ИСТИНА

В последнее десятилетие произошла существенная переоценка роли и масштабов микробной азотфиксации на Земле, принципиально изменившая взгляды на этот процесс. Основные представления о симбиотической и ассоциативной азотфиксации, ранее, как правило, были связаны с растениями. Сведения об ассоциациях животных, в том числе почвенных беспозвоночных, с азотфиксаторами пока немногочисленны. Тем не менее, в последнее время обнаружена активная азотфиксация у многих видов животных, питающихся низкобелковыми кормами, в том числе, и беспозвоночных. По нашим предварительным оценкам, вклад микробной азотфиксации в азотный баланс животных может быть физиологическим значимым. Известно, что биомасса беспозвоночных в верхних горизонтах почв может достигать 200 тонн на квадратный километр, причем наибольшая ее часть приходится на долю дождевых червей (до 40-50 т) и членистоногих (до 30 т). Поэтому исследование новых локусов микробной азотфиксации в пищеварительном тракте почвенных животных может внести существенные коррективы в представление о масштабах микробной азотфиксации в почвах разных типов. В ходе выполнения проекта нами будут изучены представители разных групп почвенных беспозвоночных с целью обнаружения у них диазотрофов и определения вклада "биологического азота" в их азотный баланс, а также в азотный баланс почв в местах их обитания. В предыдущих наших работах была исследована микробная азотфиксация в пищеварительном тракте дождевых червей разных эколого-трофических групп и некоторых родов термитов. Нами впервые выявлена высокая нитрогеназная активность в пищеварительном тракте личинок насекомых: жуков-щелкунов (Elateridae, Coleoptera) и длинноусых двукрылых (Tipulidae, Diptera). В ходе выполнения проекта планируется обследовать на наличие микробной азотфиксации широкий круг почвенных беспозвоночных: почвообитающих насекомых (на примере термитов и муравьев), а также личинок насекомых с разными пищевыми преферендумами (Elateridae, Tipulidae и др.). Исследования будут проведены с использованием животных из естественных биотопов и в модельных экспериментах. При этом впервые будут использованы три основных метода определения азотфиксации – балансовый, изотопный (15N) и ацетиленовый. Также предполагается изучение таксономического и функционального разнообразия микробных симбионтов, ассоциированных с исследуемыми беспозвоночными.

In a recent decade a significant reconsideration of the role and scales of microbial nitrogen fixation on Earth has occurred. It has fundamentally changed views at this process. The main concepts of symbiotic and associative nitrogen fixation are commonly linked with plants. Information about the associations of animals, including soil invertebrates, with nitrogen fixers is still scarce. Nevertheless, active nitrogen-fixation has recently been found in many species of animals that feed on low protein feeds, including invertebrates. According to our preliminary estimates, the contribution of microbial nitrogen fixation to the nitrogen balance of animals may be physiological significant. It is known that the biomass of invertebrates in the upper horizons of the soil can reach 200 tons per square kilometer, with the largest part of it being accounted for by earthworms (up to 40-50 tons) and arthropods (up to 30 tons). Therefore, the study of new microbial nitrogen fixation loci in the digestive tract of soil animals can make significant adjustments to the idea of the scale of microbial nitrogen fixation in soils of different types. We have studied representatives of different groups of soil invertebrates in order to detect diazotrophs in them and determine the contribution of “biological nitrogen” to their nitrogen balance, as well as to the nitrogen balance of soils in their habitats. In our previous works, microbial nitrogen fixation was studied in the digestive tract of earthworms of various ecological-trophic groups and some genera of termites. We first identified a high nitrogenase activity in the digestive tract of insect larvae: click beetles (Elateridae, Coleoptera) and long-winged dipterous (Tipulidae, Diptera). We have examined for the presence of microbial nitrogen fixation a wide range of soil invertebrates: soil insects (on the example of termites and ants), as well as insect larvae with different food preferentials (Elateridae, Tipulidae, etc.). We have studied of the taxonomic and functional diversity of microbial symbionts associated with the invertebrates under study is also supposed.

Фундаментальной научной проблемой, на решение которой направлен проект, является количественная оценка участия почвообитающих животных в процессах почвообразования, а также оценка их влияния на основные биогеохимические циклы в наземных экосистемах. Конкретной фундаментальной задачей проекта является комплексное изучение новых локусов микробной азотфиксации, ассоциированной с пищеварительным трактом почвенных беспозвоночных с использованием балансового (с использованием элементного анализатора), изотопного (с использованием в качестве изотопной метки газообразного 15N2) и ацетиленового газохроматографического методов с проведением анализа интестинальной микрофлоры исследуемых видов при обитании в естественных биотопах и в модельных экспериментах. В проекте основное внимание будет уделено количественной оценке микробной азотфиксации в пищеварительном тракте почвенных беспозвоночных, что позволит получить новые данные о масштабах микробной азотфиксации в почвах в местах их обитания. Предполагается провести детальное исследование микробного диазотрофного комплекса пищеварительного тракта почвенных беспозвоночных разных эколого-трофических групп. Будет оценена биомасса, таксономическое и функциональное разнообразие микробных сообществ почвы, кишечника и копролитов исследуемых видов беспозвоночных.

На протяжении последних 15 лет нами были изучены представители разных групп животного мира, потребляющих низкобелковую пищу, с целью обнаружения у них бактерий-диазотрофов и определения вклада "биологического азота" в их азотный баланс, а также в азотный баланс населяемых ими почв. Нитрогеназная активность обнаружена в пищеварительном тракте ряда почвенных беспозвоночных: дождевых червей, некоторых родов термитов. Впервые нами обнаружена нитрогеназная активность в кишечнике личинок двух семейств насекомых - жуков-щелкунов (Elateridae, Coleoptera) и длинноусых двукрылых (Tipulidae, Diptera). Высокая бактериальная азотфиксация выявлена в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) позвоночных животных-фитофагов (лось, марал, полевки, песчанки, слепыши, зайцы, пищухи, бобры и др.). В ходе выполнения предыдущих проектов РФФИ нами была исследована микробная азотфиксация в пищеварительном тракте дождевых червей разных эколого-трофических групп. Нами также проводились исследования азотфиксации в пищеварительном тракте и гнездовом материале термитов. Были исследованы следующие виды термитов Neotermes castaneus, Zootermopsis angusticollis, Reticulitermes lucifugus, Anacanthotermes ahngerianus. В этих популяциях термитов и их гнездовом материале были определены нитрогеназная активность, численность диазотрофных бактерий, структура и функциональные особенности комплекса микроорганизмов. Установлено сходство в структуре и свойствах бактериальных сообществ кишечника термитов и гнездового материала соответствующих популяций. Впервые было показано, что для каждой исследованной популяции характерен собственный таксономический состав микроорганизмов, однако функциональные возможности микробных комплексов различных популяций практически идентичны. На основании модельных экспериментов был сделан вывод об ассоциативном характере взаимодействия между бактериями-азотфиксаторами кишечника термитов и самими насекомыми.

Газохроматографическим и изотопным методами была обнаружена высокая нитрогеназная активность в пищеварительном тракте личинок насекомых - различных видов жуков-щелкунов (Coleoptera, Elateridae) и личинок двукрылых (Tipulidae, Diptera), коррелирующая с численностью азотфиксирующих микроорганизмов. В кишечнике личинок Selatosomus aeneus активность азотфиксации достигала максимальных значений – до 700 N2/ч/1 г тканей кишечника у личинок из пойменных биотопов, характеризующихся преимущественной фитофагией. У S.aeneus общая численность азотфиксирующих бактерий достигала 120 млн КОЕ/г, что сопоставимо с численностью сапротрофных бактерий, причем структура комплекса азотфиксаторов отличалась монодоминантностью: около 98% составляли Microbacterium oxydans. Установлено, что микробиом проволочников–миксофагов (A.obscurus и S.aeneus) отличается высоким групповым и функциональным разнообразием, высокой стабильностью, что обеспечивает высокую трофическую пластичность личинок щелкунов в зависимости от условий внешней среды. В кишечнике личинок типулид разных эколого-трофических групп также выявлена активная азотфиксация. У личинок Tipula maxima, представляющих группу фитофагов-детритофагов, непосредственно участвующих в разложении растительного опада, установлена максимальная нитрогеназная активность и численность азотфиксаторов. Установлена высокая численность микроорганизмов, в том числе, и азотфиксирующих, в бродильной камере у личинок данного вида. Показано, что структура микробного комплекса пищеварительного тракта личинок насекомых значительно отличается от структуры почвенного микробного комплекса. В почвах, населенных личинками типулид и жуков-щелкунов, значительно увеличивается скорость микробной трансформации азота и углерода. По данным метода ацетиленредукции, значимой азотфиксации, ассоциированной с пищеварительным трактом муравьев (6 видов) обнаружить не удалось, однако, из муравьев L. flavus и F. cunicularia регулярно выделялись методом посева бактерии родов Azotobacter и Beijerinckia, которые составляли группу среднего обилия (20-30%) от общей численности микроорганизмов. В то же время, нами обнаружена активность азотфиксации в материале, отобранном из гнезд изученных видов муравьев, которая достоверно различалась по локализации в пределах муравейников и по сезонной динамике. Установлено, что муравейники существенно отличаются от контрольной почвы по характеру распределения таких биофильных элементов, как С и N. Отмечено накопление их в подземных частях муравьиных гнезд (в 1,5-2 раза по сравнению с почвой), что оказывает значительное влияние на активность основных микробиологических процессов трансформации азота и углерода. У 11 изученных видов термитов, обитающих в Национальном парке Кат Тьен в Южном Вьетнаме нами обнаружены высокие показатели микробной азотфиксации. Максимальными значениями нитрогеназной активности в пищеварительном тракте характеризовались низшие термиты-ксилофаги, наболее низкими значениями - Macrotermes carbonarius, которых относят к мицетофагам. Нами впервые двумя независимыми методами (газохроматографическим и изотопным) была установлена высокая микробная азотфиксация в пищеварительном тракте почвообитающих личинок комаров-долгоножек T. maxima, что может служить дополнительным источником азота для личинок. Также достоверная нитрогеназная активность была зафиксирована в содержимом кишечников личинок, относящихся к другим эколого-трофическим группам: бриогидробионтам - T. staegeri - и бриомезобионтам - T. irrorata. Бактерии-азотфиксаторы из пищеварительного тракта типулид длительное время сохраняются в почве, увеличивая активность почвенной азотфиксации в 2 раза за первый месяц и в 8 раз за три месяца жизнедеятельности личинок T. maxima, и в других субстратах, способствуя накоплению азота в местах обитания личинок. Показано, что в почве, населенной личинками T. maxima значительно увеличивается скорость процессов микробной трансформации азота и углерода.В пищеварительном тракте личинок всех исследованных видов типулид и населенных ими субстратах методом посева выявлена высокая численность азотфиксаторов. Максимальная численность бактерий и длина мицелия грибов была отмечена в бродильной камере кишечника личинок T. maxima и T. staegeri, однако в кишечнике T. maxima общая численность значительно ниже, чем в почве в местах их обитания. При этом практически весь обнаруженный нами в кишечнике личинок мицелий был нежизнеспособным, что свидетельствует о его переваривании под воздействием пищеварительных ферментов личинок типулид. Микробный комплекс в ЖКТ всех исследованных нами видов личинок существенно отличался по видовому разнообразию друг от друга, а также от таксономического состава комплекса микроорганизмов в почве и субстратах, в которых они обитают. В пищеварительном тракте личинок каждого вида доминировали определенные группы бактерий: представители порядка Myxococcales – в кишечнике T. maxima, энтеробактерии и бактерии рода Rhodococcus – в ЖКТ T. staegeri, также энтеробактерии и представители рода Cytophaga – в пищеварительном тракте T. irrorata и в содержимом кишечника личинок Metalimnobia bifasciata – представители рода Flavobacterium. Согласно данным, полученным методом МСТ, под воздействием личинок долгоножек в субстратах увеличивается активность метаболической работы, проводимой микробным сообществом, в почве и в древесине микробный комплекс становится более устойчивым, а также в почве возрастает число потребляемых микроорганизмами субстратов. Проведено исследование микробной азотфиксации и дана структурно-функциональная характеристика микробного комплекса пищеварительного тракта личинок насекомых на примере личинок длинноусых двукрылых (Tipulidae, Diptera). Поставлены эксперименты по культивированию личинок типулид на контролируемой диете разного состава с последующим определением изменений их кишечного микробного комплекса, а также микробного комплекса копролитов при смене состава пищи. Проведено сравнительное определение активности процесса азотфиксации в пищеварительном тракте у этих личинок при смене диеты. Оценено содержание общего азота и углерода (с использованием элементного анализатора) в корме личинок, в пищеварительном тракте, а также, в динамике, в их копролитах и почве при инкубации личинок в микрокосмах. Продолжено определение специфики прокариотного, метаболически активного микробного сообщества в исследуемых объектах методом флуоресцентной гибридизации in situ (метод FISH). Проведен анализ функциональных различий интестинальных микробных комплексов у личинок типулид с разными пищевыми режимами методом мультисубстратного тестирования (МСТ). Проведено количественное определение генов наиболее распространенных бактериальных нитрогеназ с помощью Real Time PCR (BioRad, UK) в суммарной бактериальной ДНК выделенной из кишечника личинок типулид разных эколого-трофических групп, проведена оценка изменения этих показателей при смене диеты личинок. В связи с установленным нами доминированием в пищеварительном тракте личинок типулид анаэробных бактерий, проведен анализ филогенетического разнообразия микроорганизмов кишечника личинок типулид методом метагеномного анализа с использованием секвенирования нового поколения (NGS).