ИСТИНА

егенеративная медицина, активно развиваясь в течение последних десятилетий, активно формировала научную и методическую базу, направленную на создание эффективных терапевтических подходов с использованием постнатальных стволовых клеток. Их уникальные свойства обеспечивают организму человека очень серьезный ресурс для физиологического обновления в течение всей жизни, однако при повреждении и запуске репаративной регенерации в большинстве тканей активируется процесс репаративного фиброза, то есть формирования рубца в зоне повреждения. Более того, сам подход с экзогенным введением стволовых и прогениторных клеток оказался недостаточно эффективным в клинических исследованиях. Все это вкупе с данными фундаментальных исследований о неавтономности стволовых клеток, то есть их зависимости от специфических компонентов окружения, привело к формированию научного направления по изучению эндогенных механизмов регенерации и возможностей управления этим процессом. При изучении механизмов обновления и регенерации исследователи все чаще стали обращать внимание на роль стромальных клеток (фибробластов, перицитов, мезенхимных стромальных клеток и миофибробластов). В неповрежденной ткани стромальные клетки (в первую очередь, МСК) являются ключевыми компонентами ниш стволовых клеток, где они участвуют в передаче активирующих сигналов, и поддерживают обновление стволовых клеток. В случае повреждения большинство тканей человека заживают с образованием рубца, который формируется миофибробластами, источником которых являются стромальные клетки. Фиброз ткани, сохраняя ее целостность, блокирует возможность восстановления структуры. Кроме того, такой исход процесса связан со снижением функции органа и развитием заболеваний. При этом известно, что некоторые ткани человека после повреждения способны восстанавливать свою структуру без формирования рубца, причем центральную роль в успешной регенерации этих структур играют МСК. Это справедливо для костной ткани (при травмах) и эндометрия, который претерпевает регулярные циклы повреждения и восстанавливается без фиброза 200-300 раз за время жизни женщины. Таким образом, предположение о том, что все стромальные клетки человека детерминированы становиться участниками фиброза и неспособны поддерживать регенерацию опровергается упомянутыми исключения. В данном проекте центральной идеей становится предположение о наличии у стромальных клеток тканеспецифичных свойств, которые влияют на исход регенеративного процесса. При этом еще одной важной функцией стромальных клеток представляется так называемая "организующая" функция стромы, о которой хорошо знают специалисты в области биологии развития, но которая недостаточно изучена в постнатальном периоде и при регенеративных процессах. Данная функция заключается в создании стромальными клетками окружения не только в нише для обновления ткани, но и при успешной регенерации, где перед ними ставится задача воссоздания органотипической структуры и организации других типов клеток. Противоположным по смыслу является превращение стромальных клеток в миофибробласты, активность которых является основой формирования рубца после повреждения. Таким образом, данный проект вносит вклад в ответ на вопрос о роли стромальных клеток в регенерации и расшифровку механизмов, определяющих исход регенеративных процессов, идущих с их участием, что составляет важную задачу фундаментальной науки. Актуальность проекта обусловлена как проблемами регенеративной медицины, где стволовые клетки, МСК и зрелые стромальные клетки активно используются без видимых успехов, так и необходимостью формирования новых научных концепций, лежащих в основе более эффективных методов стимуляции регенеративных процессов. Авторы проекта на основании многолетного опыта работы с МСК из различных источников предположили наличие у стромальных клеток тканевой специфичности, которая может определять исход репаративной регенерации. В проекте будут оценены 4 типа стромальных клеток с хорошо известными свойствами - фибробласты кожи, МСК жировой ткани, костного мозга и эндометрия и будет получен ряд приоритетных данных, касающихся особенностей их участия в процессах репаративной регенерации. Характеристика стромальных клеток из различных источников впервые покажет их потенциал и различия в способности к самоорганизации в тканеподобные конструкции, а также характер депонирования белков матрикса, факторов роста и поведения клеток в этих структурах. Данные такого рода являются оригинальными и будут получены впервые с использованием информативных методов анализа, включая микродиссекцию клеточных структур и конфокальную микроскопию. В проекте будут получены уникальные данные о тканеспецифичном влиянии стромальных клеток на клетки эндотелия и их организацию в упорядоченные структуры, а также о механизме этих эффектов на уровне контактных и паракринных взаимодействий, для чего будет проведен протеомный анализ. Исследование вопросов тканеспецифичности свойств и роли стромальных клеток в репаративной регенерации является оригинальной научной идеей и создает задел для нового направления, в котором фокус исследований сдвигается на изучение регенерации как тканевого процесса с уникальным вкладом всех его участников в исход процесса. В перспективе полученные в проекте результаты могут лечь в основу новых методов стимуляции эндогенного регенеративного потенциала тканей, ранозаживления без рубца и экзогенного культивирования клеточного материала, снижая риски для пациента.

Regenerative medicine actively developed over the past decades and actively formed a scientific and methodological base to create effective therapeutic approaches using postnatal stem cells. Their unique properties provide the human body with a serious resource for physiological renewal throughout life, however, with damage and the launch of reparative regeneration, most tissues activate the process of reparative fibrosis, that is, scar formation in the damage zone. Moreover, approaches using exogenous introduction of stem and progenitor cells was not effective in clinical studies. All this along with basic research describing stem cells as non-autonomous and stating their dependence on specific components of the environment, led to formation of a scientific field to study endogenous mechanisms of regeneration and develop ways to manage this process for treatment sake. Studying the mechanisms of renewal and regeneration, researchers increasingly began to pay attention to role of stromal cells (fibroblasts, pericytes, mesenchymal stromal cells, and myofibroblasts). In intact tissue, stromal cells (primarily MSCs) are key components of stem cell niches, where they participate in transmission of activating signals, and support renewal of stem cells. In case of damage, most human tissues heal with a scar, which is formed by myofibroblasts, the source of which are stromal cells. Fiibrosis of tissue, while maintaining its integrity, blocks ability to restore initial structure. In addition, outcome of the process is associated with decrease in organ function and diseases. It is known that some human tissues after damage are able to restore their structure without a scar, and MSCs play a central role in successful regeneration of these structures. This is true for bone tissue (after injuries) and endometrium, which undergoes regular cycles of damage and is restored without fibrosis 200-300 times during a woman's life. Thus, assumption that all human stromal cells are determined to become participants of fibrosis and unable to maintain regeneration is refuted by mentioned exceptions. In this project, the central idea is assumption that stromal cells have tissue-specific properties that influence outcome of regenerative process. At the same time, another important function of stromal cells is the so-called "organizing" function of the stroma, which experts in the field of developmental biology are well aware of, but which has not been sufficiently studied in the postnatal period and during regenerative processes. This function consists in creation of an environment with stromal cells not only in a niche for tissue renewal, but also during successful regeneration, where they are given the task of recreating the organotypic structure and organization of other cell types. Opposite in meaning is the transformation of stromal cells into myofibroblasts, the activity of which is the basis of scar formation after injury. Thus, this project contributes to the question about the role of stromal cells in regeneration and deciphering the mechanisms that determine the outcome of regenerative processes involving them, which is an important task of basic science. The relevance of the project is due both to the problems of regenerative medicine, where stem cells, MSCs and mature stromal cells are actively used without apparent success, and the need to form new scientific concepts underlying more effective methods of stimulating regenerative processes. The authors of the project, based on many years of experience with MSCs from various sources, suggested that stromal cells have tissue specificity that can determine the outcome of reparative regeneration. The project will evaluate 4 types of stromal cells with well-known properties - fibroblasts of the skin, MSC of adipose tissue, bone marrow and endometrium, and a number of priority data will be obtained concerning the characteristics of their participation in reparative regeneration processes. The characteristic of stromal cells from different sources for the first time will show specific potential of their self-organization in tissue-like structures and the nature of the deposition of matrix proteins and growth factors in these structures. Such data are original and will be obtained for the first time using informative methods of analysis, including microdissection of cellular structures and confocal microscopy. The project will provide unique data on the tissue-specific effect of stromal cells on endothelium cells and their organization into ordered structures, as well as on the mechanism of these effects at the level of contact and paracrine interactions, for which a proteomic analysis will be carried out. The study of tissue specificity properties and the role of stromal cells in reparative regeneration is an original scientific idea and creates a foundation for a new direction in which focus of research shifts to the study of regeneration as a tissue process with the unique contribution of all its participants to the outcome of the process. In the future, the results obtained in the project can form the basis for the stimulation of endogenous tissue regenerative potential, scar-free wound healing and exogenous cultivation of cellular material, reducing risks for the patient.

В проекте будут получены новые данные, раскрывающие важный для регенеративной медицины вопрос о тканеспецифичных свойствах стромальных клеток и характере их участия процессах репаративной регенерации у человека, определяющем исход процесса. Результаты проекта внесут вклад в формирование концепции, в рамках которой стромальные клетки рассматриваются как важный, "организующий" участник восстановления ткани после повреждения, функциональные особенности которого определяют формирование рубца, фиброз или регенерацию с восстановлением структуры ткани. Впервые будет проведен сравнительный анализ ключевых свойств стромальных клеток из тканей, восстанавливающихся после повреждения с образованием рубца или с сохранением структуры, для чего будут использованы фибробласты кожи и мезенхимные стромальные клетки (МСК) костного мозга, жировой ткани и эндометрия. Последний объект заслуживает особого внимания, так как его заживление после многократного (более 200 раз за время жизни женщины) идет без формирования рубца в отличие от кожи или паренхиматозных органов, где резидентные МСК активно вовлечены в процесс образования миофибробластов и фиброз той или иной степени выраженности. Планируемая в проекте характеристика стромальных клеток впервые покажет их потенциал к самоорганизации в тканеподобные конструкции и характер депонирования белков матрикса и факторов роста в этих структурах. Данные такого рода являются оригинальными и будут получены впервые с использованием информативных методов анализа, включая микродиссекцию клеточных структур и конфокальную микроскопию. Наконец, в проекте будут получены уникальные данные о тканеспецифичном влиянии стромальных клеток на клетки эндотелия и их организацию в упорядоченные структуры, а также о механизме этих эффектов на уровне контактных и паракринных взаимодействий, для чего будет проведен протеомный анализ. Следует отметить, что исследование вопросов тканеспецифичности свойств стромальных клеток и их роли в репаративной регенерации является оригинальной научной идеей и создает задел для нового направления, в котором фокус исследований сдвигается на изучение регенерации как тканевого процесса с уникальным вкладом всех его участников в исход процесса и регуляцию эффективности регенерации. Полученные в результате выполнения проекта данные о механизмах поддержания клеточного состава тканей и его восстановления после повреждения чрезвычайно важны как для фундаментальной науки, так и для разработки методов и подходов регенеративной медицины. В перспективе результаты проекта обеспечат не только развитие научных основ регенеративной медицины, но и могут стать источником новых, оригинальных мишеней для создания уникальных методов регенерации, борьбы с фиброзом тканей или активации ранозаживления без рубца.

Основную часть работ планируется проводить на базе Института регенеративной медицины МГУ в лаборатории Генно-клеточной терапии, которую возглавляет руководитель проекта. В ходе формирования лаборатории она была полностью оснащена оборудованием для работы с клеточными культурами человека, прижизненного наблюдения и функциональных клеточных тестов (миграция, пролиферация, формирование колоний) в культурах (xCelligence®). В распоряжении коллектива имеется парк световых и флуоресцентных микроскопов Leica, спектр биохимического оборудования для работы с белками и их фракциями (хроматография, ИФА, электрофорез, иммуноблоттинг), а также оснащение для гистологических и иммуногистологических экспериментов, которые будут необходимы при выполнении проекта. Лаборатория располагает оборудованием для проточной цитофлуориметрии и, которое используются для исследования иммунофенотипа в рамках проекта. Для начальных этапов работ в лаборатории имеется необходимый набор стандартных реактивов (ферменты, культуральные среды и добавки, буферные растворы) для выделения, культивирования и иммунофенотипирования МСК и других стволовых клеток человека. В распоряжении возглавляемой П.И. Макаревичем лаборатории имеются ряд специальных единиц оборудования - микродиссектор Leica LMD6500, оборудование для прижизненного наблюдения за клетками (Incucyte Zoom), микрофлюидная система Onics2 Cellasic, конфокальный микроскоп Leica и оборудование для сортинга клеток (FACS) для выделения отдельных популяций клеток. Оборудование для молекулярно-биологических экспериментов позволяет проводить ПЦР, ПЦР в реальном времени, обратную транскрипцию, при необходимости к исследованию транскриптомных профилей могут быть привлечен соисполнители или использованы ресурсы ЦКП МГУ.