Нанокапиллярный сенсор для in vitro и in vivo мониторинга в реальном времени эффективности медьсодержащих химиотерапевтических препаратовНИР

Nanopipette sensor for in vitro and in vivo real-time monitoring of copper chemotherapy drugs efficacy

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 9 августа 2019 г.-30 июня 2020 г. Нанокапиллярный сенсор для in vitro и in vivo мониторинга в реальном времени эффективности медьсодержащих химиотерапевтических препаратов
Результаты этапа: 1) Разработан нанокапилярный сенсор, модифицированный лигандом на основе 2-тиоимидазолона специфичным к ионам меди, который позволяет в режиме реального времени проводит измерения меди внутри единичных клеток и органоидов. Разработана методика контролируемого осаждения золота на поверхность электрода. Подобраны условия модификации поверхности лигандом предварительно активированной золотой поверхности 2) Показано, что разработанный сенсор обладает пределом обнаружения 0,1 мкМ и стабилен при измерениях в биологических системах. Установлено, что при измерениях в биологических системах (в клетках, сфероидах) воздействие внешних факторов на электрод незначительно. 3) Показано, что медные препараты проникают через клеточную мембрану и с помощью электрода возможно определение ионов меди. 4) Продемонстрировано на монослое MCF-7, что все координационные соединения на основе меди проявили цитотоксичность сравнимую с цисплатином. На 3D моделях было показано, что даже максимальные концентрации препаратов не приводят к полной гибели клеток, что характерно для 3D-культур, отличающихся значительно более высокой устойчивостью к действию противоопухолевых препаратов. При этом несколько препаратов, относящихся преимущественно к классу 1, показали низкую цитотоксичность со значениями IC50, превышающими 50 мкМ. Класс координационных соединений 2 проявил высокую активность в 3D модели сфероидов. Координационные соединения типа 3 показали высокую эффективность в 3D модели сфероидов. При этом их активность в 3D культуре была заметно ниже, чем в условиях монослойной 2D культуры, что может быть объяснено условиями гипоксии внутри сфероидов. 5) Было показано, что основным механизмом клеточной гибели был апоптоз, при этом для большинства соединений был характерен ранний апоптоз, но два наиболее цитотоксически активных комплекса демонстрировали поздний апоптоз, что подтверждает их более высокую активность 6) Были разработаны методики формирования 3D-культуры опухолевых сфероидов на основе клеток карциномы молочной железы. В качестве первой методики был предложен т.н. «метод висячей капли», в качестве второй методики был использован метод культивирования на неадгезивной поверхности. 7) Показано, что все разработанные типы координационных соединений на основе меди обладают способностью генерировать АФК, внутри каждого класса способность координационного соединения генерировать АФК определяется его редокс-активностью, способностью к внутриклеточному восстановлению, которое, в свою очередь определяется строением исходного лиганда и природой заместителя. Самыми активными соединениями, которые способны генерировать АФК показали себя координационные соединения типа 3. 8) Были разработаны аурофильные лиганды на основе 2-тиоимидазолонов, способные хелатировать ион меди. Разработанные лиганды содержат аурофильный дисульфидный остов, способный связываться с поверхностью электрода, также два медь-хелатирующих координирующих центра, обеспечивающих связывание полученного производного с катионами меди в растворе. 9) Показана высокую хелатирующую способность разработанного лиганда, позволяющего чувствительно определять малые концентрации катионов меди в растворе и внутриклеточной среде. 10) Исследование смеси лиганда с хлоридом меди методом циклической вольтамперометрии подтвердило образование координационного соединения.
2 1 июля 2020 г.-30 июня 2021 г. Нанокапиллярный сенсор для in vitro и in vivo мониторинга в реальном времени эффективности медьсодержащих химиотерапевтических препаратов
Результаты этапа: 1) За данный отчетный период изучена контролируемость и воспроизводимость процессов осаждения золота. Данные два важных фактора позволили повысить степень идентичности изготавливаемых нанокапилярных сенсоров, что привело к стабильному определению сложно детектируемой ранее концентрации 0,1 мкМ Cu2+ и стабильному поведению сенсоров при воздействии внешних факторов или при длительном хранении. Результаты данного подэтапа были освещены на профильной международной конференции биофизического общества. 2) Было показано, что липосомальная форма координационного соединения 1 более токсична для клеток, чем свободная форма, что может быть объяснено повышенным накоплением препарата в клетках за счет активного захвата липосом путем эндоцитоза. При этом не было обнаружено существенной разницы в токсичности между опухолевыми (карцинома легкого А-549) и нормальными (иммортализованные фибробласты) клетками. 3) Было изучено распределение медьсодержащих терапевтических агентов в объеме сфероида MCF-7. Продемонстрировано, что соединения, различающиеся в заместителях и их положении, а также имеющие ионы меди в различных степенях окисления, по-разному проникают внутрь сфероидов и увеличивают уровень АФК на различных глубинах. Выбранные 3 терапевтических агента проникли внутрь сфероидов, что было подтверждено повышенным уровнем АФК как в поверхностных слоях, так и внутри сфероида. Показано, что соединение 2 оказалось наиболее эффективным агентом, генерирующим АФК на разных глубинах сфероида MCF-7. Соединение 1 со смешанной валентностью немного уступает ему из-за меньшей окислительно-восстановительной активности. Соединение 3 продемонстрировало меньшую окислительно-восстановительную активность из-за высокой стабильности одновалентного комплекса Cu+1/ Cu+1, однако при этом являлось одним из лидеров по цитотоксичности. Также в ходе данного этапа были получены профили по АФК, соответствующие градиенту проникновения терапевтических агентов. Результаты данного подэтапа были опубликованы в Journal of Medicinal Chemistry (Q1) (“Novel copper-containing cytotoxic agents based on 2-thioxoimidazolones”), в Dalton Transactions (Q1), International Journal of Molecular Sciences (Q1). 4) Были получены профили по АФК, градиенту кислорода, а также профили локальных значений pH в опухолевых клетках in vivo. В дальнейшем этапе это даст возможность определить эффективность терапевтических медьсодержащих комплексов в режиме реального времени. Полученные данные свидетельствовали о снижении уровня кислорода и повышении содержания АФК при движении вглубь опухоли. Данные результаты могут быть использованы в дальнейшем при тестировании терапевтических агентов на основе медных координационых соединений, которые влияют на концентрацию АФК в опухоли, а также позволит определять как синтезированные лекарственные препараты могут повлиять на уровень гипоксии внутри опухоли. Были измерены значения рН внутри модели карциномы молочной железы мыши в различных участках опухоли. Было показано с помощью данного метода, что значения рН в опухоли ниже, чем в здоровой ткани. Кроме того, концентрация H+ в опухоли значительно выше во внутренних слоях, чем в поверхностных. При этом было показано, что опухоль гетерогенна, поэтому среднее значение на одной и той же глубине от опухоли к опухоли может значительно отличаться друг от друга. 5) В ходе данного этапа нами была разработана модель опухоли 4T1 у мышей BALB/C, которая является удобной для измерений и воспроизводимой подкожной опухолью. Показано, что наиболее оптимальное количество клеток, введенных подкожно мыши, составляет 1000000, и 10 дней является оптимальным сроком для роста и развития опухоли. 6) Получены и проанализированы данные по распределению меди и липосомальных форм медьсодержащих противоопухолевых комплексов на различных глубинах опухолевого образования живой мыши. Подобраны оптимальная концентрация липосомальной формы медьсодержащего комплекса и время инкубации для последующих экспериментов. концентрация липосомальной формы комплекса 1, в отличии от хлорида меди, увеличивается по мере увеличения глубины проникновения в опухоль. Предположительно, это связано с тем, что липосомы накапливаются значительно лучше внутри опухоли, чем малые молекулы. В ходе данного этапа было опубликовано 6 публикаций, из них 5 публикаций в изданиях, входящих в первый квартиль (Q1) по импакт-фактору JCR Science Edition и индексируемых в WoS и Scopus. Суммарно за два этапа выполнения проекта было опубликовано 11 публикаций, из них 7 публикаций в изданиях, входящих в первый квартиль (Q1) по импакт-фактору JCR Science Edition и индексируемых в WoS и Scopus. Результаты, полученные на данном этапе, были представлены на международной конференции-конгрессе биофизического общества (BPS2021), на конгрессе " Биотехнология: Состояние и перспективы развития". А также тезисы были приняты для публикации и дальнейшего участия в конференции Microscopy&Microanalysis 2021.
3 1 июля 2021 г.-30 июня 2022 г. Нанокапиллярный сенсор для in vitro и in vivo мониторинга в реальном времени эффективности медьсодержащих химиотерапевтических препаратов
Результаты этапа: 1) В ходе этапа был выбран и разработана методика синтеза водорастворимого лиганда, специфичного к ионам меди, для последующей модификации нанокапиллярного сенсора. Новый лиганд был апробирован на основе липоевой кислоты и трипептида. Липоевая кислота выполняла функцию присоединения к атомам золота через -SH функциональные группы, а трипептид позволял хелатировать ионы меди. Трипептид на основе глицина, гистидина и лизина является широко используемым пептидом для хелатирования ионов меди. 2) Нанокапиллярный сенсор был успешно модифицирован водорастворимым лигандом. Оценено влияние водорастворимого лиганада на чувствительность по сравнению с немодифицированным сенсором. Модифицированным сенсором возможно стабильно детектировать концентрации ~0,1 мкМ, что на порядок больше, чем немодифицированным. Установлено, что водорастворимый лиганд улучшает чувствительность (на ~20%) в области низких концентраций (~1 мкМ) по сравнению с лигандом, синтезированным на первом этапе проекта. Подтверждена стабильность сенсора с новым водорастворимым лигандом при проведении внутриклеточных и внутрисфероидных измерений, что подтвердило перспективу его использования для in vitro и in vivo измерений. 3) Для увеличения биодоступности ранее синтезированоного медного комплекса 72k на основе была разработана липосомальная формуляция, а также были проведены исследования по измерению диаметра полученных липосом, их стабильности, концентрации липидов, степени загрузки. Размер полученных липосом определялся с помощью метода динамического светорассеяния, размер полученных везикул в среднем не превышал 120 нм. Емкость загрузки была оценена как мольное процентное отношение комплекса к липидам, для 72k она составила (1,75 ± 0,03) %. Липосомы обладали большей цитотоксичностью по сравнению с нативным 72к комплексом, что подтверждает их эффективность. Размер частиц при исследовании стабильности сохранялся в пределах погрешности, существенной агрегации в суспензиях не наблюдалось. 4) Построено распределение накопленного медьсодержащего препарата по глубине в условиях метастазирования опухоли B16 адаптированным нанокапиллярным сенсором. Установлено, что наибольшему накоплению соответствует приповерхностная зона опухолевого образования in vivo объекта, что обусловлено развитой сетью кровеносных приповерхностных кровеносных сосудов. Наименьшему накоплению соответствует наибольшая глубина, которая, предположительно, является внутриопухолевой областью ограниченной диффузии веществ. В качестве здоровой ткани была выбрана печень, где по результатам измерений отсутствовало накопление препарата. Скорее всего, липосомальная форма медьсодержащего препарата обладает низкой степенью печеночной экскреции, т.е. свидетельствует о высокой биодоступности препарата, что являлось одной из задач пункта 3 настоящего отчета. 5) Показано, что липосомальный медный комплекс проникает внутрь опухоли и влияет на гипоксию внутри опухоли, а также с помощью него происходит образование АФК, которые в дальнейшем могут влиять на замедление роста опухоли. При этом, сравнивая результаты, полученные при измерении концентрации меди и содержания АФК можно сделать вывод, что в случае проведения двух независимых экспериментов, подтверждается проникновение липосомальной формы медного комплекса внутрь опухоли B 16. 6) Исследовано накопление липосомальной формы медного комплекса с помощью метода масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS), который позволил оценить процент накопления липосомальной формы медного комплекса внутри клеток. Было отмечено, что через 30 мин после инкубирования с липосомами, загруженными 72 комплексом, процент накопления в цитоплазме гораздо выше, чем с нативным 72 комплексом и липосомами, загруженными хлоридом меди. Отмечено, что внутри ядра, также накопились ионы меди от комплекса и от хлорида меди, однако особых отличий не наблюдалось. С помощью адаптированного нанокапиллярного сенсора проведены эксперименты по оценке накопления липосомальной формы медьсодержащего комплекса 72 внутри сфероидов MCF-7. Полученное распределение имеет такую тенденцию, как и распределение, полученное в in vivo эксперименте, что свидетельствует об целесообразности использования сфероидов в качестве адекватных 3D-моделей опухолевых образований для первичной оценки накопления лекарственных препаратов.
4 28 июля 2022 г.-30 июня 2023 г. Нанокапиллярный сенсор для in vitro и in vivo мониторинга в реальном времени эффективности медьсодержащих химиотерапевтических препаратов
Результаты этапа: 1) В рамках выполнения проекта были разработаны схемы синтеза и наработаны конъюгаты содержащие аурофильные фрагменты липоевой кислоты и медьхелатирующих лигандов, включающих различные серо- и азотсодержащие функциональные группы: триазольный фрагмент, лиганд на основе цистамина, а также триарильные структуры, раннее доказавшие свою эффективность как медьхелатирующие агенты, необходимые для хелатирования ионов металлов. 2) Проведена успешная модификация нанокапиллярного сенсора разработанными лигандами. Накапиллярный сенсор, модифицированный лигандом лидером показал высокую стабильность при продолжительных измерениях в режиме реального времени, а также высокую чувствительность к Cu2+. Использование нового лиганда позволило увеличить быстродействие сенсора на 25% за счет уменьшения времени преконцентрирования ионов меди вблизи электрохимически активной поверхности нанокапиллярного сенсора. Данное улучшение позволяет проводить сверхбыстрые динамические количественные измерения ионов меди внутри биологических систем, что расширяет спектр возможных применений нанокапиллярного сенсора. В дополнении к вышеописанным результатам, проведен сравнительный анализ разработанного соединения лидера с лигандами Проекта 2019. В ходе данных экспериментов установлено, что разработанный лиганд повышает чувствительность нанокапиллярного сенсора до 0,05 мкМ против 0,1 мкМ для сенсора, модифицированного лигандом лидером Проекта 2019. 3) Селективность нанокапиллярного сенсора, модифицированного лигандом лидером была оценена с использованием наиболее распространенных нецелевых аналитов. Эксперименты подтвердили высокую селективность сенсора в условиях повышенной концентрации нецелевых аналитов по сравнению с целевым ионом Cu2+. В дополнении к этому отсутствие изменений на калибровочной кривой нанокапиллярного сенсора до и после проведения реальных электрохимических измерений в многокомпонентных системах подтверждает возможность стабильного, селективного измерения с неизменной чувствительностью 4) В рамках выполнения проекта были разработаны схемы синтеза конъюгатов и наработаны сами конъюгаты, содержащие фрагменты биотина и медьхелатирующих лигандов, включающих различные серо- и азотсодержащие функциональные группы: триазольный фрагмент, лиганд на основе цистамина, а также триарильные структуры, раннее доказавшие свою эффективность как медьхелатирующие агенты, необходимые для хелатирования ионов металлов. 5) Была изучена цитотоксичность медьсодержащих противораковых препаратов на in vitro моделях, а также были подобраны концентрации для проведения экспериментов по накоплению меди внутри клеток в рамках дальнейшей работы. 6) Было проведено экспериментальное исследование по оценке способности проникновения новых тераностических препаратов внутрь единичных клеток с использованием разработанного нанокапиллярного сенсора. Часть разработанных препаратов имело вектор на ПСМА или биотиновый рецептор, поэтому для их характеристики использовались клеточные линии с отсутствием и присутствием целевых рецепторов. На основании полученных данных установлено, что соединения 19 и 17 проникают в клетку, имеющую целевой рецептор, в том числе путем рецепторно-опосредованного эндоцитоза. 7) Исследование с использованием нанокапиллярного сенсора in vitro показало, что медьсодержащие терапевтические средства способны индуцировать образование активных форм кислорода в опухолевых клетках. В рамках данных работ была произведена сравнительная оценка выработки АФК внутри клеток под воздействием медьсодержащих синтезированных соединений. Показано, что соединения 17 и 19 вызывают больший окислительный стресс в клеточных линиях, имеющих рецепторы, на которые нацелены синтезированные соединения в рамках проекта. Эти результаты могут быть полезны при дальнейшей оптимизации и разработке новых медьсодержащих терапевтических средств для лечения рака. В рамках первого этапа опубликован аналитический обзор литературы, в котором подчеркнута важность количественного обнаружения меди и подмечены нерешенные задачи существующих современных методов количественной детекции. Обзор опубликован в журнале Nanomaterials Q1 в специальном выпуске «Наноматериалы, использующиеся для разработки сенсоров». Опубликованным экспериментальным материалом стало апробирование нанокапиллярных сенсоров на клеточных моделях нейтрофилов. В ходе исследования было показано, что с помощью ранее разработанного сенсора возможно осуществлять определение АФК внутри единичного нейтрофила (значительно меньшим по размеру, чем типичная раковая клетка) под воздействием E. Coli и S. Aureus. Результаты работы опубликованы в журнале Biomedicines Q1. Также на стадии рассмотрения находится аналитический обзор литературы, посвященный последним достижениям в области создания радиофармпрепаратов на основе изотопов меди (64Сu/67Cu). Статья находится на стадии устранения замечаний рецензентов в журнале International Journal of Molecular Sciences Q1 и будет опубликована до конца этапа (см. приложение). В процессе финальной подготовки публикации находится, посвященная разработке низкоинвазивного сенсора для количетсвенного определения Cu2+ в режиме реального времени. В работу вошли экспериментальные исследования, отражающие процесс разработки сенсора и оценку накопления липосомальной формы одного из разработанных медьсодержащего препарата внутри единичных клеток, сфероидов и in vivo опухоли. Статья будет оправлена в журнал Analytical Chemistry Q1 до окончания текущего этапа (см. приложение).
5 1 июля 2023 г.-30 июня 2024 г. Нанокапиллярный сенсор для in vitro и in vivo мониторинга в реальном времени эффективности медьсодержащих химиотерапевтических препаратов
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".