Новый подход к созданию комбинированных таргетных молекул с противоопухолевым эффектом действия как кандидатов в лекарственные средстваНИР

Novel approach for the development of hybrid targeted molecules with anticancer activity as drugs candidates

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 29 апреля 2019 г.-31 декабря 2019 г. Новый подход к созданию комбинированных таргетных молекул с противоопухолевым эффектом действия как кандидатов в лекарственные средства
Результаты этапа: Работа выполнена в соответствии с поставленной задачей - создания низкомолекулярных синтетических таргетных (мишень-ориентированных) гибридных молекул – кандидатов лекарственных средств, базирующейся на комбинировании химических платформ ряда гетероциклических, каркасных и металлокомплексных соединений, способных селективно связываться с фармакологически значимыми мишенями. 1. Каркасные структуры Проведено исследование методом компьютерного молекулярного моделирования, направленное на объяснение результатов биотестирования сконструированного нами пролекарства для тубулин-направленного агента – 2-метоксиэстрадиола (1), отличающегося противоопухолевой активностью и низкой общей токсичностью при терапевтически эффективных дозах. С целью блокировки быстрого метаболизма 2-метоксиэстрадиола в организме сконструированы его пролекарства 2a и 2b на основе сложных эфиров, обладающих собственной противоопухолевой активностью при высоких дозах и нетоксичных к нормальным клеткам). Однако проведенное в рамках выполнения проекта биотестирование соединений 2a и 2b (и контрольного соединения 2c с остатком хлоруксусной кислоты) показало, что все они проявляли заметную способность ингибировать рост клеток карциномы легких человека А549. При этом изучение динамики микротрубочек (МТ) тех же клеток методом иммунофлуоресцентной микроскопии выявило способность монохлорированного эфира 2c вызывать деполимеризацию МТ, характерную для исходной молекулы 2-метоксиэстрадиола. Это означает, что антипролиферативные свойства контрольного соединения 2c, скорее всего, связаны с его быстрым гидролизом в клетках. Пролекарства 2a и 2b оказались более стабильными к гидролизу и не вызывали деполимеризации микротрубочек, однако, вызывали сокращение клеточной поверхности, а при высоких концентрациях – закручивание МТ, вызванное с их неспособностью к связыванию с центросомами, что также свидетельствует о том, что пролекарства 2a и 2b обладают собственными антипролиферативными свойствами. Исследование методом молекулярного докинга соединения 2a в трехмерную модель колхицинового сайта связывания в тубулине с использованием программ AutoDock Vina 1.1.2 и USCF Chimera 1.13.1. показало, что во всех полученных комплексах лиганд – белок с наилучшими значениями оценочных функций позиция стероидного ядра соединения 2a существенно отличалась от таковой для 2-метоксиэстрадиола, что объясняло неспособность конъюгатов 2a и 2b вызывать деполимеризацию МТ. Однако, для некоторых комплексов лиганд – белок значения оценочных функций были низкими, свидетельствуя о возможности выгодного связывания конъюгата 2a в области, близкой колхициновому сайту тубулина, что теоретически может объяснять наблюдаемую собственную антипролиферативную активность конъюгата. Особый интерес вызвало то обстоятельство, что один из атомов хлора рассматриваемой структуры экспонирован в сторону сайта связывания GTP в -субъединице белка, и может давать слабую галогеновую связь (3.4 Å, 155.6o) с атомом кислорода фосфатной группы GTP. 2. Гетероциклические структуры Поиск новых соединений противоопухолевого действия осуществлялся путем оптимизации структуры известного производного пиримидина А, проявляющего активность по отношению к серии раковых клеточных линий в низких наномолярных концентрациях. Метод синтеза структурных аналогов гетероцикла А разработан нами с использованием ранее открытых нами реакций гетероциклизации с образованием пиримидинового цикла. Для получения модифицированных по размеру алифатического цикла производных пиримидина 3 (структурных аналогов соединения А) предполагалось использовать последовательность реакций гетероциклизации бромфторциклопропана 4, ароматического нуклеофильного замещения с участием 4-фторпиримидин N-оксида 5 и восстановления N-оксидного фрагмента 6 с образованием 4-аминопиримидинов 3. Гетероциклизация бромфторциклопропана 4 под действием смеси концентрированных азотной и трифторметансульфоновой кислот протекала с высоким выходом с образованием гетероцикла 5. Однако оказалось, что реакции нуклеофильного замещения 4-фторпиримидин N-оксида 5 с вторичными аминами (на примере N-метиланилина) не приводят к целевым 4-аминопиримидин N-оксидам 6. Варьирование основания, растворителя, соотношения реагентов, времени и температуры реакции не привели к успеху. Единственным продуктом данной реакции являлся соответствующий 4-тетрагидрохиназолинон, который, по-видимому, образовывался в результате гидролиза фторзамещенного гетероцикла следовыми количествами воды, присутствующими в растворителе. В связи с этим была разработана альтернативная синтетическая схема, в которой использовался менее чувствительный к влаге 4-хлорпиримидин 7. Оптимизация условий ароматического нуклеофильного замещения приводит к образованию 4-аминопиримидинов 3a,b с высокими выходами. Еще один известный структурный тип производных пиримидина, проявляющих противораковую активность – 8-(арилиден)тетрагидрохиназолины. С использованием найденной нами новой реакции конденсации 4-цианотетрагидрохиназолин N-оксидов с ароматическими альдегидами, сопровождающейся восстановлением N-оксидного фрагмента, получена серия новых 4-цианотетрагидрохиназолинов 8a-d, содержащих в положении 8 арилиденовые фрагменты с заместителями различной электронной природы. Изучена противоопухолевая активность полученных гетероциклических соединений 8a-d по отношению к двум клеточным линиям рака человека HCT-116 (рак кишечника) и A549 (легочная карцинома). Соединение 8c проявило умеренную цитотоксическую активность по отношению к обеим клеточным линиям. С целью получения соединений с низкой токсичностью и высокой противоопухолевой активностью в рамках проекта были синтезированы новые производные изоксазола по разработанной оригинальной схеме синтеза, в основу которой положена найденная нами реакция гетероциклизации электрофильных алкенов, приводящая к 4-нитроизоксазолам. Для ацилированных аминоизоксазолов 11a,b и их синтетических предшественников 10a,b изучена способность ингибировать полимеризацию тубулина (клетки А549) по сравнению с колхицином. Найдено, что соединение 9а проявляет значительную цитотоксичность (EC50 = 0.8 µM) и вызывает частичную деполимеризацию МТ при концентрации 100 µM. 3. Структуры с атомом металла Получены новые соединения, содержащие фармакофорные группы ингибитора гликолиза – лонидамин (12 a-c) и селективного агониста RXR рецептора - препарата бексаротен (13 a-c). Соединения получены путем введения двух координирующих лигандов с целью увеличения стабильности в реакциях лигандного обмена, увеличения концентрации доставляемого органического фармакофора и увеличения растворимости (перевод в ионную форму). Изучение антипролиферативной активности новых катионных комплексов Ru с лигандами на основе бексаротена и лондамина показало, что наиболее активным является соединение с бексаротеном и длиной линкера С3 13а (IC50 = 0.22±0.04 µМ), которое избирательно действует на клеточные культуры рака легкого. Таким образом, переход к катионным структурам обеспечивает стабильность соединений, а активность зависит как от природы таргетного фрагмента, так и длины линкера. Получены соединения Ru с антиоксидантной 2,6-ди-трет-бутилфенольной группой. Разработаны синтетические подходы к синтезу данных лигандов с фрагментами 2,6-ди-трет-бутилфенола и имидазолом c различными линкерами и получены комплексы Ru(III) (14a(n=0), b(n=1), c(n=2) и соединения Ru(II) (15) на их основе. Для всех новых комплексов с фенольными фрагментами наблюдается низкая цитотоксичность (клетки A549, MCF7, HCT116), что свидетельствует о существенном «смягчающем» эффекте фенольной группы. 4. Изучение молекулярного механизма действия Проведено комплексное исследование биологической активности комплексов Sn и Au, содержащих антиоксидантный фрагмент 2,6-ди-трет-бутилфенола: RSAuPPh3 (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилтиолат трифенилфосфинзолота Au-II) и RSSnPh3 (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилтиолат)трифенилолова, Sn-II). Сравнительное исследование комплексов Sn и Au и их структурных фрагментов AuPPh3Cl, Ph3SnCl и RSH проводили по следующим направлениям: (1) взаимодействие с активными метаболитами кислорода; (2) влияние на клеточные линии рака человека; (3) влияние на клеточный цикл; (4) влияние структурных фрагментов молекул на активность. Исследование взаимодействия с активными метаболитами кислорода (АМК) Данные изучения антирадикальной активности с помощью ДФПГ-теста электрохимическим методом свидетельствуют о возрастании активности в ряду: RSAuPPh3 (Au-II) (64%) < RSSnPh3 (Sn-II) (71%) < RSH (100%). По данным CUPRAC-теста показано, что исходные комплексы Ph3AuCl и Ph3SnCl не активны в реакции переноса электрона. Наиболее активным соединением является соединение RSSnPh3, для которого тролокс-эквивалент в 1,7 раза выше, чем для стандарта, и в 1,4 раза выше, чем для лиганда RSH. Для соединений золота введение лиганда придает комплексу Au-II антиоксидантную активность. Таким образом можно заключить, что антиоксидантная активность соединений золота и олова с фенольной группой определяется способностью отрыва атома водорода от фенола, т.е. вещества обладают антирадикальной активностью. Исследования in vitro Изучение развития окислительного стресса (ОК) при действии исследуемых соединений. Соединения Au и Sn индуцируют усиление генерации АМК и демонстрируют прооксидантные свойства. Количественный анализ уровня АМК в клетках в зависимости от действия соединений показал, что в клетках НСТ-116 Au-I инициирует значительный ОК, а Au-II вызывает умеренную продукцию АМК. В клетках MCF-7 развивается сильный ОК в присутствии Sn-I (уровень АМК повышается в 2,7 раза по сравнению с контролем); введение антиоксидантного фрагмента снижает прооксидантное действие Sn-II до единицы (не отличается от контроля); в клетках НСТ-116 наиболее высокий уровень АМК индуцирует Sn-II. Исследование цитотоксичности соединений Определение выживаемости клеток проведено в условиях, приближенных к организменным - при совместном культивировании условно нормальных и раковых клеток (MCF-7/GFP и MCF10A/TurboFP635 и A549(GFP)/VA13, меченых флуоресцентными белками. Для условно нормальных клеток MCF10A выживаемость при действии RSAuPPh3 в ~1.3 раза выше. Наблюдается дозозависимый эффект действия для RSAuPPh3, RSSnPh3. Соединение Sn проявляет более высокую цитотоксичность. Изучение апоптоза. Результаты распределения 7-AAD - позитивных и негативных и AnV- позитивных и негативных клеток показало, что комплексы Sn и Au с RS-группой запускают апоптоз. Исследование клеточного цикла. Для исследования влияния соединений на клеточный цикл в культуры клеток вносили соединения в концентрации, превышающей значение IC50 в 2 раза. Результаты исследований свидетельствуют о различии влияния соединений в зависимости от вида клеточных линий. Наибольшее влияние обнаружено на клетках линии HCT-116. Показано различие влияния соединений в зависимости и от природы металла. Таким образом, можно сделать следующие выводы: (1) изученные соединения действуют как прооксиданты, для клеток MCF-7 преобладает накопление АМК в митохондриях$ (2) rомплексы Sn проявляют более высокую цитотоксичность, чем соединения Au; (3) наибольшее влияние обнаружено в клетках HCT-116; введение антиоксидантного фрагмента снижает цитотоксичность и повышает селективность по отношению к опухолевым клеткам; (4) природа металла определяет характер действия на пролиферацию клеток (комплекс Sn вызывает блок на стадии, предшествующей митозу, а комплекс Au действует на пресинтетической стадии.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Новый подход к созданию комбинированных таргетных молекул с противоопухолевым эффектом действия как кандидатов в лекарственные средства
Результаты этапа: Работа выполнена в соответствии с планами на 2020 год. Цель - создание низкомолекулярных синтетических таргетных (мишень-ориентированных) гибридных молекул – кандидатов лекарственных средств, базирующейся на комбинировании химических платформ ряда каркасных, гетероциклических и металлокомплексных соединений, способных селективно связываться с фармакологически значимыми мишенями. 1. Каркасные структуры Проведена модификация ранее обнаруженной уникальной структуры - лиганда колхицинового домена тубулина – 5-(гидроксиметил)-2-метоксифениладамантан-1-ацетата. При биотестировании установлено, что данное соединение эффективно ингибирует пролиферацию клеток при концентрации 10 µM, при которой МТ не затрагиваются, в связи с чем его антимитотическая активность обусловлена взаимодействием не только с тубулином, но и с другой молекулярной мишенью в опухолевых клетках. Синтезированы структурные аналоги тубулокластина - N-{4-[4-(бис(2-хлороэтил)амино)фенил]бутаноил}-N-дезацетилколхицин и 2-бифенил-4-илацетил-N-дезацетилколхицин и проведен молекулярный докинг с целью изучения возможности проявления ими тубулин-кластеризующего действия в опухолевых клетках, и, как следствие, благоприятного токсикологического профиля in vivo. 2. Гетероциклические структуры С целью поиска лигандов колхицинового сайта тубулина в ряду гетероциклических соединений разработан эффективный синтетический подход к 4-аминозамещенным тетрагидрохиназолинам Результаты скрининга противоопухолевой активности методом МТТ N-оксидов на клеточных линиях MCF-7, НСT116, A549 и нормальных клетках WI38, а также ряда ранее синтезированных восстановленных аналогов (IIa-c) приведены по данным МТТ-теста. Показано, что ряд соединений проявляют цитотоксичность в диапазоне микромолярных концентраций. Анализ SAR показывает, что введение N-оксидного фрагмента приводит к двукратному увеличению активности по сравнению с восстановленным аналогом, в то же время соединение 11 менее активно, чем соответствующий тетрагидрохиназолин. Анализ “структура-активность” изученного ряда 4-(N-ациламино)изоксазолов показал, что наличие триметоксифенильного заместителя в положении 3 изоксазола обеспечивает более высокую цитотоксичность по сравнению с ди- и монометоксизамещенными аналогами. Замена п-метильной группы в ацильном фрагменте на м-метил- или п-метоксигруппы приводит к заметному снижению активности соединений. При этом наиболее чувствительными к действию изученных гетероциклов оказались клетки рака толстого кишечника (HCT116). 3. Структуры с атомом металла Соединения олова С целью достижения оптимального соотношения «активность-токсичность» синтезированы новые комплексы оловоорганических соединений с основанием Шиффа, содержащим протекторные фенольные группы (L1) и методом РСА исследованы их кристаллические и молекулярные структуры. Исследование цитотоксичности (МТТ-тест) выявило перспективное соединение, активное в наномолярном диапазоне концентраций (IC50, µM: 0.2±0.1 (HCT-116), 0.3±0.1 (MCF-7). Соединения рутения Для соединений, содержащих векторные фармакофорные группы селективного агониста RXR рецептора - препарата бексаротен и ингибитора гликолиза – лонидамин, проявляющих высокую антипролиферативную активность, проведено изучение редокс-свойств комплексов Ru(III) и Ru(II) методом ЦВА с использованием Pt и СУ рабочих электродов Для достижения оптимального соотношения «активность-токсичность» изучены соединения Ru с лигандами с антиоксидантной 2,6-ди-трет-бутилфенольной группой. Ранее получены лиганды (L1-L4), а также соединения Ru(III) и Ru (II) c аминноимидазольным линкером. На данном этапе синтезированы стабильные в растворах соединения с оксалатной группой, и для проведения анализа SAR изучено влияние длины линкера на свойства соединений. Антипролиферативная активность лигандов L1-L4 и соединений рутения с 2,6-ди-трет-бутилфенольной группой оценена с использования МТТ теста, антирадикальная активность оценена с помощью ДФПГ-теста. Анализ SAR свидетельствует о том, что антипролиферативная активность лигандов L1-L4 и большинства соединений Ru с линкером С3 находится в области высоких микромолярных концентраций, однако увеличение линкера до С6 значительно увеличивает антипролиферативную активность как лиганда, так и соединений Ru. Данные ДФПГ-теста показывают, что лиганды с линкером С3 обладают самой низкой антирадикальной активностью, тогда как увеличение линкера до С6 и координирование Ru значительно увеличивает активность. В соответствии с планом работ для соединений 43 и 47 проведено изучение острой токсичности в экспериментах in vivo на мышах Balb/c. Максимально переносимая доза для соединения 43 составила 100 мг/кг, а для соединения 47 - 62.5 мг/кг.
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Новый подход к созданию комбинированных таргетных молекул с противоопухолевым эффектом действия как кандидатов в лекарственные средства
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".