ИСТИНА

Эндоцитоз относится к одному из древних биологических механизмов, который наряду с экзоцитозом участвует в процессах роста, морфогенеза, питания и взаимодействия клеток с окружающей средой. В настоящем Проекте мы провели разноплановое исследование эндоцитоза у не изученной в данной области группы базидиальных мицелиальных грибов, с привлечением методов флуоресцентной (в т.ч. иммуноцитохимической) микроскопии вкупе с ингибиторным анализом. Цель - выявление общих особенностей эндоцитоза у разных эколого-трофических групп грибов, установление сходств и различий между эндоцитозом у животных и у грибов, роли эндоцитоза в адаптациях грибов. Анализ динамики эндоцитоза (по поглощению маркера АМ4-64) у видов из разных эколого-трофических групп базидиомицетов в разных условиях показал, что у каждой группы свой тип эндоцитоза, связанный с особенностями питания и взаимодействия с окружающей средой, характерными для эколого-трофической группы. В результате изучения воздействия на мицелий различных ингибиторов эндоцитоза клеток животных и ингибиторов сборки цитоскелета установлено, что в целом грибной эндоцитоз имеет как общие с животными консервативные механизмы, так и характерные лишь для мицелиальных грибов. Неспецифическое подавление ранних стадий грибного эндоцитоза некоторыми ингибиторами навело на идею о том, что грибы могут регулировать скорость эндоцитоза для первичной (пока не выработана эффективная устойчивость, еще не выработаны адаптивные реакции) защиты от токсинов, фитоалексинов и фунгицидов. Экспериментальная проверка гипотезы показала, что подобный механизм первичной устойчивости у грибов возможен. Проект обладает разносторонней новизной: использованы объекты, не изученные в ракурсе темы Проекта; разработан свой метод количественного анализа динамики эндоцитоза со статистической обработкой; использованы ингибиторы эндоцитоза, ранее не применяемые к грибам; предложены новые гипотезы. Результаты работы могут быть использованы в дальнейшем в прикладных областях, например, в фитопатологии, в разработке новых средств защиты сельскохозяйственных культур от грибов.

Endocytosis belongs to one of the ancient biological mechanisms, which along with exocytosis participates in the processes of growth, morphogenesis, nutrition and interaction of cells with the environment. In this Project, we conducted a multidisciplinary study of endocytosis in a group of basidial mycelial fungi not studied in this field, using methods of fluorescent (including immunocytochemical) microscopy, together with inhibitory analysis. The goal is to identify common features of endocytosis in different ecology-trophic groups of fungi, establish similarities and differences between endocytosis in animals and in fungi, the role of endocytosis in fungal adaptations. The analysis of the dynamics of endocytosis (according to the absorption of the marker AM4-64) in species from different ecology-trophic groups of basidiomycetes under different conditions has shown that each group has its own type of endocytosis, associated with the peculiarities of nutrition and interaction with the environment, characteristic of the ecological-trophic group. As a result of the study of the effect on the mycelium of various endocytosis inhibitors of animal cells and inhibitors of the cytoskeleton assembly, it was established that, in general, the fungal endocytosis has both conservative mechanisms common to animals, and characteristic only for mycelial fungi. Nonspecific suppression of early stages of fungal endocytosis by some inhibitors led to the idea that fungi can regulate the rate of endocytosis for the primary (until effective resistance is developed, adaptive responses have not yet been developed) to protect against toxins, phytoalexins and fungicides. Experimental testing of the hypothesis has shown that a similar mechanism of primary stability in fungi is possible. The project has versatile novelty: objects that have not been studied in terms of the Project topic are used; developed its own method of quantitative analysis of the dynamics of endocytosis with statistical treatment; endocytosis inhibitors not previously applied to fungi have been used; new hypotheses are proposed. The results of the work can be used in the future in applied fields, for example, in phytopathology, in the development of new means of protecting crops from fungi.

Форма 503 с иллюстрациями и таблицами - приложение к итоговому отчету по Проекту 16-04-00814 А «Эндоцитоз у мицелиальных грибов: роль в морфогенезе и адаптациях» 3.5. Важнейшие результаты, полученные в ходе реализации Проекта Для прозрачности логики нашего исследования и связей между отдельными результатами ниже приведены сначала краткие описания основных результатов с логическими переходами между ними, затем более развернутое изложение материала. Эндоцитоз выполняет у мицелиальных грибов множество функций: участвует в росте гифы (вкупе с экзоцитозом обеспечивает синтез плазмалеммы и клеточной стенки), отвечает за питание клеток, за обновление молекул цитоплазматической мембраны и рецепцию сигнальных молекул, многогранно принимает участие во взаимодействии паразит/хозяин и т.д. (Fuchs, Steinberg, 2005; Toshima et al., 2006). У мицелиальных грибов, относимых к разным эколого-трофическим группам, эндоцитоз, вероятно, может быть проявлен не одинаково. Данный вопрос не освещен в научной литературе и наш результат №1 - это подбор 13 различных видов базидиомицетов и проверка их с помощью эндоцитозной флуоресцентной метки АМ4-64. В результате мы отобрали пять видов грибов из разных эколого-трофических групп для дальнейшей работы. Результат №2 - методический и очень важный для реализации всего Проекта - мы, на основании анализа поглощения грибными клетками маркера АМ4-64, установили и описали четыре последовательные стадии включения маркера, соответствующие разным стадиям эндоцитоза. Именно возможность оценивать динамику эндоцитоза по условно-дискретным стадиям позволила нам количественно и статистически обрабатывать результаты. Результат №3 - с помощью разработанного нами метода количественной оценки динамики эндоцитоза мы выявили, что пять изучаемых видов грибов распределены по трем группам с разными особенностями эндоцитоза. Каждая из трех групп имеет свою зависимость между температурой культивирования и скоростью эндоцитоза, что, безусловно, связано с физиологическими особенностями эколого-трофических групп, к которым относятся изучаемые грибы. Далее мы сконцентрировали внимание на одном из пяти грибов - на гетеробазидиальном фитопатогене Rhizoctonia solani. Данный вид был выбран, потому что он представляет одну из эндоцитарных групп в результате №3, может быть использован как модель для изучения эндоцитоза у фитопатогенов, что, соответственно, имеет большое практическое значение. Кроме того, данный гриб является удобным цитологическим объектом - имеет крупные клетки и быстрый рост. Механизмы эндоцитоза изучены у мицелиальных грибов слабо, поэтому, чтобы разобраться в первом приближении в эндоцитарных путях, работающих в клетках R. solani, мы использовали ингибиторный анализ. Мы использовали шесть ингибиторов, подавляющих различные типы эндоцитоза у животных, либо действующие на цитоскелет. Результат №4 заключается в том, что мы разделили все 6 ингибиторов по типу действия на эндоцитоз R. solani на 4 группы. Общей чертой изучаемых эндоцитарных ингибиторов оказалось вероятное неспецифическое влияние на грибной эндоцитоз. Одна из гипотез, объясняющая результат №4, такова - гриб произвольно регулирует скорость своего эндоцитоза в ответ на определенные физиологически активные вещества в окружающей среде. Такая регуляция является защитным механизмом против, например, фитоалексинов хозяина, а значит, может лежать и в основе устойчивости фитопатогенов к фунгицидам. Проверка изложенной гипотезы дала направление замыкающим исследованиям данного Проекта. Результат №5 связан с проверкой действия двух фунгицидов на эндоцитоз R. solani у устойчивых к этим фунгицидам штаммов. Результаты №№1-3 получены нами в 2016 году, результат №4 «перешел» из прошлого года в 2017, результат №5 получен в 2017. Результаты №№2 и 4 подробно освещены в опубликованной нами в 2017 году статье (Kamzolkina et al., 2017). Еще одним результатом, полученным в 2017 году можно считать написание обзорной статьи про грибной эндоцитоз (в печать еще не передана, идет доработка текста, планируем опубликовать в Fungal Biology). Развернутое изложение результатов: Результат №1: характеристики 13 первичных штаммов грибов, использованных в работе, можно посмотреть в отчете за 2016 год. Ниже в таблице 1 приведены 5 отобранных видов базидиальных грибов с указанием принадлежности к эколого-трофической группе, у которых подробно анализировали динамику эндоцитоза с помощью флуорофорного маркера АМ4-64. Таблица 1. Список отобранных видов грибов для изучения динамики эндоцитоза в Проекте Таксон Эколого-трофическая группа Armillaria sp. ксилотроф-паразит Coprinopsis cinerea гумусовый сапротроф Fomitopsis pinicola ксилотроф-сапротроф Pleurotus ostreatus ксилотроф-сапротроф Rhizoctonia solani паразит/симбиотроф Несмотря на то, что F. pinicola и P. ostreatus согласно таблице относятся к одной эколого-трофической группе, в действительности, они сильно отличаются по своим характеристикам как ксилотрофы. F. pinicola - ближе к классическому типу ксилотрофного базидиомицета, вызывающего бурую гниль древесины (Eastwood et al. 2011). P. ostreatus - «слабый» ксилотроф, хищный гриб (поедает нематод, бактерий и других грибов) (Tsuneda & Thorn 1995, Plotnikova et al, 2014). Результат №2: Рис. 1. Фотографии (слева) и схемы (справа) стадий эндоцитоза у R. solani: 0 стадия – окрашена цитоплазматическая мембрана;1 стадия – окрашивание мелких везикул; 2 стадия - окрашивание более крупных везикул-эндосом, цитоплазматическая мембрана флуоресцирует значительно слабее; 3 стадия – окрашивание вакуолей, цитоплазматическая мембрана практически не флуоресцирует. На рис. 1 приведена типичная морфология установленных нами четырех стадий эндоцитоза у базидиальных грибов. Присвоив каждой дискретной стадии (стадии, конечно, не дискретные, но методически их можно дифференцировать) номер от 0 до 3, у нас появилась возможность для количественной оценки скорости и других параметров эндоцитоза у изучаемых грибов. Мы установили оптимальный временной диапазон для анализа динамики эндоцитоза от 0 до 40 мин, и оптимальную универсальную питательную среду - среда Чапека. В описании к рисунку мы поясняем, какому именно этапу эндоцитоза соответствует каждая из стадий, начиная от отшнуровки первичных везикул, через эндосомы и заканчивая вакуолями. Однако мы, в конечном итоге, пришли к выводу, что метод с использованием АМ4-64 не дифференцирует между собой два крупных типа эндоцитоза - макро- и микропиноцитоз. Так, первичные везикулы микропиноцитоза могут быть практически не видны на стадиях 0 и 1, а пристеночные везикулы на стадии 1 и 2 могут быть как эндосомами, так и макропиносомами. Мембрана вакуолей на стадии 3 может флуоресцировать, как получив метку через микропиноцитозный путь, так и сами вакуоли могут получиться слиянием макропиносом. На нашем уровне исследования такая слабая дифференцирующая способность метода не критична, но в дальнейших исследованиях вопрос требует детализации. Результат №3: Рис. 2. Динамика эндоцитоза в зависимости от температуры у пяти изучаемых видов грибов Из рис. 2 видно, что пять изучаемых видов базидиомицетов можно разделить по типу эндоцитоза (динамика в зависимости от температуры) на три группы (таблица 2). Таблица 2. Типы эндоцитоза, определяемые зависимостью между скоростью эндоцитоза и температурой Тип эндоцитоза У каких видов отмечен Характеристики Интерпретация Тип I R. solani Эндоцитоз при 0° С супрессирован, при 8° С эндоцитоз протекает с низкой скоростью. Повышение температуры (15, 22 и 28° С) повышает скорость эндоцитоза Видимо, гриб подстраивается под растение-хозяина: при низких температурах гриб прекращает активное питание / взаимодействие с хозяином из-за низкой метаболической активности хозяина Тип II C. cinerea Эндоцитоз протекает достаточно быстро в диапазоне температур от 0 до 22° С. При 28° С скорость эндоцитоза значительно снижается Возможно, высокие температуры в почве /подстилке тесно связаны с недостатком влаги - гриб прекращает активное питание и т.д. Тип III Armillaria sp. F. pinicola P. ostreatus Эндоцитоз быстрый в широком диапазоне температур от 0 до 28° С Ксилотрофы живут в условиях дефицита азота - необходимо постоянное питание / концентрация азота Из таблицы 2 видно, что у каждой эколого-трофической группы грибов свой общий тип эндоцитоза. Данный факт и наши интерпретации-предположения, приведенные в таблице 2, свидетельствуют в пользу того, что эндоцитоз, участвующий в питании и взаимодействии с внешней средой гриба, является важным механизмом адаптации в рамках своей эколого-трофической группы. Результат №4: Мы уже предположили, что с помощью флуоресцентно-микроскопического метода наблюдаем макро- и микропиноцитоз у исследуемых грибов, не дифференцируя их друг от друга. У животных известно до 10 разных типов только микропиноцитоза (если классифицировать по начальным стадиям) (Doherty, McMahon, 2009). Некоторые типы микропиноцитоза показаны у грибов. Дабы выяснить, какие именно пути эндоцитоза доминируют у мицелиальных базидиомицетов и насколько они схожи с эндоцитозом у животных, мы совместили ингибиторный анализ с флуоресцентно-микроскопическим мечением эндоцитоза. В таблице 3 приведены ингибиторы, специфичные к мишеням, отвечающим за различные пути эндоцитоза у животных, и ингибиторы сборки цитоскелета, использованные в Проекте (с указанием их мишеней и побочных эффектов). Таблица 3. Краткая характеристика используемых в работе ингибиторов Ингибитор Используемая в Проекте концентрация Основная мишень / тип подавляемого эндоцитоза у животных Побочные эффекты, неспецифическое действие Натамицин 80 мкМ Эргостерол (у грибов) / кавеолин/липидно-доменный эндоцитоз Пермеабилизация мембран (поэтому как ингибитор используют в низких концентрациях), действие на связь между актином и плазмалеммой (Ivanov, 2008; Dutta, Donaldson, 2012) Диназор 100 мкМ Динамин / многие типы динаминзависимого эндоцитоза Действие на актин (Ivanov, 2008; Dutta, Donaldson, 2012) Питстоп 2 7,5 мкМ Клатрин (блокирует прикрепление клатрина к адапторным белкам) / клатринзависимый эндоцитоз Множество побочных эффектов, особенно, при превышении допустимой концентрации (Kleist et al., 2011) Нокодазол 10 мкг/мл Тубулин (деполимеризатор микротрубочек) / влияет на поздние стадии различных типов эндоцитоза - Монодансилкадаверин 300 мкМ Ингибитор клатрин-зависимого эндоцитоза Действие на макропиноцитоз, фагоцитоз и актин (Ivanov, 2008; Dutta, Donaldson, 2012) Латрункулин А 0,6 и 2 мкМ Актин (ингибитор сборки филаментов) / различные типы эндоцитоза - Результаты флуоресцентно-микроскопического отслеживания маркера АМ4-64 после обработки мицелия R. solani каждым из шести ингибиторов представлены на рис. 3. Рис.3. Диаграммы, отражающие воздействие каждого из шести ингибиторов на динамику эндоцитоза у R. solani. По оси ординат отложена частота встречаемости той или иной из четырех стадий эндоцитоза в двух временных промежутках (0 - 15 мин и 15 - 30 мин). Темные столбики - опыт (обработка ингибитором), светлые - контроль (без обработки). Из рис. 3 следует, что по своему действию все шесть ингибиторов можно разделить на четыре группы. Описание групп ингибиторов дано в таблице 4. Таблица 4. Распределение ингибиторов, используемых в Проекте, по четырем группам с разным воздействием на эндоцитоз R. solani Группа Входящие в группу ингибиторы Воздействие группы ингибиторов на динамику эндоцитоза R. solani Интерпретация Группа I Натамицин, диназор, питстоп 2 Сильное ингибирование эндоцитоза АМ4-64. Эндоцитоз метки замедляется после стадий 0 и 1 - блокируют отшнуровку первичных везикул и транспорт их к эндосомам (транспорт в цитозоль, если макропиносомы) Вероятно, на специфическое действие накладывается сильное неспецифическое влияние, подавляющее эндоцитоз гриба в целом (гипотезы приведены далее в тексте) Группа II Нокодазол Как и ингибиторы группы I, мало влияет на начальные стадии эндоцитоза, но супрессирует переход от стадии 2 к стадии 3 - препятствует внутриклеточному транспорту везикул, эндосом и макропиносом Ожидаемый результат - для животных показано, что микротубочки не участвуют в формировании и отшнуровке первичных везикул, но нужны для внутриклеточного транспорта эндомембран Группа III Монодансилкадаверин Не влияет на эндоцитоз R. solani Клатрин-зависимый эндоцитоз показан у дрожжевых грибов, в то время как у мицелиальных грибов клатрин, вероятно, не играет существенную роль в эндоцитозе (Schultzhaus et al., 2016) Группа IV Латрункулин А Почти сразу после начала опыта устанавливается подавляющее доминирование стадии 1 Латрункулин нарушает целостность грибных клеток, происходит быстрая множественная интернализация плазмалеммы (мы подтвердили это с помощью электронной микроскопии) Исходя из данных и пояснений в таблице 4 можно сделать выводы: а) ингибиторы животного эндоцитоза в большинстве своем действуют на грибной эндоцитоз, что указывает на консервативность многих механизмов эндоцитоза; вместе с тем, нечувствительность грибного эндоцитоза к монодансилкадаверину указывает на наличие особенностей данного процесса у грибов б) «классическое» действие нокодазола также указывает на то, что поздние стадии эндоцитоза схожи у грибов и животных (проходят при активном участии микротрубочек); причем, мы с помощью иммуноцитохимии подтвердили целевое действие нокодазола - деполимеризацию микротрубочек (рис. 4) в) неспецифическое/нецелевое действие многих ингибиторов имеет несколько вариантов объяснений. Оказалось, что латрункулин А действует на грибы слишком агрессивно и не пригоден для изучения участия актина в клеточных процессах (хотя его используют в ряде микологических публикаций (Aghamohammadzadeh, Ayscough, 2009; Walther, Wendland, 2009)). Явное наложение неспецифического/нецелевого действия ингибиторов из группы I на их целевое воздействие имеет два объяснения: Гипотеза №1: натамицин, диназор и питстоп 2 имеют побочное воздействие, влияющее на широкий круг разных типов эндоцитоза. Наиболее вероятно, что они воздействуют на актин, который в свою очередь по литературным данным принимает участие минимум в 6 из 10 известных типов эндоцитоза у животных (Doherty, McMahon, 2009). Гипотеза №2: грибы могут использовать регулирование скорости эндоцитоза как защитный механизм от ряда физиологически активных веществ в окружающей гриб среде. Например, замедлять скорость эндоцитоза в ответ на фитоалексины растения-хозяина. Из гипотезы №2 следует, что устойчивость к фунгицидам у грибов тоже может быть связана с регуляцией эндоцитоза. Проверке последнего предположения посвящен результат №5 данного Проекта. Подробнее с результатами и обсуждением действия ингибиторов на эндоцитоз R. solani можно ознакомиться в нашей публикации (Kamzolkina et al., 2017). Рис. 4. Иммунное мечение α-тубулина в клетках R. solani. а - без предобработки нокодазолом, видны фрагменты микротрубочек (цельные микротрубочки отсутствуют из-за ферментативной обработки клеточной стенки); б - после предобработки нокодазолом, микротрубочки полностью деполимеризованы Результат №5: Для защиты овощных культур от ризоктониоза используют в основном два фунгицида: пенцикурон и Максим «Дачник». Пенцикурон не растворим в воде и его коммерческий препарат сильно флуоресцирует в УФ-спектре, поэтому мы провели работу на втором фунгициде - Максим «Дачник». Активное вещество в данном контактном фунгициде - флудиоксонил. Мы использовали три штамма R. solani - один устойчивый к фунгициду Максим (штамм 103) и два чувствительных (102 и К3.3, таблица 5). Однако, как видно из таблицы 6, штаммы 102 и К3.3 по-разному чувствительны к фунгициду - штамм К3.3 не растет при любых концентрациях Максим, тогда как, штамм 102 способен к медленному росту при низких концентрациях фунгицида (рис. 6б). Другими словами, мы провели анализ динамики эндоцитоза после обработки фунгицидом у устойчивого к фунгициду штамма (103), чувствительного (К3.3) и у штамма с признаками слабой устойчивости (102). Таблица 5. Чувствительность к фунгицидам и скорость роста у штаммов R. solani Штамм Устойчивость к фунгициду пенцикурону Устойчивость к фунгициду Максим «Дачник» Средняя скорость роста на среде ЧА мм/сут 102 устойчивый чувствительный 9±0,8 K3.3 чувствительный чувствительный 6,4±0,4 103 чувствительный устойчивый 4,8±0,1 Таблица 6. Влияние разных концентраций фунгицида Максим «Дачник» на рост мицелия штаммов R. solani Концентрация фунгицида, % 0,004 0,008 0,016 0,02 0,2 0,8 1,6 Штаммы 102 медленный рост мицелия рост отсутствует К 3.3 рост отсутствует 103 рост, близкий к контрольному Рис. 6. Скорость роста мицелия штаммов 103 и 102 под влиянием различных концентраций фунгицида Максим (концентрации фунгицида отображены в легендах справа от диаграмм). Рис. 5. Динамика эндоцитарного поглощения маркера АМ4-64 тремя штаммами R. solani с разной чувствительностью к фунгициду Максим «Дачник». По оси ординат отложена частота встречаемости той или иной из четырех стадий эндоцитоза в двух временных промежутках (0 - 15 мин и 15 - 30 мин). Опыт - 30 мин прединкубации в 0,004% фунгициде, контроль - без обработки фунгицидом. Рис. 5 отражает результаты опытов с флуоресцентным мечением эндоцитарных путей у R. solani без и с обработкой фунгицидом Максим. Концентрация фунгицида использована минимальная (0,004%), при которой штамм 102 проявляет слабую устойчивость. Из рисунка видно, что у штаммов 102 и К3.3 фунгицид сильно замедляет эндоцитоз на начальных стадиях (на стадии 0, в промежутке 15-30 мин лишь незначительное количество клеток доходят до стадии 2). Похожим действием обладают ингибиторы из группы I (рис. 3). Штамм 103, напротив, абсолютно «не реагирует» на фунгицид - динамика эндоцитоза в опыте и контроле одинаковы, при этом скорость роста мицелия не отличается от контроля (рис. 6а). Интерпретация полученных результатов может быть следующая: ситуация с устойчивым штаммом 103 ясна - штамм на популяционно-генетическом уровне приспособился к фунгициду, выработал механизм устойчивости и «спокойно» поглощает питание и прочее из субстрата, «не боясь» попадания фунгицида внутрь клеток. Чувствительный штамм К3.3, скорее всего, перестает эндоцитировать из-за цитотоксичного действия фунгицида - нарушается метаболическая работа клеток, повреждения и отсутствие энергии супрессируют эндоцитоз. А вот замедление эндоцитоза у промежуточного по чувствительности штамма 102 можно объяснить и иначе - штамм не обладает эффективными механизмами устойчивости, поэтому стремится свести к минимуму попадание фунгицида в клетки - замедляет свой эндоцитоз и растет медленно (рис. 6б). 3.6. Сопоставление результатов, полученных в ходе реализации с мировым уровнем По сравнению с эндоцитозом животных, эндоцитоз грибов, тем более - мицелиальных грибов, изучен намного слабее. Из таблиц 7 и 8 следует, что основные современные исследования эндоцитоза проводят на четырех модельных видах грибов, причем, основное внимание направлено на апикальный эндоцитоз и на ряд частных аспектов грибного эндоцитоза. Исключая Ustilago maydis, базидиальным грибам в плане изучения эндоцитоза посвящены лишь немногочисленные работы (поглощение маркера FM4-64 Pisolithus tinctorius, Lentinula edodes (Cole et al., 1997; Lee et al., 2007)). Сравнение общей динамики эндоцитоза у базидиальных грибов из разных эколого-трофических групп, которое мы провели в рамках Проекта, в научной литературе не отражено. В таблице 8 продемонстрировано доминирование частного подхода в современных исследованиях к грибному эндоцитозу - изучают поглощение конкретного карго, определенных эндоцитарных белков и т.д. Мы провели пусть и поверхностный, но общий анализ особенностей эндоцитоза у мицелиальных грибов, не сужая объект исследования до апикальных клеток гиф, используя ингибиторы эндоцитоза у животных и ингибиторы сборки цитоскелета. Такой подход позволил нам сделать ряд новых предположений относительно эндоцитоза у базидиомицетов, сравнить эндоцитоз животных и грибов. Мы экспериментально проверили гипотезу о том, что регуляция скорости эндоцитоза у фитопатогенов может исполнять роль своеобразной «предзащиты» - контролировать поступление в клетки гриба фунгицидов/фитоалексинов у штаммов с частичной устойчивостью. Данная идея и ее подтверждение также не освещены в известных нам научных публикациях, и могут иметь практический выход в фитопатологии. Таблица 7. Основные лаборатории, в настоящее время занимающиеся эндоцитозом у мицелиальных и диморфных грибов Страна Институт Руководитель группы или исследователи Вид гриба США Texas A&M University Schultzhaus Z.S, Shaw B.D. Aspergillus nidulans Англия Biosciences and Mathematics Research Institute Steinberg G. Ustilago maydis Испания Centro de Investigaciones Biologicas CSIC Penãlva M.A. A. nidulans Германия Karlsruhe Institute of Technology Fischer R. Neurospora crassa Китай Nanjing Agricultural University Zhang Z. Magnaporthe oryzae Греция National and Kapodistrian University of Athens Diallinas G. A. nidulans Япония Kyushu University Higuchi Y. U. maydis Таблица 8. Основные направления современных работ в области изучения эндоцитоза у мицелиальных грибов Вид/виды грибов Тема/направление исследования Литература A. nidulans Роль апикального эндоцитоза в вытягивании гифы и полярном росте Araujo-Baza´n et al., 2008; Taheri-Talesh et al., 2008; Hervas-Aguilar and Penalva, 2010; Peňаlva, 2010 A. nidulans Эндоцитоз транспортера плазматической мембраны UapA Gournas et al., 2010; Karachaliou et al., 2013 A. nidulans Роль клатрина и белкового комплекса AP-2 в апикальном эндоцитозе Martzoukou et al, 2017; Schultzhaus et al., 2016; 2017 U. maydis Роль эндоцитоза в транспорте мРНК, рибосом и сигнальных молекул Higuchi et al., 2014; Haag et al., 2015; Higuchi, 2016 A. nidulans, U. maydis, Ashbya gossypii Роль цитоскелета в транспорте ранних эндосом Straube et al., 2003; Abenza et al., 2009; Steinberg, 2014 N. crassa, M. oryzae Исследования эндоцитозных и моторных белков Seidel et al., 2013; Huang et al., 2017 3.7. Методы и подходы, использованные в ходе реализации Проекта (описать, уделив особое внимание степени оригинальности и новизны) Рис. 7. Схема, отражающая совокупность методических подходов, использованных в Проекте На рис. 7 отражена вся совокупность методов, которые мы использовали в ходе реализации Проекта. Основной «методический стержень» работы составляют флуоресцентно-микроскопическое мечение эндоцитозного поглощения вкупе с ингибиторным анализом. В литературе есть данные, например, об отслеживании эндоцитоза с помощью маркера FM4-64, совмещенном с обработкой мицелия цитохалазином (ингибитором сборки актина), у ксилотрофного базидиомицета L. edodes (Lee et al., 2007). Однако такое широкое и многоцелевое ингибиторное воздействие с последующим флуоресцентно-микроскопическим анализом динамики эндоцитоза у мицелиальных грибов реализовано впервые. Если кратко, ингибиторную обработку мицелия проводили до инкубирования препаратов с АМ4-64. Микроскопический анализ эндоцитозного поглощения в Проекте состоит главным образом из мечения эндоцитозных мембранных структур стириловой пробой AM4-64. Препараты мицелия инкубируют на холоде в растворе АМ4-64, происходит включение метки в плазмалемму. Затем препараты помещают в тепло, происходит запуск эндоцитоза, маркер интернализируется в клетки вместе с первичными микро- и макропиноцитарными везикулами, остается в эндоцитарных эндомембранах до самого включения в тонопласт вакуолей (см. рис. 8). Рис. 8. Схема, отражающая процесс включения стирилового маркера АМ4-64 в клетку путем эндоцитоза (здесь - микропиноцитоза). Обозначения на рисунке: ВК – вакуоли, КС – клеточная стенка, МАВ – макровезикулы, МВТ – мультивезикулярные тела, МИВ – микровезикулы, ПЭ – поздние эндосомы, РЭ – ранние эндосомы, ЦМ – цитоплазматическая мембрана. ТЭМ и иммуноцитохимический метод использовали как дополнительные методы для подтверждения некоторых результатов. Так, ТЭМ применяли для выяснения характера воздействия латрункулина А на грибные клетки, для визуализации макропиносом. Непрямую иммунную реакцию с антителами против α-тубулина с низкой видовой специфичностью ставили для флуоресцентного мечения микротрубочек, для подтверждения деполимеризирующего действия нокозадола. 3.9. Участие в научных мероприятиях по тематике Проекта за период, на который предоставлен грант (каждое мероприятие с новой строки, указать названия мероприятий и тип доклада) 7-th Congress of European Microbiologist, FEMS 2017. Постер. Четвёртый съезд микологов России, Москва. 2017. Устный доклад. 3.10. Участие в экспедициях по тематике Проекта, за период, на который предоставлен грант (указать номера проектов) нет 3.11. Адреса (полностью) ресурсов в Интернете, подготовленных авторами по данному проекту, например, http://www.somewhere.ru/mypub.html нет 3.13. Библиографический список всех публикаций по Проекту, опубликованных за период, на который предоставлен грант, в порядке значимости: монографии, статьи в научных изданиях, тезисы докладов и материалы съездов, конференций и т.д. Kamzolkina O.V., Kiselica M.A., Kudryavtseva O.A., Shtaer O.V., and Mazheika, I.S. (2017). Endocytosis and its inhibitors in basidiomycetous fungus rhizoctonia solani // Moscow University biological sciences bulletin, 72(3):128–136. Камзолкина О.В., Киселица М.А., Крупенина Н.А., Кудрявцева О.А., Штаер О.В., и Мажейка, И.С. (2017). Эндоцитоз у грибов: механизмы и функции / в Современная микология в России, Национальная академия микологии М., 6: 65–67. Камзолкина О.В., Киселица М.А., Кудрявцева О.А., Штаер О.В., и Мажейка И.С. (2016). Влияние температурного фактора на рост мицелия и динамику эндоцитоза у базидиальных грибов из разных эколого-трофических групп / в Факторы устойчивости растений и микроорганизмов в экстремальных природных условиях и техногенной среде. Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием и школы молодых ученых, Изд-во Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН Иркутск, 101–102. Kamzolkina O.V., Кiselica M.A., Krupenina N.A., Kudryavtseva O.A., Shtaer O.V., and Mazheika I.S. (2017). Endocytic pathways in plant pathogenic fungus rhizoctonia solani / In FEMS 2017. Valencia, Abstract book, P. 7–2591.