ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Псевдоферменты, и в частности псевдопептидазы, представляют собой белки, являющиеся гомологами ферментов, но содержащие чаще всего замены аминокислотных остатков активного центра, что приводит к снижению или полному отсутствию каталитической активности. Псевдоферменты широко распространены и считается, что они встречаются во всех основных семействах пептидаз. Данных о функциях многочисленной группы псевдоферментов в настоящее время очень мало, и они касаются, в основном, их биоинформатической характеристики. Считается, что они могут принимать участие в регуляции своих активных гомологов, выступая в качестве белков-партнеров, участвовать в регуляции метаболических и сигнальных путей, часто ассоциированных с патологическими состояниями, что делает их потенциальными мишенями для разработки терапевтических агентов наряду с активными ферментами. В основном при изучении развития различных патологий внимание сосредоточено на активных участниках этих процессов. Переключение же внимания на неактивные гомологи является новым, перспективным, позволит понять многие регуляторные процессы и расширит возможности поиска новых лекарств.
Pseudoenzymes, and in particular pseudopeptidases, are proteins homologues to enzymes, but often contain substitutions of amino acid residues of the active center, which leads to a decrease or complete absence of catalytic activity. Pseudoenzymes are widely distributed and found in all major peptidase families. There are small data about the functions of a large group of pseudoenzymes, related mainly to their bioinformatic characteristics. They can participate in the regulation of their active homologs, acting as partner proteins, participate in the regulation of metabolic and signaling pathways, often associated with pathological conditions, which makes them potential targets for the development of therapeutic agents along with their active enzyme homologues. Basically, studying the development of various pathologies, attention is focused on the active participants in these processes. Switching attention to inactive homologs is new, promising, and will allow to understand many regulatory processes and expand the search for new drugs.
В ходе выполнения проекта будут проанализированы геномные и транскриптомные данные для насекомых тенебрионид: будет проведена сборка последовательностей SPH из семейства S1 химотрипсина по транскриптому T. molitor и поиск SPH в геноме T. castaneum, а также сравнение полученных наборов с имеющимися в наиболее полно охарактеризованных геномах насекомых (Drosophila melanogaster) и млекопитающих (Homo sapiens). Буден проведен филогенетический анализ найденных последовательностей. Для собранных предсказанных аминокислотных последовательностей будут проанализированы аминокислотные остатки активного центра, выявлены замены, результатом которых явилась потеря каталитической активности, оценен уровень экспрессии их мРНК в транскриптомах кишечников личинок обоих тенебрионид, а также в транскриптомах яйца, личинки, куколки и жука T. molitor.
За последние 5 лет руководитель проекта Терещенкова В.Ф. проводила работы по изучению протеолитических ферментов и их использованию для решения прикладных задач. Было проведено исследование пищеварительных пептидаз и организации пищеварительного протеолиза у насекомых с использованием биоинформатических, генно-инженерных и биохимических подходов. С использованием биоинформатических методов впервые был проведен анализ последовательностей пролин-специфичных пептидаз (PSP) в геноме T. castaneum и транскриптомах кишечников личинок T. castaneum и T. molitor. Оценен уровень экспрессии мРНК этих пептидаз, на основании которого в совокупности с данными о биохимической локализации сделано предположение о пищеварительной роли некоторых из них (Терещенкова и др. 2016. Acta Naturae, Спецвыпуск, том 1, с. 212). Выделена и идентифицирована масс- спектрометрически пищеварительная PSP T. molitor с высоким уровнем экспрессии – дипептидилпептидаза 4 (DPP 4). Изучены физико-химические и энзиматические свойства DPP 4 T. molitor: влияние рН на активность и стабильность фермента, сравнительное изучение субстратной специфичности ферментов насекомого и человека по специфическим хромогенным субстратам, анализ влияния специфических ингибиторов дипротинов А и Б, вилдаглиптина и ситаглиптина (Tereshchenkova et al., 2016. Insect Biochem. Mol. Biol. 76: 38-48). Изучены свойства второй высоко экспрессируемой PSP T. molitor – пролидазы (Tereshchenkova et al., 2017. Arch Insect Biochem Physiol. 2017, 95(4): e21395). Впервые в экспрессионной системе Pichia pastoris получен активный препарат рекомбинантной DPP 4 T. molitor (Терещенкова и др. 2019. Прикл. биохим. микробиол, 55(3): 231-236). Проводилось изучение протеолиза главных запасных белков семян пшеницы – глиадинов, и их иммуногенных пептидов с использованием индивидуального препарата DPP 4 T. molitor, а также в комплексе с другими пищеварительными пептидазами (Tereshchenkova et al., 2018. FEBS open bio, 8(S1): 216).
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 30 июля 2019 г.-30 июня 2020 г. | Поиск и биоинформатический анализ псевдоферментов сериновых пептидаз насекомых семейства Tenebrionidae |
Результаты этапа: 1. В результате анализа транскриптомных и геномных данных определены наборы последовательностей SPH у тенебрионид T. molitor и T. castaneum. 2. Проведено сравнение полученных последовательностей SPH с последовательностями в наиболее полно аннотированных геномах насекомых (D. melanogaster) и млекопитающих (H. sapiens). Выявлено, что неактивные гомологи T. molitor и T. castaneum обладают наибольшим разнообразием аминокислотных остатков в позициях, соответствующих активному центру и S1 субсайту связывания субстрата. 3. В результате филогенетического анализа были выявлены последовательности неактивных гомологов у двух насекомых тенебрионид T. molitor и T. castaneum, среди которых можно выделить SPH двух насекомых, которые образуют между собой отдельные пары, включая 7 предсказанных пар ортологов. 4. Проведенный структурный анализ позволил выявить и проанализировать замены, результатом которых стала потеря каталитической активности гомологов по сравнению с активными представителями семейства химотрипсина. Все гомологи содержат замены в одной или двух позициях аминокислот активного центра. 5. Оценка уровней экспрессии мРНК для гомологов в транскриптоме кишечника личинок T. molitor показала, что существует значительное количество SPH, которые имеют сравнимый с активными пептидазами семейства высокий уровень экспрессии транскриптов, что может свидетельствовать об их участии в важнейших процессах жизнедеятельности насекомого, включая пищеварительные. 6. Проведенный биоинформатический анализ и оценка уровней экспрессии генов позволили выбрать гомолог, представляющий интерес для более подробного изучения с использованием биохимических подходов. 7. Получен рекомбинантный препарат белка SerPH122 в составе культуральной среды P. pastoris. | ||
2 | 1 июля 2020 г.-30 июня 2021 г. | Анализ структуры высоко экспрессируемых гомологов сериновых пептидаз (псевдоферментов) семейства S1 у насекомых семейства Tenebrionidae |
Результаты этапа: Проведенный анализ транскриптомных данных для T. molitor и геномных данных для T. castaneum позволил определить наборы последовательностей псевдопептидаз у тенебрионид. Значительное число последовательностей SerPH свидетельствует о несомненно важной роли псевдопептидаз. Структурный анализ показал, что все гомологи содержали замены в одной или двух позициях аминокислот активного центра по сравнению с родоначальником семейства S1 химотрипсином (His74-Asp121-Ser216). Большинство из них имели замены каталитического Ser216 на Gly, Thr, Leu, Val, или замены каталитического His74 на Gln. Позиция Asp121 консервативна и сохранялась почти у всех гомологов. В этой позиции встречались единичные замены на Asn. Были определены гомологи, имеющие субстрат-связывающий субсайт S1, близкий к эластазоподобным, коллагеназоподобным, химотрипсиноподобным пептидазам, а также большое количество гомологов с разными наборами аминокислотных остатков в положении S1 субстайта, не характерными для известных пептидаз. Оценка уровней экспрессии мРНК для собранных SerPH на разных стадиях развития T. molitor - в транскриптомах, полученных для яйца, личинки, куколки и имаго, позволила выявить гомологи со значимым уровнем экспрессии транскриптов на каждой стадии. Максимальное количество SerPH с высоким уровнем экспрессии транскриптов, сравнимым с полученным для активных пептидаз семейства, было выявлено на питающихся стадиях (личинки и имаго), что позволило сделать предположение об их участии в пищеварительном процессе сложными регуляторными путями. Получен рекомбинантный белок-гомолог сериновых пептидаз proSerPH122 T. molitor, подобраны условия его очистки с использованием металл-хелатной аффинной хроматографии, проведены дегликозилирование эндогликозидазой Endo H и процессинг пробелка до зрелой формы. Показано, что: (1) полученный гомолог действительно подвергался процессингу под действием трипсина, (2) проявлял невысокую химотрипсин-подобную активность при использовании в качестве субстрата Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, (3) гликозилирование не оказывало влияния на изученные свойства. Проведенные исследования вносят вклад в развитие малоизученной области функционирования псевдопептидаз и могут послужить основой для выяснения связи между структурой и функцией сериновых пептидаз и их гомологов. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".