислоте наблюдается не только для начальной скорости реакции, но и для предельного выхода продукта ферментативной реакции. Эти кооперативные эффекты наблюдаются в широком диапазоне концентраций арахидоновой кислоты – 0-2000 мкМ. Также исследована кинетика циклооксигеназной реакции (COX) в случае другой субстратной жирной кислоты (EPA, эйкозапентаеновая). Показано, что в отличие от АА для зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата EPA отклонений от гиперболы не наблюдается, в то время как зависимость предельного выхода продукта реакции от концентрации субстрата не описывается простейшей моделью. Кинетика циклооксигеназного окисления EPA описывается с учетом наличия кооперативных взаимодействий между мономерами фермента. Исследован кинетический механизм ингибирования PGHS-1 несубстратными жирными кислотами (олеиновая и стеариновая). Показано, что в отличие от ряда НПВП они являются быстрыми обратимыми ингибиторами, и в механизме ингибирования отсутствует медленная стадия. Расчеты с учетом наличия кооперативных взаимодействий между мономерами фермента показали, что стеариновая кислота связывается с активным центром только одного мономера в димере фермента, и каталитическая активность незанятого ингибитором мономера при этом уменьшается в два раза. В случае олеиновой кислоты отклонений от гиперболической зависимости не наблюдается. Осуществлена теоретическая и экспериментальная дискриминация механизмов связывания ингибиторов PGHS-1 различного химического строения. Показано, что отличительной чертой двухстадийного механизма ингибирования является наличие быстрого обратимого и конкурентного по отношению к арахидоновой кислоте связывания ингибиторов, в то время как повышение предельного выхода продукта реакции в присутствии ингибитора проявляется только для кооперативного механизма. Показано, что для ингибиторов напроксена и ибупрофена характерно как наличие быстрой стадии связывания, так и повышение предельного выхода продукта реакции в присутствии ингибитора. Для ингибитора индометацина нами в прямых экспериментах подтверждено наличие быстрой обратимой стадии и последующей медленной обратимой стадии, и показано, что кооперативных взаимодействий в данном случае не наблюдается. Проведено описание результатов в рамках двухстадийной модели и исследована интегральная кинетика реакции в различных режимах добавления индометацина. Исследование зависимости интегральной кинетики циклооксигеназной реакции от концентрации второго субстрата (кислорода) показало наличие отклонений от простейшей модели для зависимости предельного выхода продукта реакции от концентрации кислорода. Такие зависимости описываются с учетом наличия кооперативных взаимодействий между мономерами фермента. Разработана методика титрования PGHS-1 гемином и исследована кинетика образования и диссоциации холофермента PGHS-1. Показано, что образование холофермента хорошо описывается простейшей моделью. Исследован механизм связывания обратимых ингибиторов с апоформой фермента. Показано, что для различных ингибиторов (индометацин, толметин, кетопрофен, фенопрофен, карпрофен, флурбипрофен) механизм связывания ингибитора с апоформой такой же, как и с холоформой PGHS-1, однако в случае апофермента взаимодействие с ингибитором существенно медленнее, чем с холоформой. Исследовано аллостерическое влияние ингибитора напроксена на интегральную кинетику катализируемой PGHS-1 пероксидазной реакции (POX). Показано, что напроксен не влияет на пероксидазную активность PGHS-1, но существенно замедляет инактивацию POX. Приведена теоретическая схема, описывающая наблюдаемые эффекты. Также исследовано аллостерическое влияние доноров электронов (субстратов POX) на интегральную кинетику поглощения кислорода в ходе COX. Показано, что в отсутствие доноров электронов предельный выход продукта COX не зависит от концентрации кислорода, в то время как в присутствии донора повышение концентрации кислорода приводит к значительному снижению предельного выхода продукта COX. С использованием полученных в работе кинетических параметров проведено моделирование влияния медленных ингибиторов (индометацин и аспирин) на поток и уровень простагландинов в открытых системах. Получены аналитические выражения для потоков и концентраций в нестационарном режиме и стационарном состоянии. Показано, что в стационарных состояниях системы зависимость потока и уровня продукта описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, при этом величина наблюдаемой константы Михаэлиса зависит обратно пропорционально от константы скорости инактивации фермента в процессе реакции. Показано, что обратимый ингибитор (индометацин), в отличие от необратимого ингибитора (аспирин), в потоке проявляет себя как депо для активного фермента за счет образования фермент-ингибиторных комплексов. Возмущение системы при резком повышении концентрации индометацина приводит к двухфазному изменению уровня продукта: после первоначального резкого понижения он постепенно повышается до нового стационарного состояния. Возмущение системы в присутствии индометацина при резком повышении концентрации AA приводит к высвобождению фермента из фермент-ингибиторных комплексов, и в течение некоторого времени наблюдается парадоксальный эффект повышения уровня простагландина по сравнению с контролем в отсутствие ингибитора. Затем уровень продукта постепенно понижается до нового стационарного состояния. Показано, что двухфазность во всех этих случаях обусловлена наличием инактивации фермента в процессе реакции. Общая схема действия PGHS, предложенная в настоящей работе, описывает полученные экспериментальные данные, как для начальных скоростей реакции, так и для интегральной кинетики. Это позволяет определить значения кинетических параметров и моделировать действие фермента in vivo.