Разработка линейки сорбентов для сбора биомассы цианобактерий в природных условиях и при промышленном выращиванииНИР

Development of sorbents line for the collection of cyanobacterial biomass in the natural environment and the industrial cultivation

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. этап 1
Результаты этапа: За отчетный период было синтезировано 11 новых сорбентов на основе полиэтиленимина и 1 сорбент на основе полилизина. Исследованы физико-химические свойства полученных полимерных материалов, изучено химическое строение методом ИК-спектроскопии. Было проведено исследование поверхности сорбентов методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), позволившее предположить, как характер поверхности сорбентов может повлиять на эффективность иммобилизации клеток микроорганизмов. Анализ динамики и оценка эффективности иммобилизации клеток модельных культур микроводорослей и цианобактерий на поверхности сорбентов показали принципиальное отличие в сорбирующей способности синтезированных полимерных материалов в зависимости от их химического состава. Наиболее эффективным следует считать гидрофильные сорбенты на основе квартенизованного полиэтиленимина и сорбенты серии М33 на основе сшитого полиэтиленимина, содержащие эпихлоргидрин в качестве сшивающего агента. Указанные сорбенты характеризуются высокими значениями сорбционной емкости и скорости иммобилизации клеток и могут быть рекомендованы для быстрого извлечения (в течение суток) клеток из водоемов и биореакторов. Однако длительное культивирование иммобилизованных культур на данных сорбентах нежелательно, так как эти полимерные материалы на основе полиэтиленимина негативно влияет на жизнеспособность фотосинтезирующих клеток. Было показано, что клетки исследованных культур с немного меньшей эффективностью заселяют поверхность сорбентов серии M50, на основе сшитого полиэтиленимина, содержащие диэтиленгликоль диглицидиловый эфир в качестве сшивающего агента, однако сорбенты этого типа не оказывают негативного влияния на жизнеспособность и метаболическую активность прикрепленных клеток и поэтому могут применяться в биореакторах при длительном культивировании фототрофных микроорганизмов. Изучение процесса десорбции иммобилизованных клеток МВ и Цб с поверхности сорбентов показало, что большая часть клеток как прокариотных, так и эукариотных микроорганизмов очень прочно и практически необратимо прикрепляются к поверхности гидрофильных сорбентов на основе ПЭИ.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. этап 2
Результаты этапа: В результате проделанной работы получено 5 серий сорбентов на основе сшитого полилизина, полиэтиленэмина (ПЭИ) и композиции ПЭИ с полилизином (всего 24 сорбента). Показано, что сшитый полилизин не обладает требуемыми свойствами, а введение полилизина в матрицу ПЭИ оказалось нецелесообразным, ввиду ухудшения сорбционных свойств материала по сравнению с соответствующим сшитым ПЭИ. Следует отметить, что добавление полилизина, ввиду его большей стоимости в сравнении с ПЭИ, можно считать не рентабельным. Синтез сорбентов на основе сшитого ПЭИ проводился по двум методикам: термополимеризацией, в этом случае пористость создавалась благодаря пузырькам кипящей воды, и криополимеризации, в условиях замораживания-оттаивания, при этом формирование полимера происходило вокруг микрокристаллов льда. В качестве сшивающих агентов были выбраны эпихлоргидин (ЭХГ) и диэтиленгликоль диглицидиловый эфир (ДЭГ). Было синтезировано 20 сорбентов с различным соотношением ПЭИ и сшивающих агентов. Основная идея выбора двух разных сшивок, заключалась в том, чтобы проверить, как длина линкера влияет на свойства материала: так ЭХГ обеспечивает сшивку достаточно коротким фрагментом, длиной в три атома углерода, а ДЭГ – значительно более длинным – в тринадцать атомов. При этом оба линкера являются подвижными алифатическими фрагментами, что обеспечивает подвижность цепей полимера в конечном материале и способствует его набуханию, делая доступной для связывания клеток максимально возможную поверхность. Все материалы были исследованы методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), была показана их разветвленная пористая структура с порами диаметром от 1 до 50 мкм. Анализ зависимости характера поверхности сорбентов от их химического состава и способа получения, показал, что с уменьшением количества сшивающего агента, количество пор на поверхности снижается. Все сорбенты характеризовались невысокой насыпной плотностью, варьирующей от 0,15 до 0,38 г/мл. Химическое строение полимеров подтверждено методом ИК-спектроскопии и элементным анализом. Теоретически рассчитанные соотношения концентраций углерода и азота, в большинстве случаев, сходились с данными, полученными при элементном анализе сорбентов. Несмотря на то, что значения удельной поверхности сорбентов, полученные методом газовой порозиметрии в приближении BET были не высоки (от16 до 69 м2/г), однако ввиду значительного набухания в водных растворах (увеличение массы до 23 раз при pH 9) сорбенты обладают высокой доступной поверхностью. Показана высокая стабильность сорбентов при температурах до 100 °С и умеренная – до 200 °С. Для оценки возможности вымывания различных веществ были приготовлены водные и спиртовые вытяжки сорбентов. Путем измерения УФ-поглощения, изменения pH, восстановительных примесей (перманганатной окисляемости), определения аминов в водной фракции и органических соединений в спиртовой фракции было показано, что большинство сорбентов безопасны. По результатам исследований кинетики взаимодействия сорбентов с клетками фототрофных микроорганизмов – микроводорослей (МВ) и цианобактерий (Цб), можно заключить, что сорбирующая активность сорбентов зависит от способа сшивки, природы и концентрации сшивающего агента. Установлено, что уменьшение количества сшивающего агента в составе всех изученных серий сорбентов, приводит к увеличению количества прикрепленных клеток. Увеличение сорбционной активности сорбентов при уменьшении степени сшивки, по-видимому, связано с увеличением количества положительно-заряженных аминогрупп, участвующих в электростатическом взаимодействии с отрицательно-заряженной поверхностью МВ и Цб. Следует отметить, что, несмотря на более высокую сорбирующую активность, слабо сшитые полимеры сильно набухают в водных средах, и поэтому работа с ними усложняется. Оптимальными для сбора биомассы МВ и Цб были признаны сорбенты, в которых концентрация сшивающего агента составляла не менее 7,5%. В целом, сорбенты, полученные при полимеризации с ЭХГ, обладали большей эффективностью, в сравнении с ПЭИ, сшитыми с помощью ДЭГ. С целью выявления потенциально токсичных для окружающей среды полимеров, была проведена оценка влияния синтезированных сорбентов на клетки как эукариотных, так и прокариотных организмов. Оценка токсичности, проведенная на позвоночных животных (крысах) показала, что пероральное введение сорбентов не приводило к патологическим изменениям в организме тестируемых животных. Наличие ингибирующего эффекта на жизнедеятельность клеток МВ и фотобактерий была связано с низкой концентрацией сшивающего агента. Самыми безопасными были признаны сорбенты, полученные путем сшивания ПЭИ с помощью ДЭГ концентрацией 60-120%. Указанные сорбенты не влияют на жизнеспособность фототрофных микроорганизмов и фотобактерий, их можно использовать при долговременном культивировании клеток в фотобиореакторах. Все остальные исследованные сорбенты могут быть рекомендованы для быстрой и эффективной сорбции клеток Цб и МВ из водных сред. Следует отметить также, что сорбирующая активность большинства из исследованных полимерных материалов значительно превосходит существующие на сегодняшний день аналоги.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. этап 3
Результаты этапа: Для снижения стоимости сорбентов на основе полиэтиленимина (ПЭИ) и увеличения их биодеградации было предложено введение в состав синтетических полимеров, полученных на предыдущих этапах исследования, различных биоматериалов. За основу был выбран сорбент К-ДЭГ60, показавший высокую сорбционную эффективность в отношении модельных культур микроводорослей (МВ) и цианобактерий (Цб). На 2 этапе исследований также было доказано полное отсутствие токсичности К-ДЭГ60 для клеток фототрофных микроорганизмов, люминесцентных бактерий и позвоночных животных. В качестве биоматериалов было предложено использовать биомассу и клеточно-структурированный материал (КСМ) суспензионных культур клеток растений Ajuga turkestanica, Polyscias fruticosa, талломов водорослей Laminaria saccharina, а также яблочный жмых, которые могут рассматриваться в качестве дешевых, биодеградируемых и нетоксичных наполнителей для полимерных композитных материалов. Культивируемые клетки растений, водоросли являются объектами уже внедренных и разрабатываемых биотехнологий и после получения из них целевого продукта оставшаяся биомасса и КСМ могут быть использованы при создании сорбентов. В результате было синтезировано 15 образцов сорбентов, содержащих различные биоматериалы. Для серии сорбентов с целью повышения адгезии клеток оксигенных фототрофных микроорганизмов (ОФМ) к поверхности полимерным композитов, возобновляемое растительное сырье предварительно обрабатывали бифункциональным реакционноспособным агентом – гексаметилендиизоцианатом. Исследования физико-химических свойств полученных материалов показали, что введение биомассы растительных компонентов в полимерный материал приводило к увеличению набухания. Обработка диизоцианатом наполнителя перед введением в полимерную матрицу приводила к получению материалов, обладающих заметно сниженным набуханием, за исключением материалов на основе яблочного жмыха. Также наблюдалось увеличение набухания сорбентов, содержащих КСМ. Вероятно, подобная закономерность обусловлена наличием пустот внутри клеток, недоступных для ПЭИ, но при этом доступных для молекул воды. Изучение поверхности полимеров методом сканирующей электронной микроскопии показало, что введение растительного материала в виде биомассы в состав сорбентов на основе ПЭИ существенно изменял его структуру. Образцы всех полученных сорбентов с растительным материалом по сравнению с К-ДЭГ60 имели более развитую поверхность пор и каналов как на поверхности, так во внутренней части. Было показано, что все синтезированные материалы не проявляли какого-либо токсического действия на клетки модельных культур МВ в течение долговременного инкубирования. Фотосинтетическая активность сохранялась для иммобилизованных клеток в течение продолжительного времени, что подтверждается данными флуоресцентного анализа. Мы не наблюдали морфологических изменений и нарушения целостности клеток МВ, прикрепленных к поверхности всех изученных сорбентов. На примере сорбента, содержащего биомассу A. turkestanika, было показано отсутствие токсического эффекта на биолюминисцентные бактерии P. phosphoreum. Известно, что существующие на сегодняшний день способы сбора биомассы цианобактерий (Цб) усложняются из-за трудности прогнозирования и подбора оптимальных способов иммобилизации, связанных с морфологическим и физиологическим разнообразием культур Цб. Для комплексной оценки эффективности синтезированных полимеров, предназначенных для сорбции фототрофных микроорганизмов как в природных средах, так и при промышленном культивировании было проведено детальное исследование сорбционной способности носителей, отобранных на 2-ом этапе. В качестве объектов для изучения динамики адгезии были отобраны следующие Цб: трихомы гетероцистосодержащих Цб Nostoc muscorum PCC 6310, Anabaena variabilis ATCC 7120, Anabaena variabilis ATCC 29413 (IV субсекция); трихомы нитчатых, не образущих гетероцисты Цб Arthrospira (Spirulina) maxima, Leptolyngbya sp. 2Dp86E (III субсекция); одноклеточная Цб Synechococcus sp. 1Dp66E-1 (I субсекция). Выбранные модельные штаммы Цб различаются организацией поверхностных структур - слизистых чехлов и капсул. Способность к иммобилизации на сорбентах у Цб с разной морфологической организацией трихомов и поверхностных структур клеток на сорбенте К-ДЭГ60 можно расположить в последовательности: N. muscorum PCC 6310 > A. variabilis ATCC 29413 > A. variabilis ATCC 7120 > Leptolyngbya sp. 2Dp66E F1 > A. maxima > Synechococcus sp 1Dp66E-1. Более эффективная иммобилизация трихомов гетероцистообразующей Цб Nostoc muscorum PCC 6310 на сорбентах, по видимому связана с формированием, по сравнению с другими штаммами трихомных Цб, более мощных, сложно организованных многослойных чехлов. Таким образом при выборе материалов Результаты сравнительной оценки эффективности иммобилизации сорбентов, содержащих биомассу и клеточно-структурированный материал (КСМ) различных наполнителей показали, что полученные полимеры обладали высокой сорбционной емкостью в отношении клеток модельных культур фототрофных микроорганизмов. В течение 48 ч на полученных сорбентах иммобилизовалось от 55 до 90% клеток микроводорослей. Наиболее эффективными были сорбенты, содержащие биомассу и КСМ A. turkestanika и P. fruticosa, наименее активными сорбенты на основе L. saccharina и яблочного жмыха. В случае бионаполнителя L. saccharina наиболее эффективным было введение в состав композитного материала КСМ, а не биомассы данной культуры. Также следует добавить, что введение изоцианатов в состав полимеров с указанным наполнителем также способствовало увеличению эффективности иммобилизации. В случае P. fruticosa композитные материалы с добавлением биомассы были более эффективны по сравнению с КСМ этого растительного наполнителя, хотя отличия в эффективности иммобилизации были незначительными. Эффективность иммобилизации сорбентов, содержащих биомассу и КСМ A. turkestanika практически не отличалась, введение в состав полимера ПЭИ-At50 изоцианатов, также не приводило к увеличению эффективности иммобилизации на протяжении всего эксперимента. Сорбент на основе биомассы яблочного жмыха обладал наименьшей сорбционной активностью в отношении модельных культур Lobosphaera CALU925 и Desmodesmus sp., однако введение изоцианатов в состав указанного биокомпозитов способствовало увеличению эффективности иммобилизации МВ в среднем на 15-18%. Результаты по исследованию биодеградации сорбентов показали, что микроорганизмы деструкторы полученных сорбентов широко распространены в почвах разных биотопов и деградация их при применении in vivo не приведет к накоплению сорбентов в окружающей среде. На основании полученных исследований была проведена разработка рекомендаций по использованию сорбентов в реальном секторе экономики. Сорбенты, полученные в данной работе, могут быть рекомендованы для сбора биомассы Цб и МВ в водоемах в качестве одной из стадий ремедиации для борьбы с «цветением». Также они могут с успехом применяться для рекультивации и сбора биомассы фототрофных микроорганизмов в биотехнологических производствах. Сорбционные материалы рекомендуется запаковывать в проницаемые кассеты из полимерного материала, устойчивого к воздействию окружающей среды, однако в случае сбора биомассы из биореакторов допускается использовать сорбент в виде порошка или губки, набухающей в воде. В этом случае следует применять только механически прочные полимеры, особенно наполненные биовозобновляемым растительным сырьем.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".