Разработка нового модельного объекта биологии развития, известковой губки Leucosolenia variabilis и исследование клеточных, субклеточных и молекулярно-генетических механизмов восстановительных морфогенезов этой моделиНИР

Development of a new model object for EvoDevo, the calcareous sponge Leucosolenia variabilis and the study of cellular, subcellular and molecular-genetic mechanisms of regenerative morphogeneses of this model

Соисполнители НИР

СПбГУ Координатор

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2019 г.-24 декабря 2019 г. Разработка нового модельного объекта биологии развития, известковой губки Leucosolenia variabilis и исследование клеточных, субклеточных и молекулярно-генетических механизмов восстановительных морфогенезов этой модели
Результаты этапа: Целью проекта является разработка нового модельного объекта для современной биологии развития – асконоидной известковой губки Leucosolenia variabilis (Calcaronea) и проведение на его основе комплексного исследования фундаментальных морфогенетических процессов, лежащих в основе одного из ключевых явлений в онтогенезе животных - регенерации. Во время выполнения проекта в 2019 году был собран, зафиксирован и проанализирован материал для детального исследования ультраструктуры клеток и эпителиальных пластов (хоанодерма, пинакодерма) интактных губок, а также механизмов морфогенетических процессов сопровождающих различные восстановительные процессы у Leucosolenia variabilis. Были протестированы различные методы фиксаций и отобраны оптимальные, специально адаптированные для нашей модели. Для получения полной картины тканевой и клеточной организации были исследованы разные участки тела губки: оскулярная трубка (включая окулярное кольцо), трубка кормуса, дивертикулы, точки контакта с субстратом. На примере L. variabilis нами впервые для известковых губок выявлены такие ультраструктурные особенности, как специализированные межклеточные контакты между хоаноцитами, пинакоцитами, а также пороцитами и хоаноцитами. Кроме того, дано подробное описание скелета губки, ее анатомии, гистологии и ультраструктуры всех типов клеток. Успешно проведены эксперименты и прижизненное описание восстановительных процессов (реагрегация диссоциированных клеток, восстановление целой губки из небольшого фрагмента тела, восстановление отрезанного оскулюма). Собран материала для секвенирования транскриптома интактных L. variabilis с последующей оценкой дифференциальной экспрессии. Для этого были выбраны отдельные участки тела губки: оскуюм, кормус и дивертикулы. Также была получена РНК из целой губки, для сборки референсного транскриптома. Всего было секвенировано 13 библиотек (1 референсная, по 3 биологических повторности для оскулюма, кормуса и дивертикула) на 1 дорожке NovaSeq 6000 (Illumina), получено 1,1 млрд парно-концевых прочтений длиной 150 п.н. Проведено исследование клеточной пролиферации и программируемой клеточной гибели в интактных тканях. Исследования уровня пролиферации в разных участках тела губок с помощью EdU и фосфорилированного гистона-3 показали, что распределение пролиферирующих клеток по телу губки не равномерно. EdU-положительные клетки присутствуют в значительном количестве во всех участках тела губки, кроме оскулярного кольца, где они либо полностью отсутствуют, либо встречаются единично. Доля pH3-положительных клеток была значительно ниже доли EdU-положительных клеток и варьировала в разных участках губок. Тем не менее, четкой закономерности в этих вариациях не прослеживается. По своей природе большинство EdU-положительных клеток является хоаноцитами. pH3-положительные клетки встречаются во всех слоях тела губки – хоанодерме, мезохиле и экзопинакодерме. В ходе исследований интактных тканей губки методом TUNEL нам не удалось обнаружить в них апоптотических клеток. Эти, вероятно, указывает на крайне низкую интенсивность апоптоза в интактных тканях губки. Таким образом, нами впервые получены данные о процессах нормального самообновления тканей губок. Были успешно проведены тестовые эксперименты по блокировке клеточной пролиферации в интактных тканях и при регенерации. Для этого были использованы три вещества: 1) нокодазол, 2) гидроксимочевина, 3) афидиколин. В результате проведенных экспериментов нам удалось заблокировать клеточную пролиферацию всеми использованными веществами при их разной концентрации и продолжительности инкубирования. Осуществлены тестовые эксперименты по функциональному (ингибиторному) анализу роли канонического сигнального пути Wnt при регенерации (для подбора концентраций действующих веществ). Роль канонического сигнального пути Wnt при регенерации оценивали путем ингибиторного анализа с помощью фармакологических агентов: активаторы (BIO и азакенпаулон) и ингибиторы (PNU-74654 и iCRT14) Wnt-каскада. В результате тестовых экспериментов были определены оптимальные рабочие концентрации действующих веществ для последующего проведения функционального анализа роли сигнального пути Wnt в восстановительных процессах (реагрегация клеток после диссоциации тканей, восстановление губки из небольшого фрагмента тела, восстановление отрезанного оскулюма). Нами также был оптимизирован протокол гибридизации нуклеиновых кислот in situ (WMISH) для визуализации экспрессии генов в тканях L. variabilis. За отчетный период, по полученным данным были подготовлены две статьи для публикации в международном журнале, входящем в первый квартиль Q1 и в периодическом сборнике: Methods in Molecular Biology, (Изд. Springer Nature). Также полученные в ходе реализации проекта результаты были доложены на одном международном воркшопе в постерном сообщении, на двух международных летних школах в трех приглашенных лекциях и на одной конференции-школе с международным участием в приглашенном докладе и постерном сообщении. Таким образом, все запланированные работы были выполнены в полном объеме и более того, немного расширены.
2 1 января 2020 г.-25 декабря 2020 г. Разработка нового модельного объекта биологии развития, известковой губки Leucosolenia variabilis и исследование клеточных, субклеточных и молекулярно-генетических механизмов восстановительных морфогенезов этой модели
Результаты этапа: Целью проекта является разработка нового модельного объекта для современной биологии развития – асконоидной известковой губки Leucosolenia variabilis и проведение на его основе комплексного исследования фундаментальных морфогенетических процессов, лежащих в основе одного из ключевых явлений в онтогенезе животных - регенерации. Во время выполнения проекта в 2020 году, несмотря на ограничения, связанные с эпидемией Covid-19, был собран, зафиксирован и проанализирован дополнительный материал для детального исследования цитологических механизмов, лежащих в основе морфогенетических процессов, сопровождающих различные восстановительные процессы у L. variabilis. План работ выполнен в почти полном объеме. С помощью проточного цитофлуориметра охарактеризован клеточный цикл в интактных тканях губки: 53±2,9% клеток находится в G0/G1-фазе, 5,8±1,1% - в G2/M-фазе, 12,97±0,7% - в S-фазе. Суммарная длительность S, G2 и M фаз составляет около 13,4 ч. Был проведен количественный анализ пролиферации клеток и программируемой клеточной гибели в процессе регенерации стенки тела. В период регенерации сохраняется общий паттерн клеточной пролиферации, характерный для интактных тканей губки. Доля пролиферирующих клеток в раневой и интактной областях во всех исследованных временных периодах статистически значимо не изменяется, что указывает на отсутствие значительного вклада пролиферации в процесс регенерации. Апоптоз происходит на всех стадиях регенерации стенки тела. В целом его уровень очень низок, однако он несколько выше на ранних стадиях регенерации. Апоптотирующие клетки находятся преимущественно на краю раны на всех исследованных стадиях. По технологии NovaSeq6000 (Illumina) была секвенирована кДНК L. variabilis, собран референсный транскриптом с N50 = 1299 и BUSCO = 98%. Транскриптом был аннотирован, и в нем были найдены и охарактеризованы in silico ряд генов зародышевой линии (piwi, vasa, pl10), а также ряд транскриптов, кодирующих потенциальные ортологи белков, участвующих в формировании межклеточных контактов на разных уровнях – от взаимодействия клетка-клетка за счет внеклеточных доменов, до поляризации клеток за счет организации цитоскелета. Были начаты работы по определению и описанию локализации экспрессии ряда генов сигнальных путей Wnt и TGFb в интактных тканях. Было идентифицировано 17 ортологов TGF-beta и 19 ортологов Wnt. Показана дифференциальная экспрессия различных лигандов wnt в теле L. variabilis с помощью гибридизации in situ с меченным РНК-зондом. Нами были классифицированы все регенерационные процессы, которые мы исследовали у L. variabilis: 1. Регенерация всего тела; 2. Структурная регенерация; 3. Тканевая регенерация (репаративная регенерация стенки тела). Несмотря на высокое многообразие способов регенерации Leucosolenia, разнообразие морфогенетических механизмов, которые их сопровождают, весьма ограничено. Сама регенерация идет по типу морфаллаксиса. В основе этих механизмов, кроме случая восстановления губки из диссоциированных клеток, находятся перегруппировки неповрежденных тканей путем эпителиальных морфогенезов. Они сопровождаются многочисленными трансдифференцировками хоаноцитов. Впервые было начато исследование клеточных механизмов эпителиальных морфогенезов в регенеративных процессах Leucosolenia иммуноцитохимическим анализом преобразований систем цитоскелета, задействованных в смене морфологии клеток. Общая динамика регенерации и динамика движения отдельных клеток в регенерации исследовалась с помощью цейтраферной съёмки. Показано, что основной вклад в образование РМ вносят клетки экзопинакодермы и хоанодермы. Роль клеток мезохила в регенерации остается неуточненной. Морфологические преобразования, происходящие при регенерации, укладываются в рамки понятия эпителиальных морфогенезов, в первую очередь, уплощение и растягивание эпителиев. Клеточными основами этого морфогенеза является изменение конфигурации элементов цитоскелета: актиновых филаментов и системы микротрубочек при распластывании Т-образных и кубических эпителиальных клеток в плоские, а также обратный процесс колумнаризации). За отчетный период, по полученным данным было опубликовано 3 статьи в сборнике, индексируемом в системе цитирования РИНЦ. Одна статья принята в печать в международный журнал "Methods in Molecular Biology", Springer Nature и две статьи подготовлены в международные журналы. Также опубликовано 5 тезисов докладов. Полученные в ходе реализации проекта результаты были доложены на 8 научных мероприятиях в 4-х приглашенных лекциях, 2-х устных и 6 постерных докладах, а также вошли в одну магистерскую диссертацию и в выпускную квалификационную работу бакалавра, защищенные в 2020 г.
3 1 января 2021 г.-25 декабря 2021 г. Разработка нового модельного объекта биологии развития, известковой губки Leucosolenia variabilis и исследование клеточных, субклеточных и молекулярно-генетических механизмов восстановительных морфогенезов этой модели
Результаты этапа: Целью настоящего проекта была разработка нового модельного объекта для современной биологии развития – асконоидной известковой губки Leucosolenia variabilis и проведение на этой модели комплексного исследования фундаментальных морфогенетических процессов, лежащих в основе одного из ключевых явлений в онтогенезе животных - регенерации. Актуальность и новизна данного проекта состояла в том, что на основе интегративного изучения губки Leucosolenia, обладающей наиболее просто устроенной анатомической структурой, мировому научному сообществу будет предложен новый модельный объект эволюционной биологии развития. Новым и оригинальным был и подход к решению поставленной задачи: он был основан не только на традиционных для модельных объектов молекулярно-генетических исследованиях. В своей работе мы сочетали анализ транскриптома и экспрессии генов активирующихся при регенерации с экспериментальными, цитологическими и морфологическими методами. Такое комплексное изучение позволило получить более полную биологическую характеристику новой модели и использовать ее для решения широкого круга задач биологии развития. Все поставленные в проекте задачи были выполнены. В ходе выполнения настоящего проекта были получены новые данные мирового уровня. 1. Впервые представлено наиболее полное гистологическое и ультраструктурное описание модельного объекта из типа Porifera, функционирование и взаимодействия клеток у интактных губок. В частности нами впервые для Calcarea описаны септированные межклеточные контакты не только между склероцитами, но и между хоаноцитами. Это позволило нам получить объяснение того, почему морфогенезы при регенерации у Leucosolenia осуществляются по эпителиальному типу. 2. Нами собран и проанализирован транскриптом дефинитивной губки L. variabilis. С его помощью идентифицированы и проанализированы участники ряда сигнальных каскадов, генов зародышевой линии, генов белков межклеточных контактов и генов, связанных с формированием эпителиев. Нами начато исследование дифференциальной экспрессии генов в оскулюмах и дивертикулах – отделах тела губки, имеющих разное осевое положение. С помощью различных методов мы получили подтверждения дифференциальной экспрессии Wnt и TGF-beta в разных отделах тела L. variabilis, а также получили принципиально новые данные об экспрессии ряда транскрипционных факторов в оскулюме. 3. Нами впервые проведены многочисленные и разнообразные эксперименты по различным типам восстановительных процессов на нашей модели: от репаративной регенерации стенки тела и регенерации оскулюмов до восстановления всего тела губки из небольших фрагментов тела и из диссоциированных клеток, а также многочисленные эксперименты по трансплантациям оскулярного кольца. Это позволило нам выявить всю гамму регенеративных способностей и восстановительных морфогенезов нашей модели. Более того, для описания механизмов регенерации Leucosolenia мы впервые использовали комплексный подход, включающий: (1) прижизненное и (2) ультраструктурное описание, (3) описание динамики цитоскелета и межклеточных контактов методами иммуноцитохимии, (4) проведение количественного анализа и определение роли пролиферации клеток и программируемой клеточной гибели в процессе регенерации, (5) исследование молекулярных механизмов, вовлеченных в процессы регенерации (анализ паттернов экспрессии генов сигнальных путей Wnt и TGFb и функциональный анализ работы сигнального пути Wnt). 4. Анализ полученных нами данных по восстановительным морфогенезам у L. variabilis, а также анализ литературных источников позволил нам провести ревизию и классификацию этих морфогенезов у губок, а также провести сравнение с тем, что происходит у губок из других филогенетических групп и у высших многоклеточных животных при подобных морфогенезах. Большая часть полученных данных опубликована в международных журналах, входящих в список цитирования WOS, SCOPUS и РИНЦ. Также результаты были доложены на 8 международных и 9 всероссийских научных мероприятиях.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".