Изменения в пространственно-временных паттернах развития мозга и активации нейронов при аутизмеНИР

Spatial and temporal changes in neurogenesis and neuronal activation in autism models

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 24 апреля 2019 г.-15 декабря 2019 г. Этап 1
Результаты этапа: За 1 год выполнения проекта были проведены все необходимые подготовительные мероприятия с мышами двух линий аутистических мышей 16p11.2 (df/+) и 16p11.2 (dp/+): мыши были получены, было налажено их размножение и начата наработка животных двух линий в количестве, необходимом для проведения исследований. Было проведено исследование по выявлению токсических эффектов EdU, была определена оптимальная доза EdU для экспериментов. В ходе этих экспериментов были обнаружены негативные эффекты введения EdU на ранний постнатальный онтогенез мышат, выражающиеся в снижении скорости набора массы тела. Выявленный эффект был доза-независимым. На основании полученных данных, для дальнейших исследований нами была выбрана доза 40 мг/кг, как оказывающая минимальный эффект на новорожденных. Полученные данные будут использованы в планировании будущих экспериментов: поскольку разница с контролем для выбранной дозы начинает проявляться только после Р10, динамическая 3D визуализация возрастной динамики деления и миграции клеток в развивающемся мозге аутистичных мышей в будущих экспериментах будет производиться только для первых десяти дней жизни мышат. Была произведена доработка разработанных нами ранее алгоритмов для вписывания мозга мутантных животных в референтную модель мозга дикого типа и их качественного сравнения, а также алгоритмов вписывания мозга новорожденных животных в референтный трехмерный атлас развивающегося головного мозга. Полученные алгоритмы позволяют выполнять качественное сравнение образцов мозга мутантного типа и дикого, что является не тривиальной задачей ввиду возможных морфологических различий или существенных различий в паттернах деления клеток. При этом, представленная схема съемки в двух каналах и последующих трансформаций на основе дополнительного канала позволила достоверно и очень точно совместить изображения множества образцов в 3D. Разработанный интерфейс позволил создать полуавтоматическую систему обработки серии образцов, существенно ускорив процесс анализа и получения результатов. С помощью разработанных алгоритмов было осуществлено сравнение паттернов деления клеток в мозге развивающихся (Р5) и взрослых мышей (Р56) с делецией участка хромосомы, гомологичного человеческому 16p11.2. Были обнаружены признаки микроцефалии у мышей 16p11.2df, а также различия между паттернами пространственного распределения делящихся клеток во взрослом мозге у мышей мутантов 16p11.2df и животных дикого типа. Различия касались обонятельной луковицы и СВЗ, а также, вероятно, субкаллозальной зоны. Возможно, у аутистичных мышей линии 16p11.2df может наблюдаться некоторый дефицит в глиогенезе, однако, однозначно это утверждать можно только после проведения более подробного исследования и количественного анализа. Также разница в плотностях клеток в СВЗ и обонятельной луковице может говорить о меньшей скорости миграции клеток у мутантных мышей. Для оценки клеточных делений в гиппокампе качественному 3D анализу не хватает чувствительности и требуется применение количественной оценки. На 5 сутки после рождения у мышей-мутантов 16p11.2df не было выявлено признаков микроцефалии, а также значимых различий в пролиферации клеток в сравнении с контролей. По всей видимости, изменения в клеточной пролиферации надо искать в более поздних возрастах, либо при отсутствии их на поздних этапах – анализировать выживаемость клеток.
2 1 января 2020 г.-15 декабря 2020 г. Этап 2
Результаты этапа: 1. Было проведено исследование когнитивных эффектов делеции и дупликации участка хромосомы 16p11.2 у взрослых мышей. В тесте на тревожность в приподнятом крестообразном лабиринте были выявлены межполовые различия у аутичных животных: если самцы Df/+ в тесте вели себя так же, как животные дикого типа, то самки Df/+ продемонстрировали повышенную тревожность (выраженную меньшей дистанции, пройденной в открытых рукавах ПКЛ) по сравнению с диким типом. Также было проведено исследование социального поведения мышей обеих линий. Самки линии Df/+ продемонстрировали предпочтение социального партнёра, однако проводили равное время со знакомым и новым партнёром. Самки дикого типа продемонстрировали одинаковый интерес к новому объекту и партнеру; при тестировании распознавания, также, как мыши Df/+, они проводили равное время с новым и знакомым социальным партнером. Самцы Df/+ продемонстрировали одинаковый интерес к новому объекту и партнеру; при тестировании распознавания аутичные животные проводили равное время с новым и знакомым социальным партнером. Самцы WT продемонстрировали предпочтение социального партнёра. При выборе между знакомым и новым партнером они проводили достоверно больше времени с первым, что может свидетельствовать о социальной неофобии. Результаты тестирования социализации и социального предпочтения свидетельствуют о необычном для данного теста поведении животных линии WT, что затрудняет интерпретацию результатов, полученных для Df/+. Эксперименты по исследованию социализации у самок и самцов линии DP/+ не позволил получить однозначный ответ на вопрос о наличии или отсутствии дефицита социальных взаимодействий у этих мышей. Как и при работе с мышами линии Df/+ было обнаружено нетипичное поведение мышей дикого типа в тесте социализации в трехсекционной камере. Животные WT либо не демонстрировали предпочтения социального партнера, проводя равное время с ним и с объектом в противоположном отсеке камеры (самцы), либо, избегали социального партнера (самки). 2. Было произведено исследование динамики возрастных изменений 3D паттернов деления клеток в развивающемся мозге мышей линий 16p11.2 (df/+). Качественный 3D анализ паттернов деления клеток в мозге новорожденных мышей с делецией участка хромосомы, гомологичного человеческому 16p11.2, был проведен с 0 по 10 сутки постнатального развития. У мутантных животных начиная с 4 суток наблюдалась низкая масса тела по сравнению с контролем, за счет чего отношение массы мозга к массе тела было достоверно выше у мутантных животных по сравнению с мышатами дикого типа. Попарное наложение (Df/+ -> WT) групповых изображений мозга новорожденных разных возрастов друг на друга не выявило явных отличий Df/+ мышей от мышат дикого типа: расположение нейрогенных зон, их плотность, размеры полностью совпадали с контрольными животными. Сравнение пролиферации у животных двух генотипов также не выявил разницы в возрастной динамике пролиферативной активности. Таким образом, у новорожденных мышей Df/+ не было выявлено признаков микроцефалии, а также значимых различий в пролиферации клеток в сравнении с контролем. Несмотря на сниженную массу тела траектория развития мозга мутантных животных в первые 10 дней постнатального онтогенеза не отличается от контрольных животных. 3. Было проведено 2 серии экспериментов на взрослых самцах и самках линий Df/+ и Dp/+ в возрасте 2-2.5 месяцев. В первой серии мутантных самцов скрещивали с самками дикого типа B6129SF1/J. Животным вводили синтетический аналог тимидина EdU в дозе 40 мг/кг три раза с интервалом 4 ч, перфузию осуществляли через 24 ч после последней инъекции. Данная схема позволяет выявлять миграционные пути в нейрогенных зонах в трехмерном виде. Во второй серии мутантных самцов скрещивали с гомозиготными самками Nestin-H2B-GFP, у которых зеленый флуоресцентный белок экспрессируется с ядерной локализацией в стволовых клетках. Гибридным мышам дикого типа и мутантам делали три инъекции BrdU в дозе 50 мг/кг с интервалом 12 ч. Через 21 день мышам вводили EdU в дозе 40 мг/кг и через 2 ч перфузировали. Такая схема позволяет выявлять число новых нейронов, а также производить оценку состояния нейрогенной ниши. В общей сложности после генотипирования в первой серии было набрано не менее 7 мышей на группу, во второй серии – не менее 5 мышей. Анализ этих образцов будет осуществлен на 3 году проекта.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".