Роль миогенных ретроградных сигнализаторов (BDNF и эндоканнабиноидов) в регуляции квантовой секреции ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах мышиНИР

The role of myogenic retrograde signaling factors (BDNF and endocannabinoids) in the regulation of quantal secretion of acetylcholine in neuromuscular junctions of mice

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 15 января 2019 г.-25 декабря 2019 г. Роль миогенных ретроградных сигнализаторов (BDNF и эндоканнабиноидов) в регуляции квантовой секреции ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах мыши
Результаты этапа: В 2019 г. с использованием внутриклеточной микроэлектродной регистрации постсинаптических потенциалов обнаружены острые пресинаптические эффекты сериновой протеазы тромбина, апплицируемого в низкой концентрации (1 нМ) на моторные синапсы интактной скелетной мышцы - диафрагмы (m. diaphragma) и мышцы голени (m. extensor digitorum longus (m. EDL), находящейся на ранних стадиях реиннервации и новообразования моторных синапсов. Впервые показано, что у интактных мышц (диафрагмы и m. EDL) тромбин (1 нМ) быстро – в течение 15-30 минут - приводит к достоверному приросту средней амплитуды одноквантовых миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) на 25-30%, а также к параллельному (на 25-28%) возрастанию амплитуды вызванных раздражением нерва мультиквантовых ПКП, наблюдаемому по всему ходу ритмического залпа ПКП (50 Гц, 1 с), но при этом квантовый состав ПКП статистически значимо не менялся. В новообразованных синапсах m. EDL действие тромбина также приводило - наряду с увеличением амплитуды МПКП - и к равномерному приросту амплитуды ПКП по всему ходу залпа на 30-35%. Так же, как в зрелых синапсах, в новообразованных в ходе реиннервации нервно-мышечных контактах расчет значений квантового состава ПКП не выявил достоверных изменений этого параметра синаптической активности на фоне 1 нМ тромбина. Установлено, что и в зрелых, и в новообразованных синапсах тромбин утрачивал способность вызывать быстрое увеличение амплитуды МПКП на 25-30% в присутствии везамикола (прямого ингибитора везикулярного АХ-транспортера) и бафиломицина А1 (блокатора везикулярного протонного насоса). Это позволило предположить, что эффекты тромбина связаны с увеличением загрузки АХ в синаптические везикулы, приводя к увеличению размера кванта. Имея в виду, что аналогичный эффект - усиление накачки АХ в везикулы - был ранее нами показан при действии экзогенного BDNF на интактные синапсы (Gaydukov et al., 2019), а также то обстоятельство, что в нервно-мышечных синапсах не обнаружено пресинаптических рецепторов тромбина на моторных нервных терминалях, но присутствуют мышечные рецепторы PAR1 (protease-activated receptors) (Lanuza et al., 2003; Lanuza et al., 2007), а также установленный факт присутствия BDNF в составе скелетных мышечных волокон и возможность его высвобождения из мышцы (Hurtado et al., 2017), была выдвинута гипотеза, согласно которой эффекты тромбина могут быть опосредованы активацией мышечных PAR1, запускающей последующий выброс миогенного BDNF с финальным ретроградным пресинаптическим действием BDNF на амплитуду постсинаптических потенциалов. Анализ эффектов тромбина и BDNF (оба – 1 нМ) в присутствии АNA12 (10 мкМ) или циклотраксина B (100 нМ), аллостерических антагонистов рецепторов BDNF (TrkB) - подтвердил это предположение. Впервые установлено, что такое фармакологическое ингибирование ТrkB полностью предотвращает прирост амплитуд МПКП и ПКП, вызываемый действием не только BDNF, но и тромбина, причем как в интактных зрелых, так и в новообразованных моторных синапсах мыши. Оказалось также, что экзогенный BDNF вызывает сходный с эффектом тромбина прирост амплитуд ПКП (на 30%) в ходе ритмической активности моторных синапсов, сопровождающийся увеличением амплитуд МПКП в тех же синапсах. Квантовый состав ПКП при этом статистически значимо не менялся, за исключением первых семи ПКП в залпе, где имел место достоверный прирост значения этого параметра на 20%. Расчет размера готового к высвобождению пула везикул – RRP (ready releasable pool) и вероятности высвобождения квантов медиатора (p) с использованием последовательной модели (Ruiz et al., 2011; Cano et al., 2012; Miteva, Gaydukov, Shestopalov, Balezina, 2018) показал, что прирост квантового состава ПКП в начале залпа обеспечивается возрастанием вероятности выброса квантов АХ (р), а не RRP под действием нейротрофина. При этом основной вклад в прирост амплитуды ПКП по ходу всего ритмического залпа на фоне BDNF (как и при аппликации тромбина) вносит увеличение размера кванта АХ. Таким образом, впервые в мировой практике получены свидетельства в пользу существования у тромбина (и у BDNF) ранее не описанной функции, характерной как для новообразованных, так и зрелых моторных синапсов. До сих пор тромбин был известен как миогенный фактор синаптогенеза, регулирующий элиминацию избыточных моторных терминалей и синапсов в период их новообразования в раннем онтогенезе или при денервационно-реиннервационных перестройках мышц (Nishibori et al.,1995; Zoubine et al., 1996; Suidan et al.,1992). В нашей работе впервые показано, что эта протеаза способна оказывать ранее не описанное, быстрое регуляторное воздействие на синаптическую передачу как в новообразуемых, так и зрелых моторных синапсах. Получены свидетельства, что тромбин способен через активацию мышечных (постсинаптических) PAR1 запускать выброс миогенного BDNF, который оказывает ранее не описанные в литературе ретроградные рецепторные воздействия на нервные терминали, стимулируя накачку АХ в везикулы и увеличивая размер квантов АХ. Далее, в контексте открывшихся новых фактов о необычной (не описанной ранее в литературе) пресинаптической активности BDNF, были проведены дополнительные серии исследований механизмов необычного пресинаптического действия экзогенного BDNF. Опираясь на ранее полученные данные о возможных множественных каскадах, запускаемых активацией TrkB со стороны BDNF в нейронах и терминалях ЦНС (Lohov et al., 1993; Jovanovic et al., 1996; Park, Poo, 2013; Kowianski et al., 2018), были использовали ингибиторы определенных участников этих каскадов – PLC (U73122, 5 мкM), MEK1/2 (U0126, 20 мкM) и PKA (H89, 1 мкМ) – в сочетании с действием экзогенного BDNF (1нМ) на моторные синапсы. Это позволило впервые установить, что в случае присутствия BDNF в моторных синапсах и запуска его пресинаптического рецепторного действия (приводящего к приросту амплитуды постсинаптических потенциалов), в терминалях запускается пресинаптический сигнальный каскад с участием митоген-активируемых протеинкиназ (в частности MEK1/2-Erk). Действуя в комплексе с конститутивной активностью PKA терминалей, именно этот каскад обеспечивает усиление накачки АХ в везикулы. Одновременно была выявлена способность экзогенного BDNF независимо от стимулирования накачки АХ в везикулы вызывать значительный прирост частоты МПКП, но только в зрелых, а не в новообразованных синапсах. Возрастание частоты МПКП под действием нейротрофина предотвращалось ингибированием PLC, но было устойчиво по отношению к ингибиторам MEK1/2 и PKA. В новообразованных синапсах даже фармакологическая стимуляция PLC с помощью активатора данного фермента m-3M3FBS (10 мкМ) оказалась неспособной вызвать прирост частоты МПКП. Таким образом, полученные на первом году выполнения проекта данные позволяют сделать следующее заключение: как в зрелых, так и в новообразованных синапсах может иметь место тромбин-индуцированный выброс миогенного BDNF и ретроградное облегчающее действие нейротрофина на синаптическую передачу - путем активации TrkB-рецепторов терминалей и запуска внутриклеточного каскада реакций, приводящего к увеличению размеров квантов АХ. Второе направление исследований 2019 года было посвящено выявлению возможной активности эндоканнабиноидов в регуляции спонтанной и вызванной активности моторных синапсов диафрагмы мыши. Анализ эффектов антагониста/обратного агониста эндоканнабиноидных рецепторов CB1 – АМ-251 (1 мкМ) не выявил статистически значимых изменений ни частоты МПКП, ни их амплитуды или временных характеристик на протяжении 1 часа аппликации. Далее было проведено тестирование эффектов агониста СВ-рецепторов WIN 55,212-2 (WIN) в концентрации 20 мкМ на параметры спонтанной секреции АХ в течение 1 часа. Значение МП мышечных волокон на фоне действия WIN в течение 1 часа не изменилось по сравнению с контролем (70.4 ± 1.4 мВ (n = 38)) и составило –73.2 ± 1.6 мВ (n = 38, p > 0.05). Средняя амплитуда МПКП незначительно (недостоверно) возрастала от 1.44 ± 0.08 мВ в контроле до 1.62 ± 0.11 мВ на фоне действия WIN (p>0.05). Время нарастания и полуспада МПКП при этом не изменились. Единственным параметром МПКП, значительно изменившимся под действием WIN, оказалась средняя частота МПКП, которая увеличилась от 0.98 ± 0.07 Гц в контроле до 1.53 ± 0.13 Гц на фоне WIN (p< 0.05), т.е. более чем на 50% по сравнению с контролем. Анализ динамики развития эффекта выявил тенденцию к росту частоты МПКП уже в первые 30 мин присутствия WIN с последующим (30-60 мин) статистически значимым возрастанием частоты МПКП по сравнению с контролем. Далее было установлено, что способность WIN индуцировать прирост частоты МПКП полностью предотвращается на фоне действия антагониста CB1-рецепторов АМ-251 (1 мкМ). В следующих сериях экспериментов был проведен анализ возможных сигнальных каскадов, которые могут запускаться при действии WIN на пресинаптические СВ1-рецепторы и приводить к значительному и стойкому приросту спонтанной секреторной активности синапсов. Для этого эффекты WIN исследовали на фоне ингибиторов ферментативных участников возможных сигнальных каскадов, запускаемых при активации СВ1-рецепторов - PLC, PKC и PKA – U73122 (5 мкМ), хелеритрина (4 мкМ) и H89 (1 мкМ), соответственно. Мы впервые установили, что вызываемое WIN потенцирование спонтанной квантовой секреции АХ в виде развивающегося стойкого возрастания частоты МПКП может быть связано с запуском в нервных терминалях каскада реакций с участием PLC в сочетании с PKC, но не PKA (WIN утрачивал способность увеличивать частоту МПКП в условиях предварительной аппликации U73122 и хелеритрина, но не H89). Наконец, был проведен (ранее не запланированный, но оказавшийся актуальным в контексте полученных данных) анализ возможного участия депонированного кальция, выбрасываемого из рианодин-чувствительных кальциевых депо терминалей, в WIN-индуцированном приросте частоты МПКП. Мы установили, что блокирование рианодиновых рецепторов 5 мкМ рианодина само по себе не вызывавшее изменений параметров МПКП, полностью предотвращает прирост частоты МПКП под действием WIN. Таким образом, в рамках первого года выполнения проекта впервые получены свидетельства возможного присутствия на моторных нервных терминалях пресинаптических эндоканнабиноидных рецепторов СВ1-типа, активация которых (с помощью синтетического агониста WIN 55,212-2) приводит к стойкому ускорению спонтанной секреции квантов АХ за счет активации пресинаптической PLC, PKC и выброса депонированного кальция.
2 1 января 2020 г.-26 декабря 2020 г. Роль миогенных ретроградных сигнализаторов (BDNF и эндоканнабиноидов) в регуляции квантовой секреции ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах мыши
Результаты этапа: . Результаты первого направления исследований касаются раскрытия роли и активности экзогенного и эндогенного BDNF в моторных синапсах. 1) Впервые подробно описана динамика изменений уровня синаптической передачи (в виде изменений амплитуды и квантового состава потенциалов концевой пластинки) на протяжении длинных (2 мин, 30 Гц) ритмических залпов ПКП в быстрой мышце голени m. EDL мыши. Она была сопоставлена с динамикой изменений параметров ПКП в коротких (1 с, 50 Гц) залпах. По ходу длинных залпов наблюдали депрессию передачи с уменьшением амплитуды и квантового состава ПКП к концу залпа - в среднем до 35-40% от исходного (ПКП1) в залпе. При этом амплитуда МПКП, зарегистрированных до и после залпа статистически значимо не менялась. Оказалось, что уменьшение амплитуды ПКП имеет пресинаптическую природу и однозначно связано со снижением квантового состава ПКП на всем протяжении залповой активности синапсов. При этом депрессия передачи имела, как минимум, две фазы: первую, более быструю (1-10 с), с монотонным спадом квантового состава ПКП, в среднем, до 70-75% по сравнению с ПКП1 и вторую (10-120 c) – с более медленной кинетикой спада амплитуды и квантового состава ПКП до 30-35% от значений этих параметров для ПКП1. Преаппликация BDNF (1 нМ) либо агониста ТrkB рецепторов LM22A4 (1-5 мкМ) приводила к единообразному возрастанию амплитуды МПКП (как до, так и после залпа), и амплитуды ПКП1 (на 35-40%); квантовый состав ПКП1 при этом не изменялся. Необходимо отметить, что по ходу длинного залпа динамика изменения амплитуды не отличалась от контрольной: несмотря на присутствие BDNF или LM22A4, к 10-й секунде и позже по ходу залпа значения амплитуды и квантового состава ПКП составляли к концу длинного залпа 30-35% от ПКП1. Таким образом, мы установили, что и сам BDNF, и агонист TrkB-рецепторов LM22A4, хотя и вызывают сходный прирост значений амплитуды МПКП и ПКП (как это и было в коротких залпах ПКП) по абсолютным значениям, но этого действия недостаточно, чтобы значимо повлиять на динамику синаптической передачи и ослабить снижение амплитуды ПКП и депрессию передачи по ходу длинного залпа. Напомним, что в коротком залпе ПКП (1 с, 50 Гц) как в контроле, так и при действии BDNF, наблюдается незначительное снижение амплитуды и квантового состава ПКП к концу залпа на 20-25% от ПКП1. Однако достоверный прирост квантового состава ПКП под действием BDNF (на 18-20%) в самом начале короткого залпа быстро нивелировался по ходу залпа ПКП, становясь статистически не отличимым от квантового состава ПКП в контроле уже к 8му ПКП в коротком ритмическом залпе (Gaydukov et al., 2019). Полученные результаты о способности BDNF стойко увеличивать амплитуду МПКП и (за счет этого) и ПКП как в коротких, так и длинных ритмических залпах в моторных синапсах, существенно дополняют имевшиеся в литературе сведения о способности экзогенного BDNF облегчать нервно-мышечную передачу и сокращение диафрагмы (Mantilla et al., 2004) или увеличивать амплитуду одиночных ПКП (Zhan et al., 2003; Lohof et al., 2003). Вместе с тем, нами впервые показано, что в интенсивно и продолжительно работающих моторных синапсах, несмотря на сохраняющееся потенцирующее действие экзогенного BDNF на амплитуду МПКП и ПКП (и квантовый состав ПКП), этого оказывается не достаточно, чтобы компенсировать развитие выраженного торможения секреции ацетилхолина (АХ) и депрессии синаптической передачи. Таким образом, мы впервые установили, что облегчающее действие BDNF на синаптическую передачу в краткосрочных залпах не отменяет развития депрессии передачи при увеличении продолжительности залповой активности синапсов. В следующей серии исследовали, как отразится на характере синаптической передачи в ходе длительного ритмического залпа ПКП ингибирование TrkB-рецепторов. Мы установили, что аллостерический антагонист TrkB-рецепторов циклотраксин В (100 нМ) сам по себе не влиял на амплитуду МПКП и одиночных ПКП. Однако циклотраксин В противодействовал уменьшению амплитуды и квантового состава ПКП и развитию депрессии по ходу ритмического залпа. В результате был менее выражен по сравнению с контролем быстрый спад амплитуды и квантового состава ПКП в первые 10 секунд высокочастотной синаптической активности: к окончанию этого периода удерживался более высокий уровень амплитуды ПКП (70-75% от ПКП1). Такое противодействие депрессии передачи сохранялось и далее по всему ходу залпа. В результате, к концу длинного залпа ПКП снижение амплитуды и квантового состава ПКП в присутствии циклотраксина В было статистически значимо менее выражено, нежели в контрольных залпах (30-35% от ПКП1) и достигало лишь 45-50% от ПКП1. Полученные данные позволяют предполагать, что в ходе ритмической активности в моторных синапсах, видимо, может иметь место выброс и накопление эндогенного регулятора передачи, действующего через пресинаптические TrkB-рецепторы в направлении торможения вызванного выброса АХ. Участвует ли в этом непосредственно эндогенный BDNF, как один из агонистов TrkB-рецепторов (в случае его предположительного высвобождения и ретроградного действия в ходе продолжительной активности синапсов) – вопрос, требующий дальнейшего изучения. В наших опытах не было обнаружено прямого тормозного пресинаптического действия экзогенного BDNF на вызванную секрецию АХ ни в коротких, ни в длинных залпах ПКП (см. вышеприведенные данные отчета). В связи с этим, более вероятным выглядит предположение, что выключение из активности TrkB-рецепторов ослабляет баланс других пресинаптических рецепторов, действующих сопряженно с TrkB: ослабляет тормозные и/или усиливает облегчающие рецепторные воздействия со стороны других модуляторов, одновременно включенных в активность с TrkB-рецепторами и BDNF. Это созвучно имеющимся в литературе высказываниям о наличии в моторных синапсах сопряженной регуляции нервно-мышечной передачи с одновременным участием TrkB/BDNF и комплекса других модуляторов и их рецепторов (аденозиновых, мускариновых), осуществляющих взаимосвязанную регуляцию пресинаптических ферментов и самой секреции АХ (Thomas et al., 2014; Lanuza et al., 2019). Отметим, однако, что возможность прямого тормозного пресинаптического действия BDNF через TrkB-рецепторы на выброс медиатора показана недавно в ряде синапсов ЦНС при их ритмической активности (Selvam et al., 2018; Wu et al., 2020). 3. Третья серия экспериментов, выполненная в 2020 году, была посвящена проверке выдвинутой нами ранее гипотезы о возможном присутствии (либо выбросе) эндогенного тромбина в синапсах как активатора мышечных PAR1 рецепторов, влияющего на высвобождение миогенного BDNF –и через его посредство - на вызванную секрецию АХ в моторных синапсах (Gaydukov et al., 2018; Gaydukov et al., 2019). Для выявления возможного выброса эндогенного тромбина во время продолжительной активности синапсов (2 мин, 30 Гц) и его эффектов на передачу мы анализировали изменения амплитуды и квантового состава ПКП в длинном залпе в контроле и на фоне антагониста PAR1-рецепторов SCH79797 (1 мкМ). SCH79797 не оказывал влияния на параметры МПКП и ПКП в начале длинного залпа, но на его фоне, начиная с 45й секунды высокочастотной стимуляции, наблюдается небольшое (10%), но статистически значимое снижение амплитуды и квантового состава ПКП в залпе по сравнению с контролем. Негативное влияние ингибирования постсинаптических PAR1-рецепторов (Lanuza et al., 2007) на синаптическую передачу в условиях продолжительной активности синапсов может, во-первых, свидетельствовать о выделении из мышечных волокон эндогенного тромбина при длительной ритмической активности моторных синапсов. Принципиальная возможность такого процесса была показана ранее (Zoubine et al., 1996; Glazner et al., 1997; Kim et al., 1998). Во-вторых, учитывая постсинаптическую локализацию PAR1-рецепторов в моторных синапсах, данные, полученные в этой серии экспериментов, позволяют предположить выброс под действием эндогенного тромбина ретроградного сигнализатора (скорее всего, BDNF (Gaydukov et al., 2019)), обладающего пресинаптическим действием, направленным на поддержание передачи при длительной высокочастотной активности синапсов. Неизбежно возникает вопрос, с чем может быть связана разнонаправленность и разное время (по ходу залпа) проявления эффектов антагониста TrkB-рецепторов циклотраксина B и ингибитора PAR1-рецепторов SCH79797, которые на разных уровнях терминируют развитие одного и того же предполагаемого BDNF-опосредованного ретроградного сигнального каскада? Вероятно, такие различия могут быть обусловлены большим количеством сигналов, помимо тромбина, обеспечивающих разный паттерн выброса BDNF в моторных синапсах (Hurtado et al., 2017), что может приводить к активации нейротрофином не только TrkB-рецепторов (Perez et al., 2019), вызывая развитие комплексных эффектов со сложными механизмами реализации. 4) Ввиду обнаруженной нами ранее уникальной и наиболее выраженной у BDNF в нервно-мышечных синапсах способности стимулировать транспорт АХ в синаптические везикулы и, тем самым, повышать размер квантов АХ, действуя через пресинаптические TrkB (Gaydukov et al., 2018; Gaydukov et al., 2019), проводили более детальный анализ механизмов такого действия BDNF. В частности, исследовали роль определенных пресинаптических изоформ протеинкиназы С (PKC-бета и PKC-эпсилон) в эффектах BDNF, связанных с регуляцией квантовой секреции АХ. Ранее при стимуляции TrkB-рецепторов было показано с помощью биохимических методов увеличение активности этих изоформ PKC, их взаимодействие между собой, и их возможные мишени в нервных терминалях моторных синапсов (Obis et al., 2015; Hurtado et al., 2017; Simo et al., 2018; Simo et al., 2019). Выявление роли этих изоформ ПКС в реализации пресинаптических эффектов BDNF, исследовали с помощью избирательного ингибитора бета-изоформ PKC ингибитора транслокации PKC-эпсилон, препятствующего активации этой изоформы PKC. Сами по себе оба ингибитора изоформ PKC не меняют параметры спонтанной и вызванной (при стимуляции нерва 50 Гц, 1 с) секреции АХ. При этом в присутствии каждого из ингибиторов экзогенно апплицируемый BDNF сохраняет способность вызывать прирост частоты МПКП, однако полностью утрачивает способность увеличивать амплитуду МПКП. Что касается высокочастотной вызванной активности моторных синапсов, то оба ингибитора изоформ PKC действовали одинаково - полностью предотвращали описанное нами ранее (Gaydukov et al., 2019) увеличение амплитуды ПКП (и квантового состава ПКП в начале залпа) в коротком ритмическом залпе. Полученные данные не имеют аналогов в мировой литературе и могут свидетельствовать об участии не только протеинкиназы А (PKA) и митоген-активируемых протеинкиназ в реализации увеличения размера квантов АХ в результате TrkB-опосредованного действия BDNF, как мы показали ранее (Gaydukov et al., 2019), но и протеинкиназ C-бета и -эпсилон, которые в моторных синапсах локализованы пресинаптически, и обладают широким спектром мишеней (Obis et al., 2015; Simo et al., 2018; Simo et al., 2019). Гипотеза об участии изоформ PKC в регуляции транспорта АХ в синаптические везикулы и, следовательно, размера кванта АХ, требует дальнейшей экспериментальной проверки, но выглядит очень заманчивой, учитывая данные, полученные не на нервно-мышечных синапсах, об усиливающем действии PKC на работу везикулярного ацетилхолинового транспортера (Barbosa Jr. et al., 1997; Loureiro-dos-Santos et al., 2002). 5. В отдельной серии экспериментов в 2020м году эффекты BDNF были сопоставлены с активностью его молекулы-предшественника проBDNF в моторных синапсах диафрагмы и m. EDL. В отличие от зрелого BDNF, оказывающего целый ряд потенциирующих воздействий на параметры МПКП и ПКП в зрелых синапсах (см. выше в отчете), проBDNF не влиял ни на МП, ни на параметры спонтанной секреции АХ (среднюю амплитуду и частоту МПКП), а также - на квантовый состав одиночных ПКП в моторных синапсах диафрагмы и m. EDL на протяжении 60 минут его аппликации на нервно-мышечные препараты. В связи с отсутствием эффектов проBDNF, направленных на изменение активности зрелых синапсов, была предпринята дополнительная (не запланированная на 2020-й год) серия экспериментов по выявлению возможных эффектов проBDNF у функционально незрелых моторных синапсов m. EDL, находящееся на ранних стадиях формирования в ходе реиннервации. Это было предпринято в связи с описанной в литературе преимущественной активностью проBDNF именно на стадиях развития и морфогенеза синапсов (Je et al., 2013). Нами было установлено, что у новообразованных синапсах сам ВDNF вызывает прирост амплитуды МПКП в полтора раза (от 0.98±0,06 мВ в контроле до 1.48±0.07 мВ (p<0.05)), сопоставимый с таковым в зрелых интактных синапсах. Однако, в отличие от зрелых синапсов, здесь BDNF не вызывал прироста частоты МПКП. Эффекты проBDNF в новообразованных синапсах также оказались специфичными. Впервые установлено, что проBDNF (в отличие от BDNF) не оказывает никакого влияния на амплитуду МПКП, однако вызывает неожиданный эффект: стойкое подавление спонтанной секреции АХ. Частота МПКП у новообразованных синапсов (несмотря на более низкие значения по сравнению с интактными синапсами), еще более снижается – от 0.30±0.05 Гц в контроле до 0.15 ± 0.02 Гц под действием проBDNF (p<0.05). Таким образом, в новообразованных моторных синапсах обнаружены противоположно направленные эффекты BDNF и проBDNF в отношении спонтанной секреции АХ, что созвучно описанным в литературе альтернативным эффектам этих белковых регуляторов в неонатальных моторных синапсах (Je et al., 2012; Je et al., 2013) и в синапсах ЦНС (Gibon et al., 2016.) Механизмы и возможный биологический смысл обнаруженных различий в эффектах BDNF и проBDNF у новообразованных синапсов по сравнению со зрелыми будут исследованы на третьем году выполнения проекта. Конкретнее, будет прослежена возможная связь между устойчивостью частоты МПКП к действию BDNF и уровнем активности фосфолипазы C. Будет проверено, связано ли снижение частоты МПКП под действием проBDNF с возможной активацией пресинаптических калиевых каналов GIRK (Coulson et al., 2008) и/или других механизмов. 6). Следующая серия экспериментов, предусмотренная на 2020-й год, была посвящена анализу эффектов продомена (пропептида) BDNF, являющегося продуктом внеклеточного протеолитического процессинга проBDNF, который в результате расщепляется на зрелый BDNF и продомен. Наравне с BDNF, продомен может оказывать самостоятельное действие в синапсах ЦНС, действуя не преимущественно на TrkB-рецепторы, как BDNF, а на рецепторы p75 (Mizui et al., 2017; Kojima et al., 2019). Полученные нами в этой серии экспериментов данные не имеют аналогов в мировой литературе. Впервые проведенные нами острые эксперименты с аппликацией на нервно-мышечный препарат диафрагмы мыши продомена BDNF (1 нМ) показали, что, не меняя уровень мембранного потенциала мышечных волокон, он угнетает спонтанную секрецию АХ, вызывая статистически значимое уменьшение амплитуды МПКП от 1.50±0.04 мВ в контроле до 1.30 ± 0.04 мВ на фоне действия продомена (p<0.05), сопровождавшееся снижением частоты МПКП (0.40±0.03 Гц в контроле, 0.32 ± 0.02 Гц при действии продомена ((p<0.05)). Если снижение амплитуд МПКП при постоянстве МП (достаточно редкий феномен) может иметь как пре-, так и постсинаптическую природу, то изменение частоты МПКП служит подтверждением пресинаптического действия продомена BDNF, направленного, скорее всего, на снижение уровня концентрации ионов кальция в нервной терминали. Более того, продомен BDNF оказывал противоположное зрелому нейротрофину действие не только на спонтанную, но и на вызванную секрецию АХ в коротких ритмических залпах ПКП (50 Гц, 1 с), вызывая, наряду с уменьшением амплитуды МПКП, уменьшение амплитуды многоквантовых вызванных ПКП на 25% по всему ходу короткого ритмического залпа. Кроме того, продомен BDNF снижал и квантовый состав ПКП в залпе, особенно в его начале, на стадии начального облегчения. Как мы показали ранее, выраженность начального облегчения в коротком высокочастотном залпе зависит от активности внутритерминальных кальциевых депо (Gaydukov et al., 2009), что позволяет предполагать угнетение работы кальциевых депо под действием продомена, что вызывает снижение в районе активных зон кальциевого сигнала, необходимого для запуска экзоцитоза синаптических везикул и снижение квантового состава. Вопрос, на каком уровне (пре- или постсинаптическом) реализуется продомен-индуцированное снижение амплитуд МПКП и ПКП – в настоящий момент не ясно, особенно с учетом описанного присутствия p75-рецепторов, на которые действует продомен, не только на пресинаптической мембране, но и на мембране мышечных волокон (Garcia et al, 2010). Впервые обнаруженная нами регуляторная активность продомена BDNF в отношении квантовой секреции АХ в моторных синапсах подтверждает самостоятельную биологическую значимость этого пептида в качестве сигнальной молекулы и в определенной степени созвучна описанным недавно самостоятельным регуляторным эффектам продомена BDNF в центральных синапсах (Mizui et al., 2017; Kojima et al., 2019). Второе генеральное направление исследований в 2020 году было посвящено анализу режимов работы синапсов при действии каннабиноидов. 1) Проведен анализ острых эффектов синтетического агониста эндоканнабиноидных рецепторов CB1- типа WIN 55,212-2 (WIN, 20 мкМ) при его аппликации на нервно-мышечный препарат на протяжении 60-90 минут с точки зрения изменений амплитуды и квантового состава ПКП в ходе коротких ритмических залпов ПКП (50 Гц, 1 с). Ранее (на первом году выполнения проекта) мы установили, что в присутствии WIN амплитуда МПКП сохраняется без изменений, тогда как происходит возрастание частоты МПКП более чем на 50% (Gaydukov et al., 2020). Проведенные в 2020-м году исследования вызванной синаптической активности моторных синапсов показали, что в присутствии WIN не происходит статистически значимых изменений амплитуды и квантового состава ПКП в коротких ритмических залпах. 2) В следующих сериях выясняли, как соотносится обнаруженное облегчающее частоту МПКП действие синтетического агониста CB-рецепторов WIN с действием двух «классических» эндоканнабиноидов – анандамида (АЕА) (30 мкМ) и 2-арахидонилглицерола (2-АG, 1 мкМ). Мы установили, что АЕА не влияет на МП мышечных волокон, однако, подобно WIN, вызывает возрастание частоты МПКП – от 0,37 ± 0,03 Гц в контроле до 0,65 ± 0,05 Гц на 2-й час аппликации АЕА (p<0,05), без достоверных изменений амплитуды МПКП, которая составила 1,61±0,14 мВ в контроле, и 1,64±0,14 (p>0,05) на 2-м часу воздействия АЕА. При этом анализ динамики эффектов АЕА выявил медленное развитие эффекта, достигавшее максимума в течение около 1.5 часов от начала аппликации АЕА на нервно-мышечный препарат. Далее в отдельной серии экспериментов было установлено, что АМ-251 (1 мкМ), обратный агонист СB1-рецепторов, сам по себе не вызывал изменений параметров МПКП и МП мышечных волокон в течение 2х часов. При сочетанной аппликации с АЕА АМ-251 полностью предотвращал прирост частоты МПКП, вызываемый АЕА. Далее необходимо было выявить механизм, лежащий в основе обнаруженного эффекта АЕА. Ингибитор фосфолипазы С – U73122 (5 мкМ) оказался не способен предотвратить прирост частоты МПКП, вызываемый АЕА, тогда как в присутствии ингибитора PKA Н89 (1мкМ) АЕА полностью утратил способность вызывать постепенное увеличение частоты МПКП. Наконец, нитрендипин (1 мкМ), блокатор потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа, сам по себе не влиявший на параметры МПКП, также предотвращал прирост частоты МПКП, вызванный АЕА. Таким образом, воздействие АЕА, хотя и оказалось сходно по направленности с эффектами WIN в потенцировании частоты МПКП, но не совпадало по механизму действия и участию в нем пресинаптических ферментов и кальциевых каналов. Впервые проведенное в отдельной серии тестирование эффектов АЕА в отношении краткосрочной высокочастотной активности диафрагмальных синапсов (50 Гц, 1 с) выявило, что АЕА вызывает достоверный прирост амплитуды и квантового состава ПКП на 25% в начале залпа. Оказалось, что несмотря на возросший в присутствии АЕА уровень амплитуды и квантового ПКП, происходит ускоренный спад и амплитуды, и квантового состава ПКП в ходе короткого ритмического залпа. В результате на фоне АЕА возникает более выраженная депрессия в начале залпа, чем в контроле. Согласно общепринятым в настоящее время представлениям о возможных механизмах такой ускоренной депрессии и спаде амплитуды ПКП в ходе короткого ритмического залпа при исходно повышенном уровне квантового состава ПКП (Slater, 2015), можно предполагать, что под действием АЕА возрастает вероятность (P) многоквантового вызванного выброса медиатора. Это приводит к быстрому истощению пула готовых к выбросу везикул и ускоренному спаду амплитуды и квантового состава ПКП при высокочастотной ритмической активности синапсов. В следующей серии эффекты АЕА сопоставляли с характером действия на параметры спонтанной секреции другого эндоконнабиноида – 2-АG. МП мышечных волокон не менялcя под действием 2-AG. В отличие от АЕА, не наблюдалось также и статистически значимых изменений средней частоты МПКП: в контроле она составила 0,46±0.04 Гц, 0,46±0.04 Гц за первый и 0,38±0.04 Гц за второй час аппликации 2-AG (p>0,05). При этом было выявлено постепенное медленно развивающееся возрастание амплитуды МПКП в среднем, на 50% - от 1,35 ± 0.11 мВ в контроле до 2,03±0,24 мВ ко второму часу воздействия 2-АG (p<0,05), которое, подобно эффекту BDNF (Gaydukov et al., 2018), сохранялось при отмывке в течение 1 часа. Для проверки возможной природы обнаруженного эффекта 2-АG использовали везамикол (1 мкМ) – ингибитор транспорта АХ в синаптические везикулы. Везамикол не оказывал влияния на амплитуду МПКП, но в его присутствии 2-АG оказался не способным вызывать прирост амплитуды МПКП. Оказалось, что АМ-251 (1 мкМ), обратный агонист CB1-рецепторов, предотвращал возрастание амплитуд МПКП под действием 2-АG. Полученные данные позволяют c уверенностью предполагать, что потенцирующий эффект 2-АG может быть результатом его активации пресинаптических СВ1-рецепторов с последующим запуском сигнального каскада, конечной мишенью которого является стимулирование накачки АХ в везикулы и повышение, тем самым, размера спонтанно секретируемых квантов АХ. Аналогичное, но еще более отставленное во времени действие агонистов СB1-рецепторов в моторных синапсах диафрагмы было недавно описано (Morsсh et al., 2018). Далее, при исследовании влияния 2-АG на вызванную секрецию АХ при коротких ритмических залпах ПКП (50 Гц, 1 с) было установлено, что 2-АG, помимо увеличения амплитуды МПКП, вызывает также возрастание на 35% амплитуды ПКП по ходу залпа, которое не сопровождалось статистически значимыми изменениями квантового состава ПКП. Таким образом, в отличие от АЕА, имел место единообразный стойкий прирост амплитуды ПКП, сохранявшийся на протяжении всего ритмического залпа ПКП. Такая картина объясняется, по-видимому, специфическим механизмом потенцирующего действия 2-АG, заключающемся в стойком увеличении размеров одиночных квантов АХ в моторных синапсах, которое сохраняется по ходу короткого залпа ПКП. Таким образом, суммируя обнаруженные эффекты эндоканнабиноидов в моторных синапсах, можно заключить, что и синтетический агонист СB-рецепторов WIN, и два естественных эндоканнабиноида, АЕА и 2-AG, оказались функционально активны и осуществляли облегчающее действие на спонтанную и вызванную секрецию АХ. При этом, несмотря на активацию одинаковых пресинаптических СВ1-рецепторов, облегчающее действие АЕА и 2-АG было направлено на разные процессы и показатели секреции АХ (частоту МПКП/квантовый состав ПКП, но не амплитуду МПКП при действии АЕА, и амплитуду МПКП и ПКП, но не квантовый состав ПКП - при действии 2-АG). Нами впервые установлено, что в реализации этих эффектов АЕА и 2-АG задействованы разные каскады (и их мишени) в моторных нервных терминалях диафрагмы мыши. На наш взгляд, обнаруженное несходство внутриклеточных мишеней и механизмов, запускаемых при облегчающем действии АЕА и 2-АG на квантовую секерцию АХ, несмотря на активацию одних и тех же пресинаптических СВ1-рецепторов, может быть следствием отмеченных в последние годы явлений смещенного агонизма при рецепторном действии каннабиноидов и возможной активацией ими разных сигнальных каскадов, ферментов и мишеней (Chevaliere et al., 2007; Delgado-Peraza et al., 2016; Walsh, Аndersen, 2020). Что касается обнаруженных нами неожиданных облегчающих влияний каннабиноидов на передачу в моторных сианпсах, то сейчас в литературе обсуждается способность СВ1-рецепторов под действием разных агонистов либо напрямую активировать Gs-белок [Glass et al 1997], либо снижать активность Gi-белка и, тем самым, усиливать тоническую активность Gs-белок-сцепленного каскада и РКА в нейронах [Eldeeb etal., 2016]. Наконец, недавно описана способность агонистов эндоканнабиноидных рецепторов активировать каскад с участием Gs-белка и РKА не напрямую, а посредством сцепки G-белков CB1-рецепторов с β-аррестинами, что обеспечивает реализацию самостоятельных внутриклеточных влияний [Delgado-Peraza et al., 2016; Thomsen et al., 2016]. Следует отметить, что на сегодня примеры облегчающих влияний эндоканнабиноидов на секрецию медиаторов, хотя и отмечены в литературе, но считаются неканоническими и остаются немногочисленными (Gonzalez-Islas et al., 2012; Chevaleyre et al., 2017; Piette et al., 2020). Не исключено, однако, что такое действие каннабиноидов может быть характерно (или более выражено) именно в периферической нервной системе, и, безусловно, нуждается в дальнейшей детализации. Наконец, в последней, пилотной серии, посвященной анализу активности эндоканнабиноидной системы в моторных синапсах, были исследованы возможные эффекты в отношении спонтанной секреции АХ JZL184 (1 мкМ) - ингибитора моноацилглицерол-липазы (MAGL), фермента, инактивирующего эндогенный 2-AG. Мы установили, что на фоне 2х-часовой аппликации JZL184 на нервно-мышечный препарат параметры МПКП статистически не изменяются по отношению к контролю. Очевидно, что в отсутствии вызванной секреции АХ в покоящихся синапсах не происходит значительной продукции эндогенного 2-АG, существование и ретроградное действие которого (приводящее к увеличению амплитуды постсинаптических потенциалов за счет пресинаптического механизма) можно было бы усилить за счет ингибирования MAGL. Возможные условия продукции эндоканнабиноидов (АЕА и 2-AG) при активности моторных синапсов будут подробно исследованы на финальном году выполнения проекта.
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Роль миогенных ретроградных сигнализаторов (BDNF и эндоканнабиноидов) в регуляции квантовой секреции ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах мыши
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".