В связи с техническими работами в центре обработки данных, возможность загрузки и скачивания файлов временно недоступна.
 

Поиск подходов к повышению резистентности тканей глаза и ускорению их регенерации при ятрогенных поврежденияхНИР

New strategies for improving regeneration of eye tissues and their protective qualities under conditions of iatrogenic injuries

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Профилактика и лечение повреждений роговицы, вызванных длительной общей анестезией
Результаты этапа: В 2016 году в рамках Проекта получены следующие основные результаты. Задача 1. Моделирование повреждений роговицы, ассоциированных с длительной общей анестезией. - Разработана экспериментальная модель повреждений роговицы животных (кроликов Oryctolagus cuniculus) в условиях общей анестезии различной продолжительности. При помощи флуоресцеинового окрашивания поверхности роговицы и последующего офтальмоскопического исследования произведена оценка степени повреждения поверхности роговицы наркотизированных животных. Показано, что в целом частота встречаемости эрозий роговицы (без учета клинического показателя) растет с увеличением продолжительности анестезии. Так, если в результате 60-минутной анестезии этот параметр составляет менее 10%, то после 3- часовой анестезии патологические изменения наблюдаются уже у 80%, а после 6-ти часового наркоза – у 100% животных. Показано также увеличение глубины повреждений роговица с ростом продолжительности анестезии. Так, этот показатель варьирует от точечных эрозий (1 балл по флуоресцеиновой шкале) после 1-2 часов наркоза до обширных сливных поражений (2-4 балла по флуоресцеиновой шкале), затрагивающих значительную часть поверхности ткани, по окончании 6- часовой анестезии, что в целом, соответствует результатам, полученным ранее для хирургических пациентов. Таким образом, продемонстрировано, что выбранный вид животных обладает выраженной предрасположенностью к развитию эрозий роговицы в результате перенесенной анестезии, и, как следствие, является удобной моделью для исследования роли различных патогенетических факторов в развитии указанной патологии. - Охарактеризованы морфологические изменения в роговице в зависимости от продолжительности анестезии. Показано, что патологические изменения затрагивают только наружный эпителиальный слой роговицы (т.е. представляют собой именно эрозионные повреждения) и включают коагуляцию плоских эпителиоцитов и их отшелушивание во внешнее пространство после 1-часовой анестезии, более обширные очаги повреждения с гидропической дистрофией и, в некоторых случаях, слущиванием наружных шиповатых клеток через 3 часа анестезии, и значительно более серьезные диффузные повреждения с выраженной гиидропической дистрофией шиповатых и базальных клеток, а также развитием признаков апоптоза (уменьшение клеток в размерах, гиперконденсация хроматина, пикноз или кариорексис, образование апоптотических телец) клеток всех слоев эпителия роговицы после 6-часового наркоза. В последнем случае присутствуют также очаги тотальной потери эпителия, нарушения адгезии базальных клеток к базальной мембране и обнажение стромы роговицы. Таким образом, по данным гистологического анализа, процесс накопления патологических изменений в роговице начинается после 1 часа общей анестезии и приводит к развитию эрозий средней и тяжелой степени тяжести к 3-6 часу наркоза, что хорошо согласуется с результатами клинических тестов. - Определены биохимические изменения в роговице в условиях общей анестезии. Установлено, что пребывание животных под наркозом более 1 часа приводит к развитию окислительного стресса клеток роговицы, причем к 6-му часу наркоза уровень перикисного окислениия липидов достигает 10-кратного превышения нормальных значений. При этом не происходит компенсаторного увеличения собственной антиоксидантной активности ткани, и активности основных ферментов антиоксидантной защиты (СОД, ГП и ГР), что может являться одной из причин развития в ней описанных выше дегенеративных процессов. Показано также, что с увеличением продолжительности анестезии происходит рост активности ГСТ в экстракте роговицы, что может быть связано с участием этого фермента в утилизации введенного анестетика. - Выявлены изменения протеомного состава слезной жидкости экспериментальных животных в условиях анестезии. Показано, что концентрация общего белка слезы увеличивается в 2 раза в течение первых 60 минут наркоза, снижается до исходного уровня к концу третьего часа и, в дальнейшем, остается практически неизменной вплоть до 6-ого часа анестезии. Первая фаза (увеличение) может быть связана со сниженной активностью основных слезных желез, продуцирующих рефлекторную слезу, и, как следствие, с повышенной долей базальной слезы, отличающейся более высоким содержанием белка. Вторая фаза может отражать ответ мейбомиевых желез, изменение активности которых ассоциировано с активацией систем деградации белка. Идентифицированы основные белки слезной жидкости и показано, что выявленный профиль изменения общего белка слезы связан преимущественно с изменением концентрации белков семейства липокалинов. Кроме того, установлено, что содержание в слезе серотрасферина и сывороточного альбумина увеличивается, а концентрация аннексина A1 уменьшается с ростом продолжительности анестезии, что позволяет рассматривать эти белки в качестве потенциальных маркеров исследуемой патологии. С учетом антиоксидантных свойств серотрасферина и сывороточного альбумина, и противовоспалительной активности аннексина А1, выявленные изменения предполагают нарушение соответствующих свойств слезной жидкости. - Охарактеризованы изменения антиоксидантных свойств слезной жидкости экспериментальных животных в условиях анестезии. Показано, что снижение антиоксидантной защиты слезы, наряду со снижением концентрации общего белка, является одним из первых, наиболее быстрых ответов на действие анестетика. Так, через 30-60 минут анестезии АОА слезы уменьшается более чем в 5 раз и ее низкий уровень сохраняется практически неизменным в течение следующих 5 часов общей анестезии. Кроме того, с увеличением продолжительности общей анестезии наблюдается падение как абсолютной, так и удельной активности СОД (в 6 раз), а также ферментов метаболизма глутатиона (ГР и ГП, в среднем, в 2-3 раза), в то время как активность ГСТ существенно возрастает в соответствующие периоды времени. Последнее, как уже говорилось, может быть связано с участием ГСТ в детоксикации введенного анестетика. - Установлены изменения противовоспалительного статуса слезной жидкости в условиях общей анестезии. Показано, что концентрация ИЛ-4 и ИЛ-10 снижается уже через 30 минут анестезии, и за этим эффектом следует резкое увеличение содержания ИЛ-6 (~ в 9 раз) после 3 часов и ФНО- альфа (~ в 3 раза) после 6 часов наркоза. Таким образом, с увеличением продолжительности анестезии происходит снижение концентрации противовоспалительных интерлейкинов с одновременным увеличением содержания провоспалительных цитокинов в слезе, что указывает на развитие локального воспалительного ответа. - Произведен клинический мониторинг регенерации повреждений роговицы на протяжении 30- дневного посленаркозного периода. Показано, что после 3-часовой анестезии в 59% случаев повреждения роговицы сохраняются в течение первых суток, в 56% – в течение трех суток, а в 40% случаев – в течение семи суток после проведения анестезии. У животных последней группы частичное восстановление ткани роговицы в течение первых суток может сменяться дальнейшим прогрессированием заболевания, т.е. примерно в 40% случаев происходит его переход в хроническое течение. В то же время, в среднем, у животных, наркотизированных в течение 3-х часов, к 7-м суткам происходит снижение клинических проявлений эрозий роговицы на 70%. После 6-часовой анестезии наблюдается сходное течение заболевания, однако глубина повреждений роговицы в этом случае выше, а 70%-ное восстановление наблюдается лишь на 14- е сутки посленаркозного периода. Таким образом, определен временной промежуток, необходимый для клинически значимой (70%-ной) регенерации роговицы после произведенных манипуляций, который в случае 3-часовой анестезии составляет 7 суток, а 6-часовой анестезии – 14 дней. - Определена динамика восстановления защитных свойств слезной жидкости в посленаркозный период. Показано, что по истечении 3-6 часов анестезии изменения концентрации общего белка и удельного содержания основных белков слезы восстанавливаются на 1-3 сутки посленаркозного периода, а для полного восстановления АОА и абсолютной активности ферментов антиоксидантной защиты – СОД, ГР, ГП и ГСТ требуется 7 суток (удельная активность этих ферментов восстанавливается на третий день после проведения эксперимента). При этом для большинства ферментов (за исключением ГСТ) после восстановления нормальной активности происходит ее дальнейшее (на 14 и 30 день после анестезии) компенсаторное увеличение более чем в 2 раза. Показано также поэтапное восстановление противовоспалительной активности слезы. Так, исходная концентрация ИЛ-4 восстанавливается на первые, а ИЛ-10 – только на седьмые сутки посленаркозного периода. При этом кратковременный 10-кратный рост концентрации ИЛ-6 восстанавливается уже к завершению анестезии (к 6-му часу), после чего концентрация цитокина практически не меняется в посленаркозном периоде, за исключением небольшого (2-кратного) повышения через неделю после анестезии. Концентрация ФНО-альфа напротив, повысившись сразу после выхода из анестезии, возвращается к исходным значениям только через месяц после наркоза. Таким образом, в отличие от антиоксидантной защиты слезы, которая резко снижается в самом начале анестезии и демонстрирует относительно быстрое восстановление, воспалительный ответ имеет несколько более отложенный характер с полной регенерацией в течение месяца после проведения наркоза. В целом, на данном этапе Проекта продемонстрирована взаимосвязь между развитием клинических и морфологических проявлений эрозий роговицы в условиях общей анестезии, и изменениями биохимических свойств как самой роговицы, так и слезной жидкости, выполняющей протекторную функцию в отношении этой ткани. В частности, впервые показано, что пребывание животных в подобных условиях связано с развитием окислительного стресса клеток роговицы с одновременным снижением антиоксидантной защиты слезы и развитием локального воспалительного ответа, что подтверждает перспективность антиоксидантной и противовоспалительной терапии, выбранных нами в качестве основных тестируемых подходов к лечению исследуемой патологии. Кроме того, впервые охарактеризована динамика самопроизвольного восстановления клинического состояния роговицы и защитных свойств слезы Проект № 16-15-00255/2016 Страница 16 из 36 в посленаркозный период, что является необходимым условием для мониторинга эффективности разрабатываемых профилактических и лечебных мероприятий. Задача 2. Поиск подходов к профилактике и лечению повреждений роговицы, ассоциированных с длительной общей анестезией. - С помощью клинических и гистологических подходов произведено тестирование потенциальных схем профилактики и лечения ятрогенных повреждений роговицы (ускорения регенерации роговицы) в условиях 6-часовой общей анестезии, включающих применение митохондриально- ориентированного антиоксиданта ПДТФ и гормонального противовоспалительного препарата дексаметазона. Показано, что премедикация препаратом дексаметазон 0,1% ассоциируется с развитием более выраженных повреждений роговицы через 24 часа после наркоза, а систематическое применение этого препарата приводит к существенному ухудшению течения заболевания в первые две недели и практически полному отсутствию положительных изменений к концу 30-дневного посленаркозного периода. Сделанные наблюдения подтверждаются результатами гистологических исследований: в результате премедикации и лечения препаратом дексаметазон изменения в роговице остаются сходными с таковыми в случае 6-часовой анестезии без инстилляций и включают признаки апоптоза эпителиоцитов роговицы, участки их гидропической дистрофии, а также мультифокальное снижение толщины эпителия и участки гибели всех его слоев с обнажением стромы. При этом продемонстрировано, что премедикация препаратами ПДТФ, имеет выраженный терапевтический эффект, который усиливается с увеличением используемой дозы препарата. Так, премедикация с помощью 7,5 мкМ ПДТФ подавляет развитие патологического процесса в роговице непосредственно после выхода из анестезии и полностью нейтрализует клинические признаки эрозий уже на первые сутки посленаркозного периода. По данным гистологических исследований у таких животных практически отсутствуют фокусы тотального разрушения эпителия, а также пренекротические и некротические изменения. Терапия, проведенная указанным препаратом, является несколько менее эффективной, однако и в этом случае через неделю после анестезии происходит полное восстановление нормального клинического состояния роговицы, а через 14 суток – полный возврат к нормальной морфологии роговичного эпителия. Таким образом, применение препарата дексаметазон для профилактики/лечения повреждений роговицы в условиях общей анестезии является нецелесообразным, в то время как профилактические и терапевтические схемы, включающие 7,5 мкМ ПДТФ, являются наиболее эффективными и могут быть использованы в клинической практике. - Охарактеризована динамика восстановления биохимических свойств роговицы и защитной функции слезной жидкости на фоне премедикации и терапии с применением 7,5 мкМ ПДТФ. Показано, что антиоксидантная премедикация приводит к двукратному снижению уровня окисления липидов роговицы к концу анестезии, а аналогичное лечение полностью подавляет развитие окислительного стресса в клетках этой ткани. Выявленные эффекты сопровождаются повышением локальной антиоксидантной защиты, индуцируемым ПДТФ, поскольку и премедикация, и лечение эти препаратом вызывает компенсаторное увеличение (в 1,5-3 раза) АОА, активности СОД и активности ферментов метаболизма глутатиона (ГР и ГП) в экстрактах роговицы. Показано, что протекторное и терапевтическое действие ПДТФ отражается и на биохимическом составе слезы, практически не оказывая влияния на концентрацию тотального белка, однако существенно ускоряя восстановление АОА и активности СОД, а также (в меньшей степени) активности ГР и ГП, которые возвращаются к исходным значениям уже на 1-е сутки посленаркозного периода. Показано также, что применение 7,5 мкМ ПДТФ по обеим схемам приводит к повышению активности ГСТ с пиками на 3-7 часы эксперимента, что согласуется с потенциальной ролью этого фермента в механизме детоксикации анестетика. Наконец, продемонстрировано, что применение 7,5 мкМ ПДТФ имеет выраженный противовоспалительный эффект, поскольку подавляет повышение концентрации ИЛ-6 внутри анестезии и приводит к увеличению содержания противовоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 начиная уже с 1-го часа посленаркозного периода. Добавим, что обнаруженное противовоспалительное действие ПДТФ представляет интерес не только в контексте лечения эрозий роговицы, но и для терапии других воспалительных заболеваний глаз, включая увеит. Таким образом, на данном этапе проекта впервые продемонстрирована возможность применения препарата 7,5 мкМ ПДТФ для профилактики и терапии эрозий роговицы в условиях общей анестезии, в клинической практике. Показано также, что профилактическое и терапевтическое действие ПДТФ связано с подавлением окислительного стресса клеток роговицы с одновременным повышением как ее собственной антиоксидантной защиты, так и антиоксидантных и противовоспалительных свойств слезной жидкости, выполняющей протекторную функцию в отношении этой ткани.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Стимулирование регенерации роговицы после фоторефракционной кератэктомии
Результаты этапа: СТИМУЛИРОВАНИЕ РЕГЕНЕРАЦИИ РОГОВИЦЫ ПОСЛЕ ФОТОРЕФРАКЦИОННОЙ КЕРАТЭКТОМИИ Фоторефракционная кератектомия (ФРК) – распространенный метод коррекции близорукости, основанный на ремоделировании стромы роговицы с помощью ультрафиолетового (УФ) эксимерного лазера. На первом этапе ФРК проводится удаление эпителиального слоя роговицы с помощью механической скарификации (классический вариант ФРК) или абляции УФ-лазером (трансэпителиальная ФРК или трасФРК). В процессе реабилитации пациентов ключевую роль играет регенерация роговицы после механических и УФ повреждений, причем последние является потенциально наиболее патологичными, поскольку могут вызывать окислительный стресс и апоптоз кератоцитов, что ухудшает течение посттравматической реакции, замедляет заживление и может вызывать необратимые осложнения. В рамках Проекта проведено моделирование указанных патологических процессов (как механического, так и УФ компонентов повреждения) в роговице экспериментальных животных (кроликов Oryctolagus cuniculus) и охарактеризована эффективность антиоксидантной (митохондриально-адресованной) терапии с использованием препаратов ПДТФ для их лечения. В частности, получены следующие результаты. (1) Охарактеризована динамика регенерации роговицы на клиническом уровне после экспериментальной трансФРК на глубину 50 и 100 мкм. Показано, что в первом случае скорость восстановления соответствует таковой при проведении стандартной трансФРК у пациентов (7 суток), а во втором – происходит избыточный объем абляции и возникают осложнения, нехарактерные для стандартных операций. (2) Определена структура повреждений роговицы в раннем послеоперационном периоде трансФРК на гистологическом уровне. Показано, что проведенная абляция эпителия и поверхностной части стромы роговицы сопровождается воспалительной инфильтрацией и отеком стромы, а также последующей массовой гибелью стромальных кератоцитов за путем апоптоза, который может быть ассоциирован с УФ-индуцируемым окислительным стрессом. Восстановление роговицы включает активную эпителизацию, активацию кератоцитов и ремоделирование внеклеточной части стромы. Процесс занимает как минимум 7 суток, что соответствует клиническим данным, а также картине, наблюдаемой после проведении аналогичных операций у пациентов. Полученные результаты использованы для создания модели повреждений роговицы под действием УФ-излучения. (3) Разработана модель повреждений роговицы под действием УФ-излучения (УФ компонент повреждения роговицы при ФРК). Показано, что в результате облучения светом с длиной волны 312 нм по схеме 4 дня по 20 минут/день развиваются повреждения роговицы, структура которых соответствует таковой при эксимерлазерной абляции этой ткани. В частности, наблюдаются денудация базальной мембраны (полное отсутствие эпителия), отек стромы, а также апоптоз кератоцитов и клеток эндотелия. Охарактеризован постадийный механизм регенрации роговицы, который включает восстановление эпителия и эндотелия за счет активного деления эпителиоцитов на периферии повреждения и формирования вала эпителизации, а также взаимодействие активированных клеток эпителия со стромой, регенерирующей за счет активации жизнеспособных кератоцитов. Восстановительные процессы протекают одновременно во всех слоях роговицы и практически полностью завершаются в течение 7 суток. Отмечено, что массовый апоптоз стромальных кератоцитов может быть связан с УФ-нидуцируемым окислительным стрессом в роговице, о развитии которого свидетельствует многократное повышение содержания МДА (продукт перекисного окисления липидов), а также падение, а затем компенсаторный рост АОА и СОД (компоненты антиоксидантной защиты) в этой ткани. Высказано предположение, что подавление окислительного стресса должно ускорять регенерацию этой ткани. Сделан вывод, что модель достоверно воспроизводит изменения в роговице при трансФРК, и является оптимальной для исследования осложнений таких операций и испытания терапевтических подходов для их предотвращения. (4) Продемонстрирована применимость антиокисдантной терапии с использованием ПДТФ для ускорения регенерации роговицы после УФ-облучения. Показано, что по совокупности признаков наиболее заметный терапевтический эффект достигается в случае конъюнктивальных инстилляций 7,5 мкМ ПДТФ по схеме 1 капля 3 раза в день. В результате действия препарата предотвращается гибель стромальных кератоцитов и других клеток роговицы, происходит более эффективная эпителизация повреждённого участка ткани, ускоряется регенерация ее стромы, а также существенно снижается уровень воспалительной инфильтрации и отека. В целом, по клиническим и гистологическим данным ускорение заживления роговицы в результате лечения составляет около 3 суток. По результатам биохимических исследований установлено, что применение 7,5 мкМ ПДТФ подавляет окислительный стресс в роговице, при этом, не оказывая влияния на компенсаторное увеличение собственной антиоксидантной защиты этой ткани, что может лежать в основе эффективности производимого лечения. (5) Разработана модель повреждений роговицы после экспериментальной скарификации (механический компонент повреждения роговицы при ФРК). Показано, что в механическое удаление эпителия сопровождается отеком наружной стромы и значительной воспалительной инфильтрацией и экссудацией в передней камере глаза, с последующей гибелью кератоцитов. При этом глубокие слои стромы, а также десцеметова мембрана и эндотелий не затрагиваются и, в целом, процесс регенераци происходит быстрее, чем после УФ-облучения, а полное восстановление поверхности роговицы завершается к 4 дню послеоперационного периода. По данным биохимических исследований, в этом случае также происходит развитие окислительного стресса, о чем свидетельствует увеличение содержания МДА и падение АОА и активности СОД в этой ткани. Сделан вывод, что модель воспроизводит последствия механического повреждения роговицы на первой фазе классической ФРК, которые могут вносить вклад в замедление регенерации этой ткани и развитие послеоперационных осложнений. (6) Продемонстрировано, что применение антиокисдантной терапии с использованием конъюнктивальных инстилляции 7,5 мкМ ПДТФ ускоряет заживление роговицы после экспериментальной скарификации на 1-2 суток. При этом быстрее восстанавливается нормальное клиническое состояние роговицы, достигается практически полная эпителизация и ремоделирование стромы этой ткани, снижаются уровни воспалительной инфильтрации и экссудации, а также подавляется развитие окислительного стресса. Сделано предположение, что антиокисдантная терапия может быть использована для стимулирования заживления роговицы и профилактики осложнений при классической ФРК, включающей этап скарификации этой ткани. (7) Эффективность применения антиокисдантной терапии, включающей инстилляции 7,5 мкМ ПДТФ, для ускорения регенерации роговицы впервые продемонстрирована при проведении экспериментальной трансФРК. Показано, что лечение приводит к нормализации клинического состояния роговицы уже на третьи сутки послеоперационного периода. Полученные данные позволяют рекомендовать проведение подобной терапии всем пациентам, перенесшим трансФРК. (8) Произведен анализ литературы, на основании которого установлено, что стромальные кератоциты играют центральную роль в регенерации роговицы, принимая участие в ремоделировании межклеточного матрикса стромы и стимулируя восстановление эпителия за счет секреции соответствующих факторов роста. С учетом этих данных, а также совокупности результатов этапа Проекта высказано предположение, что в основе терапевтического действия ПДТФ лежит предотвращение апоптоза кератоцитов (а также, возможно, апоптоз лимбальных стволовых клеток) за счет эффективного подавления окислительного стресса, индуцируемого УФ-облучением эксимерного лазера. Более подробно результаты проведенного анализа представлены в обзорной статье, опубликованной в рамках Проекта в журнале Current Medicinal Chemistry (Импакт фактор по WoS – 3,249). ПОИСК ПОДХОДОВ К ПОВЫШЕНИЮ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СЕТЧАТКИ К ФОТОПОВРЕЖДЕНИЯМ Повреждения сетчатки, вызванные облучением видимым светом высокой интенсивности, являются распространенным ятрогенным осложнением в офтальмологии. Поскольку патологический процесс в этом случае включает фотосенсибилизированный окислительный стресс, перспективным подходом к предотвращению подобных повреждений также может быть антиоксидантная (митохондриально-адресованная) терапия, для испытания которой необходима разработка адекватных моделей фотоповреждения сетчатки. С этой целью в 2017 году произведены измерение и расчет максимальных доз облучения сетчатки глаз пациентов различными источниками света, использующимися в офтальмологии. (1) Произведена оценка уровней облучения сетчатки при офтальмоскопии. Показано, что применение ручных щелевых ламп дает удельную мощность облучения 0,01 Вт/см2, а в случае стационарных щелевых ламп и офтальмоскопов – уже 0,07-1 Вт/см2. При этом в результате офтальмоскопического обследования пациента полученная доза облучения будет достигать 900 Дж/см2, что более чем в три раза превышает дозы, которые могут вызывать гибель фоторецепторов и изменения в ПЭС. (2) Измерены/рассчитаны дозы облучения сетчатки, получаемые в ходе распространенных офтальмологических операций. Установлено, что операционные микроскопы обеспечивают мощность облучения в диапазоне 0,22-0,42 Вт/см2, однако доза, получаемая при различных хирургических вмешательствах на глазу, будет составлять от 504 Дж/см2 (20-минутная операция) до 4536 Дж/см2 (3 часовая операция), а также будет возрастать за счет проведения офтальмоскопических обследований в предоперационный период. При этом известно, что получение дозы облучения в 396 Дж/см2 может вызывать массовую гибель фоторецепторов, а дозы, равной 3800 Дж/см2 – приводить к тяжелым повреждениям сетчатки. (3) Рассчитано, что доза облучения, получаемая при проведении фотодинамической терапии субретинальной неоваскуляризации, составляет 50 Дж/см2, что по литературным данным также может вызвать изменения в фоторецепторном слое сетчатки. (4) По результатам проведенного анализа отобраны две распространенные в клинической практике и потенциально патологичные дозы облучения, равные 900 и 4500 Дж/см2, воздействие которых на сетчатку экспериментальных животных будут исследоваться на следующем этапе Проекта. ПРОФИЛАКТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ РОГОВИЦЫ, ВЫЗВАННЫХ ДЛИТЕЛЬНОЙ ОБЩЕЙ АНЕСТЕЗИЕЙ (дополнение к отчету за 2016 год) (1) По результатам предыдущего этапа работы, в 2016-2017 годах опубликовано 4 статьи в российских и международных изданиях (в том числе, в журнале Oxidative Medicine and Cellular Longevity, импакт-фактор по WoS – 4,593). Результаты также представлены на четырех российских и международных конференциях. Работа авторов Проекта, представленная в виде тезисов на VII Международной конференции «Проблема безопасности в анестезиологии», по решению оргкомитета вошла в Топ-10 лучших работ и была опубликована в российском профильном журнале «Вестник анестезиологии и реаниматологии» (Импакт фактор по РИНЦ – 0,303). (2) Проведены дополнительные, ранее не анонсированные клинические исследования, в ходе которых показана перспективность практического применения результатов Проекта. На репрезентативной группе хирургических пациентов продемонстрирована эффективность терапии с использованием 0,25 мкМ ПДТФ для предотвращения повреждений роговицы, вызванных длительной общей анестезией. В частности, показано, что у пациентов, получавших лечение, происходит стабилизация слезной пленки и полностью отсутствуют эрозионные повреждения роговицы в послеоперационном периоде. Полученные данные позволяют рекомендовать проведение подобной терапии всем пациентам, подвергаемым длительным оперативным вмешательствам в условиях общего наркоза.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Повышение резистентности сетчатки к ятрогенным фотоповреждениям
Результаты этапа: ПОИСК ПОДХОДОВ К ПОВЫШЕНИЮ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СЕТЧАТКИ К ФОТОПОВРЕЖДЕНИЯМ В 2018 году было проведено исследование применимости митохондриально-направленной антиокисдантной терапии в качестве подхода к предотвращению ятрогенных фотоповреждений сетчатки глаза. Интенсивное световое излучение видимого диапазона производится рядом офтальмологических инструментов, в связи с чем, повреждающая доза подобного облучения может быть получена сетчаткой при проведении самых разнообразных офтальмологических обследований и операций, в особенности сопровождающихся временным отсутствием экранирующих и преломляющих сред глаза. Фотоповреждения сетчатки могут индуцироваться не только светом видимой части спектра, но и УФ-излучением, которое в норме поглощается роговицей и хрусталиком, однако может достигать сетчатки при их ятрогенном повреждении (например, при фоторефракционной кератектомии). Общей чертой механизмов действия повреждающего света на сетчатку является фотосенсибилизированный окислительный стресс, который вызывает повреждение фоторецепторов и других нейронов сетчатки. Поскольку развитие окислительного стресса и апоптоза клеток сетчатки происходит с участием их митохондрий, перспективным подходом к предотвращению этих процессов является использование превентивной митохондриально-адресованной антиоксидантной терапии. В рамках Проекта проведено моделирование патологических процессов в сетчатке экспериментальных животных (кроликов Oryctolagus cuniculus), индуцированных видимым светом и УФ-излучением, и охарактеризована эффективность митохондриально-адресованной антиоксидантной терапии с использованием ПДТФ для предотвращения фотоповреждений этой ткани. В частности, получены следующие результаты. Произведены уточненные расчеты максимальных доз облучения сетчатки глаз пациентов различными источниками видимого света, применяющимися в офтальмологии, по результатам которых моделирование ятрогенных фотоповреждений сетчатки произведено путем облучения видимым светом с освещенностью 2200 люкс и 30000 люкс в течение 3 часов (доза облучения 118 Дж/см2 и 1620 Дж/см2). Показано, в первом случае облучение не вызывает острых или хронических повреждений сетчатки, в то время как во втором – приводит к развитию серьезных деструктивных и компенсаторных изменений в этой ткани, включая массовую гибель фоторецепторов и других нейронов путем апоптоза, активацию, вакуолизацию и миграцию клеток ПЭС, а также отслоение сетчатки и фагоцитарную активность ПЭС. Облучение видимым светом в дозе 1620 Дж/см2 выбрано в качестве оптимальной модели фотоповреждений сетчатки неосложненного течения. С использованием полученной модели охарактеризованы механизм и динамика фотоповреждения/регенерации сетчатки в отсутствие лечения. Показано, что уже в процессе облучения запускается апоптоз фоторецепторов, через сутки апоптоз охватывает нейроны ВЯС и ГС, в то время как на третьи сутки происходит массовая гибель этих клеток, снижение толщины ядерных слоев и фокальная атрофия и отслоение сетчатки, а также наблюдаются активация, миграция и фагоцитарная активность клеток ПЭС, которые через семеро суток сменяются компенсаторными (активация Мюллеровской глии) и воспалительными (инфильтрация гранулоцитами, рост числа фибробластов в хороиде, отек) процессами. Показано, что объективным морфометрическим критерием необратимого фотоповреждения сетчатки является снижение толщины НЯС на расстоянии 1000 мкМ от центра диска зрительного нерва (~ на 20%). По результатам электрофизиологических исследований установлено, что облучение вызывает драматическое снижение функциональности фоторецепторов и других нейронов сетчатки и к седьмым суткам приводит к значительной потере фоточувствительности этой ткани. Описанные морфометрический и электрофизиологический критерии необратимого фотоповреждения сетчатки приняты к использованию для дальнейшей характеристики ретинопротекторного действия ПДТФ (см. ниже). Показано, что облучение сопровождается выраженным окислительным стрессом клеток сетчатки, охватывающим как компоненты их цитозоля (накопление H2O2), так и клеточные липиды (повышение уровня МДА), который спонтанно разрешается только через семь дней послеоперационного периода. При этом, развитие стресса оказывает влияние на антиоксидантную защиту сетчатки, вызывая драматическое повышение АОА и снижение активности ферментов антиоксидантной защиты на 1-3 сутки после облучения. Поскольку изменения сохраняются в течение последующих 4 суток, сделано предположение, что они отражают регулируемый долгосрочный ответ клеток сетчатки на облучение/окислительный стресс. Методом иммунизации животных очищенными рекомбинантными антигенами и аффинной очистки иммуноглобулинов из гипериммунных сывороток получены поликлональные (моноспецифичсеские) антитела против рековерина и аррестина, с использованием которых определены изменения редокс-статуса этих фоторецепторных белков в облученной сетчатке. Показано, что к первым суткам после засветки происходит накопление дисульфидных димеров обоих белков, концентрация которых сохраняется неизменной в течение 3-7 суток, что отражает динамику развития окислительного стресса в фоторецепторах сетчатки. Впервые продемонстрировано, что рековерин может окисляться in vivo с образованием производного сульфеновой/сульфиновой кислоты. Таким образом, разработана модель ятрогенных фотоповреждений сетчатки, в рамках которой инициируются наиболее выраженные патологические изменения в этой ткани. При этом сформулированы морфометрические, электрофизиологические и биохимические критерии развития патологических процессов в облученной сетчатке. Полученные результаты опубликованы в 2018 году в журналах ANTIOXIDANTS (Q2), FRONTIERS IN MOLECULAR NEUROSCIENCE (Q1), BIOCHIMIE (Q1) и BIOCHEMISTRY (MOSCOW) (Q2). С использованием разработанной модели впервые продемонстрирован выраженный ретинопротекторный эффект премедикации с использованием митохондриально-адресованного антиоксиданта ПДТФ. Показано, что на фоне премедикации предотвращается атрофия сетчатки, апоптоз фоторецепторов и других нейронов, активация и фагоцитарная активность клеток ПЭС, а также активация Мюллеровской глии и воспалительные процессы. Сразу после облучения и на первые сутки сетчатка морфологически не отличается от здоровой, а на 3-7 сутки полностью сохраняет цитоархитектонику: средняя толщина НЯС статистически не отличается от нормы, что подтверждает предотвращение потери фоторецепторов. Установлено, что премедикация с использованием ПДТФ практически полностью сохраняет нормальную электрофизиологическую активность сетчатки, защищая как фоторецепторы, так и другие нейроны этой ткани. Показано, что механизмы, лежащие в основе ретинопротекторного действия ПДТФ, напрямую связаны с его выраженной антиоксидантной активностью, поскольку премедикация подавляет рост и ускоряет восстановление МДА и H2O2, оказывает потенцирующее действие на АОА и продлевает нормальную активность ГП в сетчатке, а также подавляет образование дисульфидных димеров аррестина и рековерина в фоторецепторных клетках. Таким образом, впервые показано, что насыщение сетчатки животных ПДТФ производит выраженный защитный эффект, делая структуру и функционирование этой ткани резистентными к фотоповреждениям. На основании полученных результатов, а также имеющихся данных о безопасности и биодоступности ПДТФ, рекомендовано профилактическое применение этого препарата (шестикратные конъюнктивальные инсталляции 7.5 мкМ ПДТФ каждые 10 минут в течение часа) пациентам перед проведением любых офтальмологических процедур, сопряженных с облучением сетчатки яркими источниками света. Полученные результаты опубликованы в 2018 году в журнале ANTIOXIDANTS (Q2) и BIOCHEMISTRY (MOSCOW) (Q2). На этапе Проекта 2018 года также проведены дополнительные исследования (не анонсированы в исходной заявке), посвященные моделированию УФ-повреждений сетчатки и применению антиоксидантной премедикации с использованием ПДТФ для их предотвращения. Показано, что морфологические изменения в сетчатке в результате воздействия УФ-излучения спектра В (312 нм) качественно совпадают с изменениями, производимыми видимым светом (множественная гибель (апоптоз) фоторецепторов и других нейронов сетчатки, атрофия ядерных слоев, активация и фагоцитарная активность ПЭС, отслаивание сетчатки, воспалительный ответ), однако в отличие от последних, проявляющихся фокально, УФ-повреждения имеют тотальный характер (наблюдаются участки тотальной атрофии сетчатки). Впервые продемонстрирована эффективность профилактического применения ПДТФ по предотвращению развития УФ-повреждений сетчатки: в этом случае полностью отсутствуют участки отслаивания сетчатки и активации ПЭС, а также не наблюдаются признаки апоптотических, атрофических и воспалительных процессов. Показано, что ретинопротекторное действие ПДТФ ассоциировано с предотвращением развития УФ-индуцированного окислительного стресса, поскольку в результате премедикации ингибируется рост МДА и сохраняется нормальная активность ГП в сетчатке. Отдельно отмечен рост АОА в сетчатке ответ на УФ-излучение, аналогичный таковому при облучении светом видимого диапазона, что по-видимому отражает универсальную защитную реакцию сетчатки на повышение редокс-потенциала клеточной среды, вызванное световым излучением разных длин волн. Таким образом, впервые продемонстрировано, что ПДТФ предотвращает повреждения сетчатки, вызванные не только видимым светом, но и УФ-излучением, причем в обоих случаях премедикация с использованием этого соединения производит сходное действие в отношении сетчатки, основанное на прямом антиоксидантном эффекте ПДТФ. С учетом полученных данных, премедикация (шестикратные конъюнктивальные инсталляции 7.5 мкМ ПДТФ каждые 10 минут в течение часа) ПДТФ рекомендована пациентам для профилактики УФ-повреждений связанных с проведением самых разных офтальмологических операций (транс-ФРК, операции при лечении первичной открытоугольной глаукомы). С учетом выявленного нами беспрецедентного по своей эффективности протекторного действия ПДТФ в отношении роговицы (см. далее), его применение может оказывать комплексную защиту тканей глаза от УФ-повреждений. СТИМУЛИРОВАНИЕ РЕГЕНЕРАЦИИ РОГОВИЦЫ ПОСЛЕ ФОТОРЕФРАКЦИОННОЙ КЕРАТЭКТОМИИ В 2018 году проведены также дополнительные исследования (не анонсированы в исходной заявке) в рамках которых, впервые продемонстрирована применимость антиокисдантной (митохондриально-направленной) премедикации с использованием ПДТФ для предотвращения повреждений роговицы после воздействия УФ-излучения. Фоторефракционная кератектомия (ФРК) – распространенный метод коррекции близорукости путем ремоделировании стромы роговицы с помощью УФ-лазера, который, однако, имеет ряд осложнений из-за развития УФ-индуцированного окислительного стресса и апоптоза кератоцитов, ухудшающих течение посттравматической реакции и замедляющих заживление роговицы. Ранее в рамках Проекта нами было продемонстрировано, что УФ-облучение роговицы животных с длиной волны 312 нм индуцирует повреждения (денудация базальной мембраны (полное отсутствие эпителия), апоптоз кератоцитов и клеток эндотелия), структура которых соответствует таковой при ФРК. С использованием полученной модели было показано, что послеоперационное применение ПДТФ предотвращает гибель стромальных кератоцитов и других клеток роговицы, улучшает эпителизацию повреждённого участка ткани, ускоряет регенерация ее стромы, а также существенно снижает уровень воспалительной инфильтрации и отека. В основе произведенного лечения, лежит способность ПДТФ подавлять окислительный стресс кератоцитов и эндотелиоцитов, выживших после УФ-повреждения, что обуславливает их активность во время регенерации ткани. В тоже время, эффективность ПДТФ лимитирована тем, что он действует через митохондрии живых клеток, а их количество после УФ-облучения существенно снижено. В связи с этим, высказано предположение, что более эффективное действие ПДТФ в отношении роговицы может быть реализовывано при его применении в качетсве премедикации. В подтверждение этого предположения с использованием клинических тестов показано, что в результате премедикации ПДТФ развитие УФ-нидуцированнх эрозий роговицы практически полностью предотвращается. По данным гистологического анализа наблюдается чрезвычайно высокий уровень выживаемости эпителиоцитов и кератоцитов в условиях УФ-облучения, а также предотвращается развитие локального воспаления. Выявленное беспрецедентное по своей эффективности действие ПДТФ ассоциировано с его способностью высокоэффективно предотвращать развитие УФ-индуцированный окислительный стресс в роговице, покольку премедикация ПДТФ подавляет перекисное окисление липидов и предотвращает снижение АОА в ответ на УФ-облучение. Высказано предположение, что поскольку время проведения плановых медицинских манипуляций (например, трансФРК) обычно известно заранее, УФ-повреждения роговицы могут быть успешно предотвращены путем проведения премедикации с использованием ПДТФ. Таким образом, с учетом всех результатов, полученных на текущем этапе Проекта, проведение интенсивной премедикации ПДТФ может быть рекомендовано перед проведением самых разнообразных офтальмологических операций, при которых существует риск фото/УФ-повреждения как сетчатки, так и роговицы. С учетом совокупности беспрецедентных по своей эффективности протекторных и терапевтических свойств ПДТФ, выявленных в рамках Проекта, можно предположить, что профилактическое и/или терапевтическое применение этого соединения будут оказывать комплексное действие в отношении тканей глаза, ускоряя их регенерацию и обеспечивая их резистентность к ятрогенным повреждениям. Полученные результаты опубликованы в 2018 году в журнале BMC OPHTHALMOLOGY (Q1), FEBS OPEN BIO (Q2) и BIOCHEMISTRY (MOSCOW) (Q2).

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".