Пресинаптическая регуляция размера кванта ацетилхолина в моторных синапсахНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Пресинаптическая регуляция размера кванта ацетилхолина в моторных синапсах
Результаты этапа: Исследованы причины прироста на 20-30% амплитуды миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) под действием гиперосмотического наружного раствора сахарозы (200мM). Впервые показано, что прирост амплитуды МПКП отражает повышение размера кванта АХ, вследствие возрастания его поступления в везикулы, т.к. эффект предотвращается везамиколом (1мкМ) – блокатором накачки АХ в везикулы. Исследованы причины повышения амплитуды МПКП в1,5-2 раза под действием рианодина (0,5мМ) и кофеина (1мМ) – стимуляторов выброса депонированного кальция в терминалях, способствующего экзоцитозу эндогенного КГРП из «dence core» везикул терминалей в синаптическую щель. Для подтверждения гипотезы о возможном участии КГРП в обнаруженных потенцирующих эффектах рианодина и кофеина проведен анализ дозо-зависимого действия двух изоформ КГРП (крысы и человека) в диапазоне 1нМ - 1мкМ на параметры МПКП. Установлено, что оба пептида вызывают увеличение средней амплитуды МПКП в 1,1-1,8 раза. Впервые показано, что эффект предотвращается везамиколом, блокатором протеинкиназы А (Н89) – а также блокатором рецепторов КГРП – пептидным фрагментом КГРП 8-37. Параллельно впервые исследовано острое действие экзогенного КГРП крысы (1мкМ) на формирующиеся, новообразуемые моторные синапсы в ходе реиннервации скелетной мышцы мыши. Впервые установлен достоверный прирост средней амплитуды МПКП на 18%, предотвращаемый как везамиколом, так и блокатором рецепторов КГРП – пептидным фрагментом КГРП 8-37. Наряду с МПКП, под действием экзогенного КГРП возрастает амплитуда (но не квантовый состав) ПКП, что приводит к стойкому облегчению передачи в условиях одиночных и ритмической работы интактных и новообразованных синапсов. Впервые установлено, что в зрелых моторных синапсах диафрагмы мыши аппликация пептида-агониста рецепторов тромбина (PAR1-типа) TRAP6 (1мкМ) вызывает прирост амплитуды МПКП на 39%, сохраняющийся и при отмывке мышцы от TRAP6 в течение 40 и более минут. Непептидный антагонист PAR1-типа рецепторов – FR171113 (1мкМ), а также ингибитор везикулярной Н-АТФазы – бафиломицин А полностью предотвращали потенцирующее действие агониста PAR1 на амплитуду МПКП.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Пресинаптическая регуляция размера кванта ацетилхолина в моторных синапсах
Результаты этапа: Выявлен режим ритмической активности моторных синапсов мыши (30 Гц 2 минуты), при котором в нервно-мышечных синапсах происходит высвобождение и накопление эндогенного пептида - КГРП - и его аутокринное пресинаптическое действие на синапсы,направленное на повышение размера кванта АХ. Впервые установлено, что у незрелых моторных синапсов, находящихся на стадии регенерации контактов в составе мышечных волокон, можно вызвать высвобождение эндогенного пептида - КГРП - в ответ на продолжительную ритмическую стимуляцию нерва(30 Гц 2 минуы). При этом высвобождающийся эндогенный КГРП оказывает аутокринное облегчающее действие на передачу, путем активации своих пресинаптичеиикх рецепторов и увеличения размеров квантов АХ. Впервые проведен анализ эффектов активации тромбиновых рецепторов в моторных синапсах мыши с помощью аппликации на синапсы TRAP6 - пептида-агониста тромбиновых рецепторов PAR1-типа. Впервые показана способность TRAP6, действуя на постсинаптическом уровне, вызвать высвобождение из мышцы нейротрофина - BDNF,оказывающего облегчающее пресианптическое действие на передачу путем увеличения размеров квантов АХ и амплитуды постсинаптических потенциалов. Впервые проведено сравнение эффектов пептида членистоногих - аллатостатина - на нервно-мышечную передачу у зрелых и регенерирующих нервно-мышечных контактов.Выявлена способность аллатостатина в низких, наномолярных концентрациях стойко увеличивать амплитуду миниатюрных потенциалов концевой пластинки, действуя на пресинаптическом уровне и стимулируя накачку АХ в синаптические везикулы нервных терминалей.
3 1 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. Пресинаптическая регуляция размера кванта ацетилхолина в моторных синапсах
Результаты этапа: Раскрыты причины повышения на 30% амплитуды МПКП в ответ на выброс депонированного кальция через рианодиновые рецепторы (РиР). Показано, что под действием рианодина (0.1 мкМ) как стимулятора выброса депонированного кальция через РиР в моторных терминалях прирост амплитуды МПКП обусловлен усилением процесса накачки АХ в везикулы, поскольку предотвращался везамиколом (1 мкМ) - блокатором везикулярного АХ-транспортера, либо бафиломицином А1 (1 мкМ) - блокатором V-АТФазы и везикулярного транспорта протонов. Получены подтверждения выдвинутой гипотезы, согласно которой возрастание размера кванта АХ при выбросе депонированного кальция есть следствие кальций-зависимого экзоцитоза крупных везикул с электронно-плотной сердцевиной (LDCVs), содержащих комедиатор АХ кальцитонин ген-родственный пептид (КГРП) и дальнейшего аутокринного рецепторного действия этого нейропептида на терминали. Впервые установлено, что активация пресинаптических КГРП-рецепторов вызывает в терминалях каскад реакций, приводящих к усилению накачки АХ в везикулы и повышению размера квантов АХ. Проведено подробное сопоставление механизмов возрастания амплитуды МПКП в синапсах мыши в ответ на дозозависимое действие экзогенного КГРП (1 нМ – 1 мкМ) с механизмами, вызывающими прирост амплитуды МПКП под действием стимулирующего РиР рианодина. Впервые показано, что в обоих случаях прирост амплитуды МПКП предотвращается не только за счет прямого или непрямого ингибирования накачки АХ в везикулы (везамиколом или бафиломицином А1, соответственно), но и при блокаде КГРП-рецепторов усеченным пептидом КГРП8-37, а также – под действием H-89 (1 мкМ) - ингибитора протеинкиназы А (PKA). Вместе с тем, только индуцированный рианодином прирост амплитуды МПКП и кванта АХ зависел от активации пресинаптической кальций/кальмодулин-зависимой киназы II типа (СаМKII) и предотвращался блокаторами СаМKII (3 мкМ) – KN-62 или KN-93 (но не его неактивным аналогом KN-92, использованным в качестве негативного контроля), тогда как эффекты экзогенного КГРП в отношении потенцирования амплитуды МПКП не были чувствительны к действию блокаторов СаМKII. Удалось найти протокол продолжительной ритмической стимуляции синапсов – 30 Гц в течение 2 минут, при котором, в сочетании с сохраненной сократительной и электрической активностью мышцы, в пост-активационный период имели место статистически значимые изменения амплитудно-временных параметров МПКП. Если в первые несколько минут после такого длительного тетанического залпа ПКП средняя частота, а также амплитудно-временные параметры МПКП не отличались от контрольных значений, то к 10-й минуте после залпа наблюдалось увеличение амплитуды МПКП в среднем на 10% (p<0.05), которое к 15-20 минутам после залпа достигало наибольшей выраженности - до 130% от контроля, параллельно с незначительным замедлением временного хода МПКП на 10-15%. К 40-й минуте после залповой активности синапсов и далее значения амплитудно-временных характеристик МПКП снижались до контрольного уровня. Далее было установлено, что ингибирование активности везикулярного транспорта АХ везамиколом полностью предотвращает посттетанический прирост амплитуд МПКП, что свидетельствует о пресинаптической природе такого прироста, обусловленного усиленной работой везикулярного транспортера АХ и загрузки АХ в везикулы. Впервые показано, что блокада РиР рианодином, а также ингибирование СаМKII, PKC или PKA (c помощью KN-62, GF109203X или H-89, соответственно) также полностью предотвращали посттетаническое увеличение размера кванта АХ. Наконец, прирост размера кванта АХ полностью предотвращался блокированием КГРП-рецепторов с помощью КГРП8-37. Совокупность полученных данных позволила придти к заключению, что кратковременное, но значительное посттетаническое возрастание размера кванта АХ, по-видимому, обусловлено зависимым от ритмической синаптической активности и депонированного кальция действием эндогенного КГРП, высвобождаемого в ходе синаптической активности из пресинаптических LDCVs. Последующее пресинаптическое рецепторное действие нейропептида приводит к дополнительной накачке АХ в везикулы и приросту размера кванта АХ. Наконец, в ходе анализа посттетанической спонтанной активности моторных синапсов в «рассеченных» нервно-мышечных препаратах, у которых сохранена полноценная синаптическая передача, но исключено развитие сокращения мышечных волокон, не удалось выявить посттетанический прирост амплитуды МПКП. Таким образом, феномен посттетанической потенциации синаптической передачи за счет временного прироста требует сочетанной активности как моторных синапсов, так и самих мышечных волокон. Впервые установлено, что в новообразованных моторных синапсах имеет место аналогичная динамика изменений амплитуды МПКП после тетанической активности нервно-мышечного препарата (30 Гц в течение 2 минут). Был зарегистрирован кратковременный (в интервале 10-30 минут после стимуляции) достоверный посттетанический прирост амплитуд одноквантовых МПКП, в среднем на 37%, с незначительным пролонгированием временного хода МПКП (в среднем, на 10-15%). Необходимо отметить, что степень прироста амплитуд МПКП, судя по средним значениям и наклону кумулятивных кривых вероятности распределения амплитуд МПКП, оказалась более выраженной в новообразованных синапсах, чем в зрелых, хотя качественно картина повторялась. Так же, как и в зрелых синапсах, сдвиг кумулятивных кривых вправо - в сторону высокоамплитудных значений - был кратковременным, и исчезал к 40-60 минутам после стимуляции нерва и тетанической синаптической и сократительной активности нервно-мышечного препарата (в этот период кумулятивные кривые амплитудного распределения и средние значения амплитуд МПКП уже не отличались от контроля). Посттетанический прирост амплитуд МПКП предотвращался при аппликации везамикола сразу после тетанической стимуляции, а также на фоне действием КГРП8-37 или в условиях блокирования CaMKII, PKC или PKA. Таким образом, проведенные исcледования показали, что, как в зрелых, так и в новообразованных, функционально незрелых моторных синапсах, посттетаническая потенциация синаптической передачи за счет кратковременного, но значительного возрастания размера кванта АХ, по всей видимости, обусловлена высвобождением эндогенного КГРП из нервных и/или мышечных структур и действием нейропептида на свои рецепторы в синапсах, что запускает сигнальный каскад, приводящий к интенсификации накачки АХ в синаптические везикулы. В рамках одного из направлений исследований мы установили, что в новообразованных синапсах m.EDL аппликация аллатостатина (1 нМ – 1 мкМ) не приводит к достоверным изменениям частоты МПКП, а также амплитудно-временных характеристик МПКП. Так, в контроле амплитуда МПКП составляла 0.53±0.03 мВ, а на фоне аппликации аллатостатина (1 мкМ) в течение 60 минут – 0.51±0.03 мВ (р>0.05). Вместе с тем, мы подтвердили ранее описанный нами (Gaydukov, Balezina, 2006) феномен - способность аллатостатина в зрелых диафрагмальных синапсах мыши значительно увеличивать амплитуду МПКП и размер кванта АХ на пресинаптическом уровне. Мы впервые показали, что, действуя cкорее всего через неизвестные пока пресинаптические рецепторы, аллатостатин способен запускать каскад реакций с участием PKA, приводящий к усилению накачки АХ в везикулы и увеличению размеров кванта АХ. Не исключена была возможность активации аллатостатином «чужих» рецепторов для имеющих определенное структурное сходство нейропептидов, к числу которых относятся, в частности, галаниновые G-белок-связанные рецепторы. Мы провели тестирование эффектов галанина в моторных синапсах диафрагмы мыши. Аппликация галанина на нервно-мышечный препарат (10 нМ - 1 мкМ) показала, что в течение 30 минут этот нейропептид, не оказывая влияния на частоту и временной ход МПКП, вызывает достоверный прирост амплитуд МПКП на 35-40% (p<0.05), что сопоставимо с эффектами аллатостатина в том же диапазоне концентраций. Неожиданным оказалось то, что в отличие от эффекта аллатостатина, блокирование везикулярного АХ-транспортера везамиколом не приводило к предотвращению потенцирующего эффекта галанина на амплитуду МПКП. Таким образом, мы впервые установили, что галанин способен потенцировать передачу в моторных синапсах за счет увеличения амплитуд одноквантовых МПКП, но такое действие галанина реализуется не за счет возрастания размера кванта АХ, то есть имеет другую природу, отличную от механизма действия аллатостатина в моторных синапсах мыши. Полученные данные позволяют сделать предположение, что галаниновые рецепторы, несмотря на эволюционное сродство с аллатостатиновыми не являются точкой приложения пептида членистоногих аллатостатина в синапсах диафрагмы мыши, Аллатостатин, по-видимому, действует на пока не идентифицированные орфанные рецепторы. Механизм, обеспечивающий впервые описанное возрастание амплитуд МПКП под действием галанина, не чувствительное к везамиколу, и имеющее, на наш взгляд, скорее постсинаптическую природу, очевидно, еще нуждается в дальнейшем анализе. В рамках этого проекта мы впервые показали, что активация не имеющих пресинаптической локализации PAR1 их пептидом-агонистом TRAP6 (1 мкМ), а также тромбином в низкой (1 нМ), но не более высокой (10 нМ-1 мкМ) концентрациях, вызывает устойчивый (не отмывающийся в течение как минимум 1 часа) прирост амплитуд МПКП на 25-35%. Возрастание амплитуд МПКП, индуцированное стимуляцией мышечных PAR1, предотвращалось блокадой PAR1, а также бафиломицином А1 и везамиколом, что свидетельствует о пресинаптической природе возрастания амплитуд МПКП, связанной с увеличением закачки АХ в везикулу. Исследование вызванной активности синапсов в условиях активации PAR1 TRAP6 или тромбином выявило возрастание амплитуд многоквантовых ПКП, которое не сопровождалось увеличением их квантового состава (значение квантового состава ПКП оставалось на контрольном уровне). Ввиду того, что тромбиновые рецепторы не были найдены на пресинаптической мембране (Lanuza et al., 2007), оставалось предположить, что активация мышечных PAR1 запускает сигнальный каскад в мышечных волокнах, приводящий к секреции молекулы, действующей ретроградно на нервную терминаль и приводящей к увеличению размера кванта АХ. Дальнейший анализ этой гипотезы, включавший исследование эффектов активации PAR1 на фоне ингибитора фосфолипазы C (PLC) U73122 (5 мкМ) и его неактивного аналога U73343, а также блокаторов PKC и блокирования РиР-зависимого выброса депонированного кальция показал, что активация мышечных PAR1 действительно запускает в мышечных волокнах PLC-опосредованный внутриклеточный каскад, в котором не участвует PKC, но играет определенную (пролонгирующую эффект) роль выброс депонированного кальция, что в совокупности обеспечивает возрастание амплитуд МПКП и размера квантов АХ. Известно, что мышца способна высвобождать нейротрофин мозга BDNF, для которого показана как экспрессия в скелетных мышечных волокнах, так и возможность регулируемого высвобождения (Hurtado et al., 2017; Simo et al., 2018) с последующим воздействием на пресинаптические рецепторы TrkB (Garcia et al., 2010; Santafe et al., 2014). Действительно, нами впервые было установлено, что в присутствии блокатора TrkB-рецепторов - ANA12 (10 мкМ) - полностью предотвращается потенцирующее влияние активации тромбиновых рецепторов на амплитуду МПКП в синапсах диафрагмы. Для дальнейшего подтверждения возможного участия BDNF в качестве ретроградного сигнала в запускаемой активацией PAR1 цепи реакций, приводящей к росту амплитуды МПКП, был проведен подробный сравнительный анализ спектра действия экзогенного BDNF (1 нМ) на параметры спонтанной активности синапсов. Было выявлено, что при аппликации экзогенного BDNF происходит быстрый прирост амплитуды МПКП на 30-35%, аналогичный наблюдаемому при активации постсинаптических PAR1 и реализуемого, как мы предполагаем, за счет эндогенного (мышечного) BDNF. При этом эффект – стойкий и стабильно сохраняется после отмывки от BDNF на протяжении не менее 60 минут. Блокирование везикулярного АХ-транспортера везамиколом полностью предотвращало потенцирующее действие экзогенного BDNF в отношении амплитуд МПКП. Мы установили, что обнаруженный нами прирост амплитуды МПКП под действием BDNF не связан с TrkB-опосредованной активацией PLC в нервных терминалях, поскольку блокатор PLC U73122 оказался неспособен предотвратить увеличение амплитуд МПКП под действием экзогенного BDNF. Исследование других TrkB-опосредованных сигнальных путей, обеспечивающих прирост размера квантов АХ, выявило, что экзогенный BDNF терял способность увеличивать амплитуду МПКП как при ингибировании PKA с помощью H-89 (1 мкМ), так и при блокировании MEK1/2-Erk сигнального пути с помощью U0126 (20 мкМ). Неактивный аналог U0126 – U0124 (20 мкМ) оказался неспособен предотвратить потенцирующее действие BDNF на амплитуду МПКП. Продолжительная (в течение 90 минут) стимуляция пресинаптических, сопряженных с Gs-белком, А2А-рецепторов аденозина их селективным агонистом CGS21680 (100 нМ) сама по себе приводила к небольшому (на 15%), но статистически значимому увеличению амплитуд МПКП. Аппликация 1 нМ экзогенного BDNF на фоне CGS21680 приводила к дополнительному приросту амплитуды МПКП еще на 10% (то есть суммарный прирост амплитуд МПКП составил 25%). Таким образом, в условиях дополнительной активации A2A-рецепторов наблюдается определенная окклюзия эффекта BDNF в отношении амплитуды МПКП, что может свидетельствовать о сопряженности сигнальных путей - PKA-опосредуемого (запускаемого при активации А2А-рецепторов), и MEK1/2-опосредуемого, запускаемого при активации TrkB экзогенным BDNF, и обеспечивающих, в конечном итоге прирост размера кванта АХ. Антагонист A2A-рецепторов ZM241385 (10 нМ) сам по себе не оказывал воздействия на амплитуду МПКП, однако в его присутствии BDNF в значительной степени терял способность увеличивать амплитуду МПКП – значение этого параметра составило 1.39±0.08 мВ в контроле и 1.60±0.14 мВ (p>0.05). Таким образом, мы впервые показали, что в моторных синапсах для проявления BDNF-индуцированного возрастания размера квантов (с участием MEK1/2) необходима тоническая (имеющаяся в покое, при отсутствии вызванной секреции АХ) активность аденозиновых A2A-рецепторов, по-видимому, стимулирующих PKA. Совокупность полученных данных свидетельствует, что экзогенный BDNF в наномолярной концентрации действительно способен эффективно и быстро повышать размер кванта АХ на пресинаптическом уровне, действуя через свои рецепторы, с последующей активацией митоген-активируемой протеинкиназы, но не PLC, и что необходимым условием для проявления эффекта BDNF является активность пресинаптической PKA. Наряду с анализом зрелых моторных синапсов, было исследовано действие как TRAP6, так и тромбина на параметры МПКП в функционально незрелых, регенерирующих после передавливания нерва, моторных синапсах m.EDL. При аппликации TRAP6 (1-10 мкМ) или тромбина (1 нМ) на новообразуемые синапсы результат был аналогичным действию пептида-агониста или самого тромбина в зрелых диафрагмальных синапсах мыши: обнаружилось увеличение амплитуды МПКП на 20-35 % по сравнению с контролем. Как и в зрелых синапсах диафрагмы, отмывка от TRAP6 или тромбина в течение часа в новообразованных синапсах не приводила к снижению амплитуды МПКП до контрольного уровня. Впервые обнаруженное нами качественное и количественное сходство эффектов активации PAR1 на амплитуду МПКП в зрелых и в регенерирующих (незрелых) моторных синапсах позволяет предполагать, что, несмотря на разный функциональный статус моторных синапсов, существует общий сигнальный механизм, запускаемый тромбином на постсинаптическом уровне. Он предназначен для острой регуляции размера квантов АХ и поддержания передачи путем активации PAR1 на всех этапах онтогенеза у мыши. Таким образом, в рамках выполнения данного проекта нами впервые описан не только новый феномен сочетанной регуляции тромбином размера кванта АХ с участием пост- и пресинаптических структур моторных синапсов, но и отдельные компоненты сигнальных каскадов, участвующие в реализации феномена на пре- и постсинаптическом уровне. Получены доказательства в пользу возможности тромбин-опосредованного выброса миогенного BDNF и его ретроградного действия на терминали, которое приводит к увеличению размера кванта АХ. Этот впервые описанный нами феномен нуждается в уточнениях того, при каких условиях и с помощью каких механизмов он запускается и каков вклад, соответственно, эндогенного зрелого BDNF или его секретируемой незрелой формы (проBDNF) в регуляцию параметров передачи при их ретроградном действии в синапсах. Эти фундаментальные, но пока не решенные вопросы запланированы для исследования в следующем поданном нами на рассмотрение в РФФИ проекте, посвященном механизмам ретроградной сигнализации в моторных синапсах мыши с участием миогенных сигнализаторов, включая BDNF.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".