ИСТИНА

Проект посвящен биоинформатическому поиску пролин-специфичных пептидаз (PSP). Объектами исследования будут являться PSP из личинок жуков-вредителей запасов зерновых Tenebrionidae, PSP грибов-фитопатогенов из рода Fusarium, PSP семян и/или проростков пшеницы рода Triticum. Основным белковым субстратом для этих разных групп организмов являются глиадины. Эти белки со специфической структурой содержат до 30% остатков пролина и практически не гидролизуются большинством ферментов с широкой субстратной специфичностью. Основная идея, положенная в основу данного проекта, состоит в том, что пищеварительный комплекс насекомых Tenebrionidae, грибы-фитопатогены Fusarium и семена или проростки пшеницы должны содержать набор PSP, способных расщеплять глиадины. Найденные PSP могут быть активны в отношении гидролиза токсических пептидов проламинов, вызывающих у чувствительных людей аутоиммунное заболевание ЖКТ человека – целиакию.

The project is focused on bioinformatic search, biochemical isolation, identification and structural and functional characterization of a proline-specific peptidases (PSP). We plan to study PSP from the larval digestive complex of grain crops pests beetles (Coleoptera: Tenebrionidae) Tenebrio molitor and Tribolium castaneum, PSP from fungal plant pathogens of the Fusarium genus, PSP from germ seeds and/or seedlings of wheat Triticum. The main protein substrate for these different groups of organisms are difficult for the hydrolysis wheat prolamins (gliadins). These proteins possess a specific structure containing up to 30% proline residues, so that they are not hydrolyzed by the majority of enzymes with broad substrate specificity. The basic idea of the present project is that the Tenebrionidae insects' digestive complex, Fusarium fungal system and wheat germ Triticum should contain a set of PSP capable of cleaving prolamins, natural substrates for these groups of organisms. It is also assumed that the revealed PSP can hydrolyze prolamins toxic peptides, which cause an autoimmune Celiac Disease in genetically predisposed susceptible group of people.

По завершению проекта будут подробно изучены PSP Tenebrio molitor, Tribolium castaneum, грибов рода Fusarium и семян пшеницы Triticum, проведено сравнение наборов пептидаз у этих организмов и человека, выбраны наиболее эффективные пути гидролиза пролин-богатых белков и пептидов. 1. Выявление набора PSP в геноме человека. Будут получены данные о первичной структуре ферментов, проведена их классификация, доменная организация последовательностей. 2. Анализ PSP в геноме T. castaneum, Fusarium и Triticum позволит выявить набор и последовательности этих пептидаз у насекомых, грибов и растений. 3. Поиск и аннотация транскриптов PSP в транскриптоме кишечника личинок T. molitor. 4. Будет проведено сравнение PSP насекомых, растений и грибов с PSP человека. 5. Будет изучена локализация PSP в тканях и содержимом кишечника личинок T. molitor, предсказана функция для некоторых из них. 6. Наиболее активные пищеварительные PSP личинок T. molitor будут выделены и очищены.

У авторского коллектива имеется опыт работы по изучению протеолитических ферментов и их использованию для решения прикладных задач. Члены коллектива специализируются в разных областях биохимии, биоорганической химии, а также биоинформатики. Участники проекта изучают пищеварительные пептидазы и организацию пищеварительного протеолиза у насекомых, грибов и растений. С использованием хроматографии был выделен и охарактеризован главный пищеварительный катепсин L T.castaneum. Для фермента изучена субстратная специфичность, проведен ингибиторный анализ, исследована электрофоретическая подвижность (Tereshchenkova (Sharikova) et al., 2013. FEBS Journal, 280(S1):587-587). Показано, что неидентифицированные цистеиновые пищеварительные пептидазы личинок жука T. molitor обладают постглутамин-расщепляющей активностью (Элпидина и др., 2013. Сборник тезисов «Белки и пептиды», с. 101), что может быть связано не только с адаптацией этих организмов к растительной пище, богатой ингибиторами сериновых пептидаз, но и с необходимостью эффективного расщепления богатых глутамином белков, входящих в состав их диеты. Авторами отработан метод селективного тестирования активности пептидаз в многокомпонентных смесях пищеварительного комплекса T. molitor и T. castaneum (Semashko et al., 2014. Anal Biochem., 449:179-187). Проведены предварительные исследования комплекса PSP T. molitor. С использованием специфического субстрата показано наличие DPP 4 в пищеварительном комплексе T. molitor (Tereshchenkova (Sharikova) et al., 2014. Protein Science, 23(S1):176-177). У авторов есть опыт работ с культурами грибов рода Fusarium. Показано наличие секретируемых аминопептидаз, а также субтилизин- и трипсин-подобных ферментов у F. sambucinum (Шамрайчук и др., 2014. Сборник тезисов «Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция», с. 92). Помимо этого, исследованы протеолитические ферменты фитопатогена Botrytis cinerea (Shamraychuk et al., 2014. Journal of Medical and Biological Sciences, 1:30-35).

1. Собрана информация об известных PSP в геноме человека. Получены данные о первичной структуре ферментов, проведена их классификация по химическому механизму катализа, по молекулярной структуре и гомологии. 2. Проведен анализ PSP в геномах T. castaneum, Fusarium и Triticum. 3. Проведен биоинформатический поиск и аннотация транскриптов PSP в транскриптоме кишечника личинок T. molitor, что позволило определить предполагаемый комплекс пищеварительных PSP. 4. Произведена оценка уровня экспрессии мРНК найденных пептидаз. 5. Изучена локализация PSP в тканях и содержимом кишечника личинок T. molitor, на основании которой предсказана пищеварительная функция для некоторых из них. 6. Наиболее активная пищеварительная PSP личинок T. molitor была выделена и очищена. Для фермента изучены физико-химические и энзиматические свойства: влияние рН на активность и стабильность, субстратная специфичность, влияние ингибиторов. 7. Проведен поиск активности PSP в культурах грибов-фитопатогенов рода Fusarium. 8. Выделена и охарактеризована вторая высокоэкспрессируемая PSP T. molitor - пролидаза. 9. Охарактеризовано участие PSP в гидролизе проламинов.