Сравнительный анализ нейроанатомических, нейроцитологических, поведенческих нарушений в вальпроатной, гиперсеротонинергической и глютеновой моделях аутистических расстройств; поиск путей пептидергической коррекцииНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Сравнительный анализ нейроанатомических, нейроцитологических, поведенческих нарушений в вальпроатной, гиперсеротонинергической и глютеновой моделях аутистических расстройств; поиск путей пептидергической коррекции
Результаты этапа: В 2016 году на модели фетального вальпроатного синдрома показано: - при оценке скорости развития детенышей с ФВС в раннем постнатальном периоде по сравнению с контролем: ухудшение различных показателей, изменение чувствительности к тактильной стимуляции; по имеющимся в настоящее время данным, наиболее значимо в результате введения вальпроевой кислоты возрастает латентный период в тесте «righting reflex»; - при оценке поведения в «открытом поле со сменой освещенности», «приподнятом крестообразном лабиринте», в ходе «принудительного плавания» и др.: снижение исследовательской активности, рост тревожности, депрессивности, ухудшение способности к обучению; характерно также снижение болевой чувствительности (Малышев с соавт., 2013); - при оценке показателей социального поведения в ходе реакции выбора между с матерью и другой кормящей самкой, а также между сибсом и другим крысенком: наибольшую чувствительность проявили показатели «социальной новизны», снижение которых является характерным признаком аутистической патологии (Carter et al., 2011); в сериях экспериментов по анализу детской привязанности в возрасте 10 и 15 дней показано усиление контактов с матерью; в сериях, направленных на изучение материнского поведения – снижение соответствующей мотивации у кормящих самок крыс с ФВС; - при MRI-анализе (магнитно-резонансная томография) обнаружено повышение уровня Т2-сигнала от различных стволовых структур и базальных ганглиев, что свидетельствует о нейродегенеративных процессах, гибели нейронов и обводнении мозговой ткани; - при гистологическом анализе получены данные об изменении соотношения перинуклеарных олигодендроцитов и нейронов. Кроме того, проведены серии экспериментов по корректирующему действию на животных с ФВС семакса, бета-казоморфина-7 и селанка, сопровождаемые MRI и нейроцитологическим анализом.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Сравнительный анализ нейроанатомических, нейроцитологических, поведенческих нарушений в вальпроатной, гиперсеротонинергической и глютеновой моделях аутистических расстройств; поиск путей пептидергической коррекции
Результаты этапа: Целью проекта является сравнительный анализ различных по механизмам развития моделей расстройств аутистического спектра (РАС) на экспериментальных животных, а также поиск путей их направленной пептидергической коррекции. На поведенческом, нейроанатомическом и нейроцитологическом уровнях проводится сопоставление последствий (1) разового пренатального введения высокой дозы вальпроевой кислоты («фетальный вальпроатный синдром» – ФВС); (2) повторного пре- и постнатального введения 5-метокситриптамина (гиперсеротонинергическая модель); (3) повторного постнатального введения опиоидного фрагмента глютена пшеницы экзорфина С. Параллельно оценивается потенциальное защитное (в отношении РАС) действие семакса (синтетический аналог фрагмента АКТГ), селанка (синтетический аналог тафцина), ряда других регуляторных пептидов. В 2017 году основное внимание было сосредоточено на детальном исследовании гиперсеротонинергической модели РАС (введение 5-метокситриптамина в дозе 1 мг/кг сначала самкам, начиная с 12 дня беременности, а затем новорожденным до возраста 20 дней включительно) и модели РАС, связанной с питанием (введение экзорфина С - дельта-селективного пентапептида YPISL, в дозе 5 мг/кг с 1 по 14 дни жизни новорожденных). Полученные результаты сравнивались с выполненными в 2016 году исследованиями модели ФВС. Показано, что применение 5-метокситриптамина (в отличие от введения вальпроевой кислоты) не вызывает у экспериментальных животных морфологических аномалий. Вместе с тем, у подопытных крыс обнаружено уменьшение веса и ряд нарушений раннего психомоторного развития: прежде всего, замедление формирования рефлекса «отрицательный геотаксис» и становления уровня горизонтальной двигательной активности («gait reflex»). При оценке поведения в «открытом поле», «приподнятом крестообразном лабиринте», в ходе «принудительного плавания» у животных, подвергшихся воздействию 5-метокситриптамина, выявлено снижение исследовательской активности, рост тревожности и депрессивности. Общий паттерн этих изменений оказался несколько иным, чем в случае ФВС (например, не зарегистрировано значимого усиления реакций иммобилизации), однако общая направленность эффектов была аналогична. При оценке параметров зоосоциального взаимодействия в возрасте 29 дней животные, получавшие инъекции 5-метокситриптамина, продемонстрировали повышенный уровень двигательной активности и, в результате, увеличение числа контактов как с матерью, так и с «чужой» кормящей самкой без изменения (в случае ФВС – снижения) параметра «социальная новизна». Напротив, в возрасте 36 дней при сравнении взаимодействия с сибсом и «чужим» крысенком аналогичного возраста параметр «социальная новизна» оказался в подопытной группе достоверно ниже контрольного уровня (что не характерно для модели ФВС). Следовательно, «фокус» воздействия 5-метокситриптамина сосредоточен, в отличие от эффектов вальпроевой кислоты, не столько на сфере «детской привязанности» к матери, сколько на показателях «внутристайного» взаимодействия с особями того же возраста. Дополнительное исследование показало, что определенное снижение стремления к социальной новизне сохраняется после введения 5-метокситриптамина и в возрасте 60 дней (половозрелые самцы). В отличие от модели ФВС хроническое воздействие на серотонинергическую систему мозга не привело к изменению показателей, регистрируемых при помощи МРТ. Нейроцитологический анализ позволил выявить увеличение доли перинуклеарных сателлитных олигодендроцитов в поясной извилине животных, получавших 5-метокситриптамин. В сокупности полученные данные позволяют рассматривать гиперсеротонинергический подход как адекватный способ моделирования РАС, эффективно дополняющий ситуацию ФВС. Нами начат анализ способности ряда регуляторных пептидов (семакса, селанка и др.) устранять последствия хронического введения 5-метокситриптамина, который будет завершен в 2018 году. В сериях с инъекциями экзорфина С значимые изменения поведения экспериментальных животных касались лишь тревожности, исследовательской активности, способности к обучению, но не параметров зоосоциального взаимодействия; не зафиксировано эффектов опиоидного фрагмента глютена и при МРТ-анализе, а также применении нейроцитологических методов. Следовательно, гипотезы о связи развития РАС и питания новорожденных не находят подтверждения в наших экспериментах, несмотря на заметную популярность gluten-free / casein-free диет. В ряду дополнительных (не включенных в основной план работ) экспериментов, проведенных нами в 2017 году, следует упомянуть изучение изменений материнского поведения у животных с ФВС и после хронического введения 5-метокситриптамина. Начаты также исследования последствий повторных инъекций вальпроевой кислоты новорожденным крысятам (возраст 6-12 дней) – модели, существенно дополняющей ситуацию ФВС. Показано, что раннее постнатальное введение вальпроата (150 мг/кг) ведет не только к отставленным изменениям поведения (в том числе – зоосоциального), но и вызывает ряд эффектов на молекулярном уровне (увеличение активности генов белков везикулярного транспорта Vamp2 и SNAP-25).
3 1 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. Сравнительный анализ нейроанатомических, нейроцитологических, поведенческих нарушений в вальпроатной, гиперсеротонинергической и глютеновой моделях аутистических расстройств; поиск путей пептидергической коррекции
Результаты этапа: Показателем тревожности в тесте «открытое поле» может служить «центральная активность» – количество пересечений центральной окружности (выходов в середину арены) и пересечений первой окружности (отходы от стенки арены). Интересно, что у крысят, получавших только селанк центральная активность была повышена по сравнению с контролем. Это может свидетельствовать об определенном анксиолитическом действии селанка на здоровых крысят (что является характерным для данного препарата). В группах с моделями аутистической патологии (МАП) достоверно проявилось положительное влияние регуляторных пептидов. Так, после введения селанка на первой минуте тестирования был увеличен пробег (p<0,01); также выросло суммарное время, в течение которого животные находились в движении. При это не выявлено различий между группами по количеству эпизодов груминга и по продолжительности груминга: значения соответствующих показателей в первую минуту тестирования снижены, в сравнении с контролем (признак роста эмоциональной напряженности). На 31-й день жизни в тесте «открытое поле» выраженность отличий между группами уменьшилась по сравнению с результатами, полученными на 21-й день. В случае селанка следует отметить сохранение позитивного влияния на скорость движения крысят МАП. При этом селанк не изменил сохраняющуюся пониженной вертикальную активность животных: количество стоек было на второй и третьей минуте тестирования меньше, чем в контроле. Можно заключить, что такой показатель исследовательского поведения, как стойки, оказался более чувствителен в ситуациях МАП, чем двигательная активность. В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) в первую очередь оценивали уровень тревожности животных. Главным показателем при этом является соотношение времени, проведенного крысами на светлых и темных рукавах лабиринта. Также учитывается интегральный показатель – «поведение риска», представляющий собой сумму поведенческих актов, совершаемых крысой на освещенных частях лабиринта (количество стоек на свету, пересечений внутренней и внешней границ, свешиваний и переходов «свет-свет»). В группах МАП показано достоверное снижение времени, проведенного на открытых рукавах лабиринта за первую минуту, по сравнению с контролем; у животных уменьшено количество стоек в темном отсеке лабиринта (p<0,05). Селанк в данном случае не изменил поведение крысят. В случае семакса при анализе результатов тестов «открытое поле» и ПКЛ также не обнаружено влияния препарата. Имеются лишь единичные эффекты, например, значимое отличие между крысами в числе актов груминга на 3-й минуте тестирования в «открытом поле». После применения бета-казоморфина-7 женского молока отличия зарегистрированы в тесте КПЛ по числу выходов на открытые рукава лабиринта: в группах МАП более одного выхода совершила лишь одна крыса; в группах МАП + казоморфин таких животных было 6 из 16 (p<0,05 по критерию хи-квадрат). На уровне тенденции у крыс, получавших пептид, увеличилось время, проведенное в центре лабиринта. В целом можно говорить о корректирующем влиянии пептида на баланс исследовательской реакции и тревожности. Важно отметить, что в наших предыдущих работах продемонстрировано анксиолитическое влияние бета-казоморфина-7 коровьего молока, но «человеческий» гомолог действует мягче. Изучение особенностей социального поведения крысят с МАП и оценку возможного корректирующего влияния пептидов на параметры этого поведения изучали в тесте «взаимодействие с матерью и чужой самкой», который проводили на 29 день жизни. Показано, что крысята МАП, получавшие в постнатальном периоде как инъекцию растворителя, так и инъекцию пептидов, отличаются по двигательной активности от крысят контрольной группы. В группах, подвергшихся действию ВПК и других препаратов, достоверно увеличено количество пройденных секторов за все время проведения эксперимента, а также количество стоек. Можно сделать вывод, что поведение крысят с МАП в этом тесте характеризуется высокой ориентировочно-исследовательской активностью. Известно, что при РАС довольно часто исследователи отмечают гиперреактивность наряду со сниженным стремлением к социальными взаимодействиям. Кроме того, мы обнаружили значительное увеличение подходов крысят МАП к самкам, находящимся за перегородкой, причем количество подходов к своей матери достоверно отличалось от контроля, а количество подходов к чужой самке – не отличалось, что свидетельствует об изменении социального поведения МАП крысят. После введения селанка количество подходов, как к своей матери, так и к чужой самке оказалось достоверно больше, чем в контроле. Одним из показателей активности детенышей в этом тесте является «социальная новизна», который оценивается как «время, проведенное возле чужой самки» / «время, проведенное возле своей матери». По этому показателю значимых различий между группами в сериях с селанком выявлено не было. Вероятно, наблюдавшееся увеличенное количество подходов к самкам, является следствием двигательной гиперактивности крысят МАП, а не результатом роста стремления к новым социальным контактам. Аналогичные данные получены нами и на 36 день жизни (выбор между сибсом и другим крысенком того же возраста). В случае семакса результаты указывают на корректирующее (в отношении проявлений МАП) влияние гептапептида и его способность повышать стремление к социальной новизне. В группе животных, получавших препарат, достоверно увеличено общее время контакта с чужой самкой и интегральный параметр «социальная новизна», а также более, чем в 2 раза повышено количество стоек в отсеке рядом с чужой самкой. По результатам теста «социальное поведение с сибсом» также заметны улучшения показателей в группе, получавшей семакс: увеличено время, проведенное в отсеке с детенышем из чужого выводка и уменьшено время, проведенное в отсеке с сибсом. Также в группе с введением семакса уменьшено количество стоек в отсеке с сибсом. Таким образом, семакс подтвердил способность положительно влиять на стремление к социальной новизне, что указывает на его важные терапевтические свойства в свете коррекции расстройств аутистического спектра. При оценке зоосоциального взаимодействия крыс, получавших бета-казоморфин-7, удалось выявить только тенденцию к усилению стремления к новым социальным контактам – пептид женского молока оказал лишь слабое корректирующее влияние на проявления МАП (особенно в сравнении с семаксом). Поведенческие проявления депрессивности регистрировали в тесте «принудительное плавание» в возрасте 38 дней. На первой минуте эксперимента в группах крысят с МАП показано достоверное снижение количества эпизодов клайминга, а так же снижение количества актов активного плаванья. Кроме того, обнаружено увеличение суммарного количества эпизодов пассивного плавания по сравнению с контролем. Все это позволяет заключить, что у крысят МАП более выражена депрессивная составляющая поведения. Селанк в этом случае оказался неэффективен; положительный эффект семакса – вновь достоверен. У животных, получавших аналог фрагмента АКТГ, оказалась увеличена длительность 1-ого эпизода активного плавания, увеличен латентный период иммобилизации. После введения бета-казоморфина-7 уменьшилось количество эпизодов иммобилизации; общая длительность активного плавания стабильно превышала 40 сек (p<0,05 по сравнению с группой, подвергшейся воздействию только ВПК). В тесте «горячая пластина», проводимом на 42 день жизни, показано увеличение порога болевой чувствительности в группах МАП. Кроме того, в контрольной группе при повторном тестировании наблюдалось снижение времени реакции облизывания лапы, у крысят с МАП данный показатель, напротив, возрастал. Селанк в этом тесте вызвал достоверное отставленное снижение порога болевой чувствительности у здоровых животных, но не повлиял на крысят с МАП. Семакс, напротив, не меняя реакции интактных крыс, оказался способен нормализовать ноцицепцию потомства с МАП. То же можно сказать и о группах с бета-казоморфином-7: пептид (как и семакс) оказал истинно корректирующие влияние на болевую чувствительность экспериментальных животных. При выработке условной реакции пассивного избегания (48-50 дни жизни) не зафиксировано изменений в способности к обучению с отрицательным подкреплением у крыс с МАП. Не проявили своего действия как селанк, так и бета-казоморфин-7; в случае семакса обнаружено положительное влияние пептида на способность к обучению вне зависимости от введения ВПК.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".