ИСТИНА

Внесение одноцепочечных разрывов или «ников» в ДНК является необходимым этапом многих клеточных процессов, таких как репликация и репарация ДНК. Сайт-специфические эндонуклеазы, вносящие разрыв в определенное положение только одной из цепей ДНК, получили название никующих эндонуклеаз (НЭ) (от англ. nicking endonucleases). НЭ часто находятся в комплексе с другими белками клетки, образуя активные белковые ассоциаты. Не так давно было обнаружено, что НЭ также могут входить в состав бактериальных систем Р-М. Один из примеров таких белков – НЭ BspD6I (Nt.BspD6I), являющаяся большой субъединицей ЭР BspD6I (R.BspD6I) и обнаруженная в природном термофильном штамме Bacillus species D6. Примечательно, что вторая (малая) субъединица R.BspD6I проявляет каталитическую активность только в присутствии Nt.BspD6I. Такие гетеродимерные ЭР типа II являются относительно новым классом ферментов, и механизм их действия до конца не изучен. За два десятилетия с момента открытия подобные ферменты нашли широкое применение в различных областях молекулярной биологии, поэтому детальное знание особенностей их функционирования является актуальной задачей. Фундаментальной научной проблемой, на решение которой направлен данный проект, является разработка стратегии изучения свойств НЭ, входящих в состав гетеродимерных ЭР, на примере Nt.BspD6I.

Introducing the single-stranded breaks into DNA is a necessary step of many cellular processes such as DNA replication and reparation. Site-specific endonucleases that hydrolyze only one DNA strand are named nicking endonucleases (NE). NE can form active complexes with other cellular proteins. NE can also be the part of bacterial restriction-modification systems. One example of such proteins is Nt.BspD6I that is also the large subunit of R.BspD6I. The second (small) subunit of R.BspD6I is catalytically active only in the presence of Nt.BspD6I. The mechanism of action of this kind of restriction endonucleases is not elucidated yet. The nicking endonucleases have a wide area of application therefore the studying of the mechanism of their action is a problem of immediate interest. The fundamental task of the project is developing the strategy to investigate nicking endonucleases properties using Nt.BspD6I as a model.

Выделение и очистка НЭ BspD6I и малой субъединицы (МС) BspD6I в количествах, необходимых для будущих экспериментов, и тестирование активности полученных препаратов. Определение величины изгиба ДНК в комплексе с НЭ BspD6I с использованием метода «круговых» перестановок. Корректировка с учетом полученных данных существующей гипотетической модели комплекса НЭ BspD6I с ДНК. Оценка констант диссоциации комплексов НЭ BspD6I с ДНК-дуплексами разной длины, но содержащими только 4 п.н. после участка узнавания. Оценка вклада ДНК-узнающего и каталитического доменов НЭ BspD6I в формирование стабильного ДНК-белкового комплекса. Дизайн и синтез немодифицированных негидролизуемых аналогов субстрата, которые способны блокировать активность НЭ BspD6I при 25ºС. Проверка возможности восстановления активности НЭ BspD6I при повышении температуры.

Nt.BspD6I является прокариотическим мультидоменным белком, входящим в систему Р-М. Еще одним прокариотическим белком с такими свойствами является ДНК-метилтрансфераза SsoII (M.SsoII) из системы Р-М SsoII, свойства которой были подробно изучены ранее в нашей лаборатории (А.Ю. Рязанова и др. 2010). Ранее на примере метилтрансферазы SsoII были изучены кинетика взаимодействия этого фермента с различными фрагментами ДНК, а также конформационные перестройки при диссоциации образовавшегося ДНК-белкового комплекса методом «остановленного потока». Полученные данные позволили предложить модель функционирования M.SsoII в клетке. С учетом полученных нами экспериментальных данных о величине изгиба ДНК была построена модель комплекса M.SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим межгенную область системы Р-М SsoII. Л.Ю. Канажевская (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН) является специалистом в области изучения методом «остановленного потока» взаимодействия с ДНК АР-эндонуклеазы 1, которая также как и Nt.BspD6I, вносит только один разрыв в ДНК. Полученные ею данные позволили существенно детализировать молекулярно-кинетический механизм процесса, приводящего к гидролизу 5'-фосфодиэфирной связи апиримидинового/апуринового сайта АР-эндонуклеазой 1 (L.Y. Kanazhevskaya et al. Biochemistry, 2012, 51, 1306-1321). Также у нашей научной группы имеется большой опыт по белок-белковому кросслинкингу и ковалентному связыванию белков с ДНК, разработаны методики получения и выделения функционально-активных ДНК-белковых конъюгатов, с помощью которых можно изучать возможные конформационные перестройки фермента (A.Yu. Ryazanova et al. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2011, 30, 632–650; M. Monakhova et al. J. Chromatogr. A. 2015, 1389, 19-27). На протяжении последних лет в нашей научной группе также интенсивно изучается Nt.BspD6I, входящая в состав гетеродимерной R.BspD6I.

Проанализировано сродство НЭ BspD6I к 13- и 15-звенным ДНК-дуплексам, содержащим только 4 пары нуклеотидов после участка узнавания. В таких дуплексах отсутствует гидролизуемая ферментом фосфодиэфирная связь. Мы предполагаем, что на первой стадии связывание с ДНК происходит только при участии ДНК-узнающего домена НЭ BspD6I (без участия каталитического домена). Подобранные 13- и 15-звенные ДНК-дуплексы были протестированы в качестве ингибиторов активности НЭ BspD6I. Показано, что избыток таких дуплексов полностью блокирует гидролиз целевого субстрата под действием НЭ BspD6I при 25°С. Повышение температуры реакционной смеси до 45°градусов С приводит к диссоциации дуплексов-ингибиторов, высвобождению фермента и восстановлению его активности. Проведено экспериментальное измерение величины изгиба ДНК в комплексе с НЭ BspD6I, а также в комплексе с ЭР BspD6I. Установлено, что НЭ BspD6I индуцирует изгиб ДНК при связывании с субстратом. Угол изгиба ДНК составляет 66 ± 4°. Наличие малой субъединицы при этом не влияет на величину угла изгиба ДНК, индуцируемого НЭ BspD6I. Методом кросслинкинга показано, что один или несколько из четырех остатков цистеина НЭ BspD6I сближены с ДНК. Для этого в 26-звенный ДНК-дуплекс в различные позиции относительно участка узнавания вводили пиридилдитио-группу в 2’-положение нуклеотидов. Затем проводили комплексообразование с НЭ BspD6I, продукты реакции анализировали методом гель-электрофореза.