![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
В последние годы благодаря появлению т.н. С-методов, основанных на процедуре лигирования близко расположенных фрагментов ДНК (Сhromosome Сonformation Сapture – 3С, 4C, 5C, Hi-C) (Dekker 2006; Lieberman-Aiden et al. 2009) и DamID (van Steensel and Henikoff 2000) был накоплен значительный массив данных о пространственной архитектуре хромосом в ядре. Соотнесение результатов С-экспериментов с эпигенетическими данными позволило выявить регуляторную роль пространственной конфигурации хроматина в функционировании генома. Однако все без исключения современные исследования взаимосвязи топологии и эпигенетических свойств хроматина носят усредненный характер – усреднённая по клеточной популяции картина пространственной укладки генома сравнивается с усреднёнными по популяции эпигенетическими профилями и профилями экспрессии. Хотя в последние годы разработан ряд так называемых «single-cell» подходов (то есть, техник, исследующих свойства хроматина одной отдельно взятой клетки (Nagano et al. 2013; Kind et al. 2015)), эти подходы не позволяют одновременно анализировать несколько различных характеристик хроматина (например, построить Hi-C карту пространственной организации хроматина в индивидуальной клетке и одновременно проанализировать, какие домены хроматина в этой клетке прикреплены к ядерной ламине). В силу этого разработка интегральных экспериментальных подходов для одновременного исследования топологии хроматина и его эпигенетических свойств как в популяции клеток, так и в изолированных единичных клетках, является актуальной задачей современной эпигеномики. В рамках данного проекта мы планируем реализовать разработанный нами новый экспериментальный подход, названный Hi-Dam, который впервые даст возможность одновременно в одних и тех же клетках анализировать и трехмерную структуру хромосом, и положение хроматина относительно ядерной оболочки. В основе предлагаемого подхода лежит совмещение протоколов Hi-C и DamID с включением ряда биохимических стадий, позволяющих получить ДНК-библиотеку, глубокое секвенирование которой позволит (а) определить полногеномный спектр хроматиновых контактов, (б) картировать участки хроматина, контактировавшие с ядерной ламиной, и (в) проследить взаимосвязь пространственной структуры хроматина с его расположением около ядерной ламины или во внутренних областях ядра. В проекте предполагается выполнение данной процедуры сначала на популяции эмбрионов дрозофилы, что позволит соотнести выявляемые методом Hi-C топологически-ассоциированные домены (ТАДы) с ламина-ассоциированными доменами (ЛАДами). Известно, что далеко не все ЛАДы, детектируемые в клеточной популяции, в индивидуальных клетках расположены непосредственно вблизи ядерной оболочки (Kind et al. 2013). Предлагаемый нами подход впервые позволит в масштабе генома выявить популяцию ЛАДов, которые фактически находились в контакте с ядерной ламиной на момент фиксации клеток для приготовления 3С библиотеки. Соответственно, станет возможным проследить взаимосвязь между степенью компактизации участка генома и его расположением на ядерной ламине или внутри ядра. Тем самым будет прояснен один из фундаментальных вопросов, касающийся роли ядерной оболочки в установлении и поддержании специфической пространственной структуры хроматина. На следующем этапе проекта предполагается проведение данной процедуры в формате single-cell, что позволит в одной и той же клетке одновременно картировать позиции и ЛАДов, и ТАДов. Эти данные в совокупности с результатами первой части проекта позволят анализировать динамику пространственной структуры индивидуальных ЛАДов и помогут прояснить механизм прикрепления хроматина в ЛАДах к ядерной оболочке.
В ходе выполнения данного проекта были получены следующие основные результаты: 1. Показано, что разрушение ядерной ламины в культивируемых клетках дрозофилы линии S2 приводит к перераспределению хроматина от ядерной оболочки к центру ядра, что – при сохранении общего объёма ядер – приводит к увеличению плотности хроматина в целом. 2. Продемонстрировано, что в клетках S2 ламин-В-рецептор не является необходимым для удерживания периферического хроматина на ядерной оболочке. 3. Установлено, что разрушение ядерной ламины в клетках S2 приводит к увеличению фонового уровня транскрипции и ацетилирования гистонов в ЛАДах. 4. Обнаружено, что разрушение ядерной ламины не приводит к статистически значимым изменениям в профиле ТАДов в клетках S2. 5. Показано, что разрушение ядерной ламины приводит к росту плотности укладки активного хроматина и декомпактизации неактивного хроматина ЛАДов. 6. Выявлено, что разрушение ламины в клетках S2 приводит к частичному «размыванию» компартментализации хроматина. 7. Продемонстрировано, что само по себе механическое взаимодействие с ламиной может приводить к компактизации хроматина в ЛАДах. 8. Впервые получен профиль ЛАДов для 16-18 ч. эмбрионов дрозофилы. 9. Впервые проведён Hi-C анализ топологии генома в единичных клетках дрозофилы; показано наличие ТАДов в индивидуальных клетках, продемонстрирована корреляция между консервативностью границ ТАДов в индивидуальных клетках и степенью обогащения границ активным хроматином. 10. С использованием метода Hi-Dam показано, что один и тот же участок генома имеет разную плотность укладки хроматина, когда он прикреплён к ламине (плотная укладка), и когда он расположен вдали от неё (более рыхлая укладка).
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 6 мая 2016 г.-6 декабря 2016 г. | Проведение классической процедуры Lamin-DamID в 16-18 часовых эмбрионах дрозофилы |
Результаты этапа: На первом этапе выполнения Проекта мы картировали ламина-ассоциированные домены (ЛАДы) хромосом в 16-18 часовых эмбрионах дрозофилы с использованием классической процедуры DamID. Были использованы полученные ранее (совместно с С.Н. Белякиным, ИМКБ СО РАН) конструкции и трансгенные линии для DamID с ламином Dm0, несущие транскрипционную stop- кассету, окруженную loxP-сайтами для сайт-специфичной рекомбинации, отделяющую ОРС Dam- (либо Dam-Lamin)-метилазы от базального промотора гена hsp70 (Рис. 1A в дополнительном файле). Для проведения DamID самцы линии, несущей конструкцию Dam (либо Dam-Lamin), были скрещены с самками линии, экспрессирующей Cre-рекомбиназу в ооцитах и в зиготе под промотором Mos1 (линия #766 из Блумингтона, в которой нами были удалены балансеры). Из нескольких сотен собранных (в двух повторностях, отдельно для экспрессии Dam- и Dam-Lamin) и дехорионизированных 16-18 часовых эмбрионов, в которых в результате сайт-специфичной рекомбинации по loxP сайтам была удалена stop-кассета и, как следствие, происходило метилирование GATC-сайтов в ДНК, находящейся вблизи от ядерной ламины, была выделена метилированная геномная ДНК. Выделенная ДНК была подвергнута ПЦР-амплификации метилированных фрагментов по классической схеме (Vogel et al. 2007), а затем - глубокому секвенированию на Illumina HiSeq-2000 в фирме «Евроген». Последующее наложение отсеквенированных ридов на референсный геном дрозофилы и построение профиля log2(Dam- Lamin/Dam) позволило идентифицировать позиции ЛАДов с применением алгоритма HMM (Рис. 1B в дополнительном файле). Определенные таким образом ЛАДы были сопоставлены с ТАДами, ранее выявленными для 16-18 часовых эмбрионов (Sexton et al. 2012), что позволило выделить ТАДы, соответствующие ЛАДам, чтобы в дальнейшем анализировать именно их. На втором этапе выполнения Проекта была отработана процедура Hi-Dam. Работа по этому направлению была начата с отработки стандартной процедуры Hi-C с использованием эндонуклеазы рестрикции MspI (сайт CCGG). Это было необходимо, поскольку рестриктаза DpnII, являющаяся «классическим» часто щепящим ферментом в C-протоколах, используется в процедуре Hi-Dam на этапе дискриминации метилированных и не метилированных сайтов GATC, и по этой причине не может быть использована для фрагментации хроматина на этапе подготовки Hi-C библиотеки. Для отработки этой части методики были использованы культивируемые клетки дрозофилы (линия S2). Хроматин из 5 млн клеток, фиксированных 1% формальдегидом, расщепляли в присутствии разных количеств фермента (200, 400, 600, 800 ед.) в двух разных реакционных буферах, в которых MspI демонстрирует 100% активности (NEBuffer 2.1 и CutSmart). Удовлетворительные результаты (высокая эффективность рестрикции, которую оценивали с помощью агарозного гель-электрофореза) были получены с использованием NEBuffer 2.1 и 600 ед. фермента – при использовании меньших количеств фермента и/или буфера CutSmart наблюдали пониженную эффективность расщепления хроматина и иногда выпадение осадка, что было обусловлено взаимодействием SDS, добавляемого в реакционный буфер для пермеабилизации хроматина, с ацетатом калия, входящим в состав буфера CutSmart. Далее, проводили отработку процедуры Hi-Dam на 16-18 часовых эмбрионов, полученных от скрещивания линий, несущих конструкцию Dam (либо Dam-Lamin), c линией, экспрессирующей Cre-рекомбиназу (Mos1-Cre). Для проведения Hi-Dam на подготовительном этапе было собрано, фиксировано формальдегидом и заморожено в жидком азоте в трех повторностях по 200-300 эмбрионов. Эмбрионы были проведены через классическую процедуру Hi-C (с использованием рестриктазы MspI): фиксированные эмбрионы были гомогенизированы в лизирующем буфере, содержащем не ионные детергенты тритон Х-100 и NP-40, после чего ядра были отделены центрифугированием и пермеабилизированы 0.3% SDS в буфере NEBuffer 2.1. Хроматин фрагментировали рестриктазой MspI в течение ночи, после чего концы рестриктных фрагментов биотинилировали и лигировали in situ. Полученные Hi-C библиотеки последовательно расщепляли рестриктазами DpnII (вносит разрывы в неметилированный сайт GATC) и DpnI (расщепляет метилированный сайт GATC). После этого достраивали «липкие» концы DpnII-рестриктных фрагментов, отбирали продукты лигирования (формирующиеся на этапе Hi-C) на стрептавидиновых магнитных шариках, лигировали адаптеры Illumina TruSeq и секвенировали на платформе Illumina HiSeq с использованием 35 млн парных чтений на образец. В настоящее время результаты секвенирования проходят биоинформатическую обработку, включающую в себя выравнивание ридов на референсный геном дрозофилы (dm3), фильтрацию повторов, 0.5% самых высоко представленных и самых низко представленных рестриктных фрагментов, а также фильтрацию фрагментов нерелевантного размера (менее 100 п.н. и более 10 т.п.н.), и ряд дополнительных фильтров для отсева продуктов циркуляризации рестриктных фрагментов и фрагментов, не подвергшихся лигированию ни с одним партнёром в ходе подготовки Hi-C библиотеки. К настоящему моменту известно, что после всех этапов фильтрации 63% ридов пригодны для дальнейшего анализа, что позволяет нам построить Hi-Dam карты с разрешением 10-15 т.п.н. На третьем этапе выполнения Проекта мы провели анализ плотности хроматина в ЛАДе с использованием методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Чтобы проверить, как прикрепление хроматина к ядерной ламине влияет на физическую плотность прикрепленных ЛАДов, была проведена двуцветная FISH с зондами, подобранными к противоположным концам одного из ЛАДов. Для анализа был выбран протяженный ЛАД (~350 т.п.н.; van Bemmel et al. 2010) из района 2-ой хромосомы культивируемых клеток дрозофилы эмбрионального происхождения (линия Kc167), который хорошо соответствовал ТАДу, определенному методом Hi-C для это же линии (Li et al. 2015) (Рис. 2A в дополнительном файле). FISH была проведена на клетках S2 эмбрионального происхождения, домены «серого» типа хроматина (Kharchenko et al. 2011) в которых значительно перекрываются с доменами «черного» типа хроматина (Filion et al. 2010), соответствующего части ЛАДов в эмбриональных клетках Kc167. Одновременно с двуцветной гибридизацией было проведено окрашивание ядерной ламины антителами к ламину DmO (Рис. 2B в дополнительном файле) и последующая конфокальная съемка препаратов с подсчетом расстояний в программе IMARIS между парами гибридизационных сигналов разного цвета и кратчайшего расстояния между каждым сигналом гибридизации и ядерной ламиной. Эксперимент был проведен в трех повторностях с подсчетом расстояний для 76, 75 и 88 ядер. Расстояния между сигналами были разделены на две группы в зависимости от того, находились ли оба сигнала рядом с ядерной ламиной (в пределах 0.4 мкм от нее), или вдали от нее (оба сигнала дальше, чем 0.4 мкм от ламины). На рисунке 2C (см. в дополнительном файле) видно, что доля сигналов, находящихся друг от друга на меньших расстояниях (0.2-0.4 мкм), достоверно повышена для сигналов, находящихся рядом с ламиной, по сравнению с сигналами, оказавшимися вдали от ламины. Таким образом, если ТАД/ЛАД прикреплен к ламине, то он оказывается как правило более компактен (имеет меньшие расстояния между концевыми участками), чем этот же ТАД/ЛАД, но оказавшийся вдали от ядерной оболочки. В ходе наших предварительных исследований, с целью оценки влияния прикрепления хроматина к ядерной ламине на плотность его упаковки была проведена процедура Hi-C в эмбриональных клетках S2 с деплецией и без деплеции ламина Dm0. Этот эксперимент носил прикидочный характер, был выполнен в одной повторности и не позволял сделать содержательного заключения. Поэтому, в рамках данного Проекта на финальном этапе выполнения работы за 2016 год эксперимент был повторен уже в двух экспериментальных повторностях для контроля и опыта. Как видно из рисунка 3A (см. в дополнительном файле), деплеция ламина методом РНК- интерференции в клетках S2 была достаточно эффективной. Топологию хроматина анализировали стандартным методом Hi-C c использованием эндонуклеазы рестрикции HindIII и биотинилированием концов рестриктных фрагментов. Hi-C библиотеки секвенировали на платформе Illumina HiSeq 2000 (порядка 35 млн. парных чтений на образец). Результаты секвенирования были обработаны с использованием стандартного протокола процессинга данных Hi-C, включающего итеративную коррекцию. По результатам анализа библиотек были построены тепловые карты контактов для контрольных и деплецированных по ламину клеток S2 с разрешением в 20 т.п.н. (Рис. 3B в дополнительном файле). Биоинформатическая обработка полученных данных была проведена Е.Е. Храмеевой с коллегами (ИППИ РАН) и включала анализ зависимости частот лигирования хроматиновых фрагментов от геномного расстояния и анализ распределения детектированных контактов по пяти группам: контакты внутри ТАДов, внутри интер-ТАДов, между индивидуальными ТАДами, между индивидуальными интер-ТАДами и между ТАДами и интер-ТАДами. В результате проведенного анализа были выявлены топологические особенности связанного с ядерной ламиной хроматина и установлены закономерности в изменении топологии хроматина при разрушении ядерной ламины. В ходе выполнения работы по Проекту в 2016 году были получены следующие результаты: 1. В результате проведенной работы по картированию участков хромосом, контактирующих с ламином Dm0 в 16-18 часовых эмбрионах дрозофилы, были получены карты ЛАДов, которые будут в дальнейшем использованы в качестве рамочных для сопоставления с выявленными методом Hi-Dam метилированными участками и частотой контактов между фрагментами в этих участках. Это сопоставление необходимо, поскольку в процедуре Hi-Dam принципиально невозможно получить профиль метилирования в одних и тех же клетках и для Dam, и для Dam- Lamin, а ЛАДы идентифицируются именно по нормированным log2(Dam-Lamin/Dam) профилям. 2. Подобран оптимальный режим проведения этапа Hi-C процедуры Hi-Dam. Кроме того, выполнен предварительный эксперимент Hi-Dam, после обработки результатов которого в ближайшее время можно будет судить об эффективности проведения процедуры и чувствительности метода. 3. Проведенная нами FISH с зондами к противоположным концам ЛАДа продемонстрировала, что если ТАД/ЛАД прикреплен к ядерной ламине, то его концы находятся в среднем на меньшем расстоянии друг от друга, чем, когда этот же ТАД/ЛАД расположен вдали от ядерной ламины. Тем самым впервые было показано, что физическая плотность одного и того же участка хроматина различается в разных ядрах в зависимости от его близости к ядерной ламине. 4. Построены скейл-плоты (кривые зависимости частоты контактов фрагментов от расстояния между ними) для индивидуальных ТАДов, соответствующих ЛАДам (Л-ТАДы). Полученные результаты свидетельствуют о том, что ТАДы, обогащённые ламин-ассоциированным хроматином, имеют хорошо выраженные особенности пространственной организации, отличающие их от ТАДов, обеднённых этим типом хроматина (Рис. 3С в дополнительном файле): (а) для Л-ТАДов наблюдается чёткая зависимость высоты положения скейл-плота от длины ТАДа – чем короче ТАД, тем выше его кривая скейлинга (то есть, тем выше в нем частота контактов между различными участками); (б) наклон скейл-плотов практически одинаков для Л-ТАДов разных длин и значительно варьирует в выборке ТАДов, обеднённых ламин-ассоциированным хроматином. Эти результаты свидетельствует о том, что либо хроматин ТАДов, который связывается с ядерной ламиной, имеет вполне определенные топологические свойства, либо ядерная ламина формирует этот особый тип и топологию хроматина при связывании с ним. Чтобы подойти к разрешению этой альтернативы, был проведен подсчет нормированных внутри образца частот контактов для пяти групп (контакты внутри ТАДов, внутри интер-ТАДов, между индивидуальными ТАДами, между индивидуальными интер-ТАДами и между ТАДами и интер- ТАДами), который показал, что при деплеции ламина число контактов внутри ТАДов снижается приблизительно на 10%. Таким образом, процедура Hi-C на контрольных и деплецированных по ламину Dm0 клетках S2 с последующим биоинформатическим анализом частот контактов разных типов позволила установить, что при деплеции ламина число контактов внутри ТАДов уменьшается. Этот результат (в совокупности с результатами двуцветной FISH) свидетельствует о снижении плотности хроматина в ТАДах при утрате ими связи с ядерной ламиной. | ||
2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Отработка техники Hi-Dam |
Результаты этапа: По итогам выполнения работы по Проекту в 2017 годы получены следующие основные научные результаты: 1. Методом высокопроизводительного протокола фиксации конформации хромосомы (Hi-C) показано, что разрушение ядерной ламины приводит к компактизации топологически-ассоциированных доменов (ТАДов), содержащих активный хроматина и транскрибируемые гены. ТАДы, ассоциированные с ламиной реагируют на её разрушение по-разному: порядка 70% из них не изменяют степени компактизации, в том время как остальные становятся менее компактными. Декомпактизуются ТАДы, содержащие хроматин «кораллового» типа, что указывает на наличие в них длинных транскрибируемых тканеспецифичных генов. В целом, разрушение ламины приводит к выравниванию плотности укладки активных ТАДов и ТАДов, содержащих «коралловый» хроматин, что указывает на роль ламины в поддержании дифференциальной плотности данных ТАДов в клетках дрозофилы. 2. Продемонстрировано, что разрушение ядерной ламины приводит к увеличению частоты пространственных контактов между ТАДами по всему геному, в первую очередь между ТАДами, принадлежащими к разным эпигенетическим классам (активный/неактивный, активный/Pc). Полученные данные интерпретируются как частичное ослабление компартментализации интерфазного хроматина при деплеции ламина. Таким образом, получены свидетельства того, что ядерная ламина играет заметную роль в пространственной сегрегации активного и неактивного хроматиновых компартментов в интерфазном ядре. 3. Методом иммуноокрашивания хроматина антителами против гистона Н4 и визуализации ДНК посредством окраски DAPI показано, что разрушение ядерной ламины приводит к общей компактизации хроматина в ядре и к его перераспределению от ядерной периферии во внутренние области ядра. Это свидетельствует о том, что ядерная ламина играет существенную роль в правильном пространственном позиционировании хроматиновых доменов. Кроме того, полученные нами данные свидетельствуют о том, что механизмы прикрепления хроматина к ядерной ламине у млекопитающих и дрозофилы могут быть различны, поскольку деплеция ламин-ассоциированного белка LBR (участвующего в прикреплении хроматина к ламине в клетках млекопитающих) никак не сказывается на позиционировании хроматина вблизи ядерной ламины в клетках дрозофилы. 4. Продемонстрировано, что ламин-ассоциированные домены хроматина (ЛАДы) в клетках дрозофилы упакованы с разной плотностью, и в поддержании их дифференциальной плотности участвует ядерная ламина. 5. С использованием количественной и полуколичественной ПЦР на массиве из 38 случайно выбранных генов показано, что разрушение ядерной ламины сопровождается увеличением уровня экспрессии генов, расположенных в ЛАДах. 6. Методом иммунопреципитации хроматина с последующим глубоким секвенированием ДНК показано, что разрушение ядерной ламины, перераспределение хроматина в пространстве ядра и декомпактизация ЛАДов не сопровождается повышением уровня ацетилирования гистонов в ЛАДах. 7. С использованием молекулярного моделирования методами диссипативной динамики частиц показано, что само по себе механическое прикрепление хроматина к ядерной ламине может значительно повышать степень компактизации ЛАДов. Продемонстрирована прямая количественная зависимость между числом пространственных контактов внутри ЛАДа (т.е. его плотностью) и числом его связей с ламиной. При этом показано, что чем больше связей с ламиной образовал данный ЛАД, тем меньше его объём, и тем сильнее его форма отличается от сферической. 8. Разработан и апробирован новый программный инструмент для одновременного анализа топологии генома и ассоциации хроматина с ядерной ламиной (Hi-Dam Pro). 9. Методом Hi-C в единичных клетках показано, что на первых этапах процедуры Hi-Dam происходит эффективная фиксация конформации хромосомы, что позволяет детектировать до 90 тыс. уникальных пространственных контактов на ядро. 10. Продемонстрировано, что на картах пространственной структуры хроматина чётко различимы ТАДы в тех позициях, в которых они картируются в классическом Hi-C на популяции клеток. Это открывает широкие возможности для анализа топологии генома в индивидуальных клетках и для установления закономерностей в эпигенетических свойствах ТАДов, консервативных и отличающихся между разными клетками. | ||
3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Hi-Dam на эмбрионах дрозофилы |
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта в прошлом году во время первых экспериментов с применением технологии Hi-Dam мы обнаружили, что использование рестриктазы MspI на этапе Hi-C приводит к относительно низкой сложности получаемых библиотек. Для решения этой проблемы на первом этапе работы в 2018 году мы решили использовать более частощепящую рестриктазу на Hi-C этапе подготовки библиотек. Были протестированы рестриктазы NlaIII, AluI и CviQI. Все они расщепляют ДНК дрозофилы на более короткие фрагменты, чем изначально использованная нами MspI, однако две первых не могут быть использованы в Hi-C с отбором продуктов лигирования на стрептавидиновых шариках, поскольку первая продуцирует 3`-выступающий, а вторая – тупой конец. На втором этапе работы в 2018 г мы повторили эксперименты на эмбрионах дрозофилы с использованием рестриктазы CviQI. Действительно, в этой серии экспериментов нам удалось картировать на референсный геном до 40% парных ридов (Рис. 1). Затем мы разбили все пары ридов на три группы: 1 – оба рида соответствуют неметилированным фрагментам хроматина; 2 – только один рид из пары соответствует метилированному фрагменту; 3 – оба рида соответствуют метилированным фрагментам хроматина. Как и ожидалось, в группе 3 после всех этапов фильтрации количество валидных пар ридов оказалось на 1.5-2 порядка меньше, чем в группе 1. По этой причине без дополнительного, более глубокого секвенирования полученных библиотек мы не можем построить Hi-C карту отдельно для «метилированных» (ассоциированных с ламиной) и «неметилированных» (не ассоциированных с ламиной) фрагментов. В настоящее время библиотеки проходят дополнительный этап секвенирования. Однако количества ридов, полученного после всех этапов фильтрации, было достаточно для анализа плотности укладки хроматина в масштабе целого генома путём построения графика зависимости частоты контактов между фрагментами хроматина от геномного расстояния между ними, т.н. скейл-плота. В таких графиках учитываются только контакты in cis, и график строится по значениям, усреднённым по всем контактам в геноме, образованным разделёнными заданным расстоянием фрагментами. На подобных графиках относительная плотность укладки хроматина выражается в положении относительно вертикальной оси разных участков кривой. Как показывает анализ скейл-плотов, построенных с использованием ридов групп 1 и 3, метилированные фрагменты хроматина, то есть те, которые были ассоциированы с ламиной в том клеточном цикле, в котором клетка подверглась фиксации, контактируют друг с другом с заметно более высокой частотой, чем фрагменты не метилированные, то есть, не ассоциированные с ламиной (Рис. 2). Этот результат напрямую подтверждает сделанные нами ранее выводы, согласно которым само по себе прикрепление к ламине способно компактизовать хроматин ЛАДов, а также то, что один и тот же ЛАД имеет разную степень компактизации, будучи прикреплён к ламине, и находясь во внутренних областях ядра. На третьем этапе работы в 2018 г мы приступили к получения Hi-Dam библиотек из единичных ядер. Для этого 16-18 ч эмбрионы дрозофилы, экспрессирующие ламин Dm0, слитый с Dam-метилазой, были фиксированы 1% формальдегидом, гомогенизированы, и выделенные ядра были использованы в процедуре Hi-C с рестриктазой CviQI. В этом варианте протокола мы, однако, не использовали биотинилирование концов ДНК перед лигированием, поскольку отбор на стрептавидиновых магнитных шариках не эффективен при работе с материалом из единичных ядер. После лигирования ядра были переведены в PBS и разнесены в лунки ПЦР-планшета с помощью автоматического клеточного сортера в каплях объёмом 1-2 мкл. Затем в лунках были проведены последующие этапы процедуры Hi-Dam, а именно: кратковременное (3 ч) обращение формальдегидных сшивок при 65С, расщепление ДНК рестриктазами DpnI и DpnII, лигирование адаптеров и последующий ПЦР с использованием высокоточной ДНК-полимеразы KAPA Hi-Fi Hot Start. Из 96 изолированных ядер, подвергнутых Hi-Dam, в силу многостадийности процедуры библиотеки удалось получить только для 27 ядер. В настоящее время библиотеки секвенируются на платформе Illumina HiSeq. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".